Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Een Tripeptide-gestabiliseerde Nanoemulsion van oliezuur

Published: February 27, 2019 doi: 10.3791/59034
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 4,5,6, 1,2,3
1Department of Chemistry, Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women's Health Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research, Western Connecticut Health Network

Summary

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode om een nanoemulsion voor een oliezuurgehalte acids-platinum(II) conjugate gestabiliseerd met een lysine-tyrosine-fenylalanine (KYF)-tripeptide synthetiseren. De nanoemulsion vormen onder zachte synthetische voorwaarden via zelf-assemblage van de KYF en de geconjugeerde.

Abstract

Beschrijven we een methode voor de productie van een nanoemulsion samengesteld uit een oliezuurgehalte acids-Pt(II) kern en een lysine-tyrosine-fenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). De KYF-Pt-NE Pt(II) kapselt op 10 pm %, heeft een diameter van 107 ± 27 nm en een negatieve lading van de oppervlakte. De KYF-Pt-NE is stabiel in water en in serum, en biologisch actief is. De vervoeging van een fluorophore te KYF kunt de synthese van een fluorescerende nanoemulsion die geschikt is voor biologische beeldvorming. De synthese van de nanoemulsion wordt uitgevoerd in een waterige omgeving, en de vormen van de KYF-Pt-NE via zelf-assemblage van een korte KYF peptide en een conjugaat oliezuurgehalte acids-platinum(II). De zelf-assemblage proces hangt af van de temperatuur van de oplossing, de molaire verhouding van de substraten, en het debiet van de toevoeging van het substraat. Cruciale stappen omvatten handhaven van de optimale roeren tarief tijdens de synthese toelaat voldoende tijd voor zelf-assemblage en de nanoemulsion vooraf geleidelijk te concentreren in een centrifugaal concentrator.

Introduction

In de afgelopen jaren is er een groeiende interesse in de engineering van nanodeeltjes voor biomedische toepassingen zoals drug delivery en bioimaging1,,2,,3,4. De multifunctionaliteit van de nanoparticle gebaseerde systemen vereist vaak meerdere componenten binnen een formulering opnemen. De bouwstenen die zijn gebaseerd op lipiden of polymeren vaak verschillen in hun fysisch-chemische eigenschappen alsmede hun biocompatibiliteit en biologische afbreekbaarheid, die uiteindelijk gevolgen voor de functie van de nanostructuur1, hebben kan 5,6. Biologisch afgeleide materialen, zoals eiwitten en peptiden, hebben lang erkend als veelbelovende onderdelen van multifunctionele nanostructuren vanwege hun volgorde flexibiliteit7,8. Peptiden zelf monteren in zeer geordende supramoleculaire platforms vormen spiraalvormige ribbons9,10, vezelig steigers11,12, en nog veel meer, dus de weg effent naar gebouw Biomolecuul gebaseerde hybride nanostructuren met behulp van een bottom-up aanpak13.

Peptiden werden onderzocht voor toepassingen in geneeskunde en biotechnologie, met name voor de antikanker therapie14 en vaatziekten15 alsook wat betreft de antibiotica ontwikkeling16,17, metabole aandoeningen18en19van de infecties. Er zijn meer dan honderd van kleine-peptide therapeutics klinische proeven20ondergaan. Peptiden zijn eenvoudig aan te passen en snel te synthetiseren tegen lage kosten. Daarnaast zijn ze biologisch afbreekbaar, die sterk vergemakkelijkt hun biologische en farmaceutische toepassingen21,22. Het gebruik van peptiden als structurele componenten omvat de engineering van responsieve, peptide gebaseerde nanodeeltjes en hydrogel depots voor gecontroleerde afgifte23,24,25,26 , 27, peptide gebaseerde biosensoren28,29,30,31of bio-elektronische apparaten32,33,34. Nog belangrijker is, zelfs korte peptides met twee of drie aminozuur residuen die fenylalanine bevatten bleken te begeleiden de zelf-assemblage processen35,36,,37 en maken van gestabiliseerde emulsies38 .

Platina gebaseerde drugs, vanwege hun hoge doeltreffendheid, worden gebruikt in vele kanker behandeling regimes, zowel alleen als in combinatie met andere agentia39,40. Platina verbindingen veroorzaken schade van DNA door de vorming van kruisverbindingen van monoadducts en intrastrand of interstrand. De Pt-DNA laesies worden herkend door de mobiele machine en, als niet gerepareerd, leiden tot cellulaire apoptosis. Het belangrijkste mechanisme, door die Pt(II) draagt bij aan de dood van de cel van de kanker, is de remming van de DNA transcriptie41,42. Echter worden de voordelen van platinum therapie verminderd door de systemische toxiciteit van Pt(II) die als trigger fungeert van ernstige bijwerkingen. Dit leidt tot lagere klinische doseren van Pt(II)43, wat vaak resulteert in sub therapeutische concentraties van platina bereiken van het DNA. Dientengevolge, bijdraagt de DNA-reparatie die volgt aan de overleving van de cel van de kanker en het verwerven van Pt(II) weerstand. De platina chemo-resistentie is een groot probleem in antikanker therapie en de belangrijkste oorzaak van44,45van de mislukking van de behandeling.

We hebben een stabiele nanosystem die de Pt(II) agent kapselt om te zorgen voor een beschermend effect in de systemische circulatie en vermindert de bijwerkingen Pt II-geïnduceerde ontwikkeld. Het systeem is gebaseerd op een oliezuurgehalte acids-Pt(II) kern gestabiliseerd met een KYF-tripeptide te vormen van een nanoemulsion (KYF-Pt-NE)-46. De bouwstenen van KYF-Pt-NE, de aminozuren van de tripeptide evenals de oliezuur, hebben de status van de over het algemeen erkend als Safe (GRAS) met Food and Drug Administration (FDA). De KYF-Pt-NE is bereid met behulp van een nanoprecipitation methode47. Kortom, is de geconjugeerde oliezuurgehalte acids-Pt(II) opgelost in een organisch oplosmiddel en vervolgens ontkleuring toegevoegd aan een waterige oplossing van de KYF (Figuur 1) bij 37 ° C. De oplossing wordt bewogen gedurende enkele uren om zelf-assemblage van de KYF-Pt-NE. De nanoemulsion is geconcentreerd in 10 kDa centrifugaal concentrators en drie keer gewassen met water. De chemische modificatie van de KYF met een fluorophore kunt de synthese van fluorescerende FITC-KYF-Pt-NE geschikt voor biomedische beeldbewerking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. synthese van de geconjugeerde oliezuurgehalte Acids–Platinum(II)

  1. Activering van cisplatine
    1. Schorten 50 mg (0.167 mmol) cisplatine in 4 mL water (bijvoorbeeld nanopure) bij 60 ° C.
    2. Voeg dropwise 55.2 mg (0.325 mmol) van AgNO3 in 0,5 mL water aan de oplossing van cisplatine en roer de reactie voor ten minste 2 uur bij 60 ° C. Het witte neerslag van AgCl zal vormen die de voortgang van de reactie aangeeft.
    3. Om te bepalen als de reactie van de activering is voltooid, het uitvoeren van de test met 10% HCl op de aanwezigheid van gratis Ag+ -ion in oplossing. De test moet negatieve (geen extra AgCl neerslag moet uitmaken).
    4. Centrifugeer het reactiemengsel bij 3220 x g gedurende 10 minuten en verwijder het witte neerslag van AgCl.
    5. De bovendrijvende vloeistof verzamelen en filteren via een 0,2 mm spuit filter. Test het supernatant op de aanwezigheid van platina door toepassing van 2-3 druppels van de oplossing via de Pipet van Pasteur op SnCl2 kristallen. De test is positief als de kleur van de coördinaat complex van tin met platina donker geel/oranje is.
    6. Gebruik het supernatant met geactiveerde Pt(II) voor de tweede stap.
  2. Reactie van oliezuur met geactiveerde Pt(II)
    1. Schorten 94.2 mg oliezuur (0.333 mmol) in 3 mL water bij 60 ° C.
    2. Toevoegen van 13,3 mg (0.333 mmol) van NaOH in 1 mL water en meng met de oplossing van geactiveerde Pt(II) uit stap 1.1
    3. Roer de reactie voor 2 h bij 60 ° C en daarna op kamertemperatuur 's nachts. Het ruwe product is een olieachtige bruin/geel neerslag.
    4. Centrifugeer het reactiemengsel bij 3220 x g gedurende 10 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie. Droog het ruwe product bij 25 ° C met een rotatieverdamper. Het zuiveren van het product door meerdere wasbeurten met acetonitril. De uiteindelijke kleur van pure oliezuurgehalte acids–Pt(II) geconjugeerde is lichtgeel.

2. synthese van KYF-Pt-NE, en de FITC-label Nanoemulsion FITC-KYF-Pt-NE

  1. Synthese van de KYF-tripeptide en de fluorescently geëtiketteerde tripeptide FITC-KYF
    1. De KYF met behulp van standaard solid-state peptide chemistry synthetiseren. Gebruik de volgende standaard koppeling voorwaarden om te koppelen van elk aminozuur: Wang hars (2.19 mmol), het aminozuur Fmoc beschermd (4.38 mmol), 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium Zilvertetrafluorboraat (TBTU) (4.38 mmol) en diisopropylethylamine (DIPEA) (8.76 mmol). Los van de aminozuren met TBTU in dimethylformamide (DMF) en DIPEA.
    2. Geniet van 5,7 g Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol hars (0.382 milli-equivalent/g) in 25 mL DMF voor 1 h voorafgaand aan gebruik.
    3. DEPROTECT de amine-groep van het aminozuur L-fenylalanine met 15 mL 20% piperidine/DMF oplossing voor 5 min, ontdoen van het oplosmiddel en herhaal het wassen met 20 min cyclus.
    4. Wassen van de hars voor 1 min met de volgende oplosmiddelen: DMF, isopropyl alcohol (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. Gooi het oplosmiddel na elke wasbeurt.
    5. Voer de Kaiser-test om te bepalen van de aanwezigheid van vrije NH2 groep op de hars uit (Zie substeps) en als positief (het zaad van de hars is paars), toevoegen het aminozuur Fmoc-L-tyrosine en de koppeling uit te voeren 's nachts.
      1. Bereiden Kaiser testoplossingen in afzonderlijke flessen.
      2. Los 5 g ninhydrine in 100 mL ethanol.
      3. Los 80 g van fenol in 20 mL ethanol.
      4. Meng 2 mL van 0,001 M waterige oplossing van kaliumcyanide met
        98 milliliters pyridine.
      5. Voeg 2-3 druppels van elk Kaiser test oplossingen voor de monster- en warmteproductie in kokend water gedurende 5 minuten.
    6. Na succesvolle koppeling van tweede aminozuur, het uitvoeren van de Kaiser-test en als negatieve met deprotection protocol (stappen 2.1.3 aan 2.1.5 doorgaat). Herhaal het proces met het aminozuur fenylalanine-Fmoc.
      1. Wassen op de koppeling van alle aminozuren, de hars voor 1 min met 5 mL DMF, IPA, DMF, methanol, dichloormethaan en diethylether, na elke wasbeurt negeren het oplosmiddel. Sla de hars voor verdere verwerking.
      2. Gebruik de helft van de hars voor de volgende stappen (2.1.7-2.1.9) te wijzigen van de peptide met FITC. Volg de procedure vanaf 2.1.10 ongewijzigde KYF tripeptide om, te verkrijgen.
    7. Het wijzigen van het N-terminaal aminozuur van de KYF tot KYF-N3 met 6-azidohexanoic zuur. Te dien einde, meng 1 g (0.382 mmol) van KYF Wang hars en 120.1 mg (0.764 mmol) 6-azidohexanoic zuur met 245.2 mg (0.764 mmol) van TBTU en 197.1 mg (1.528 mmol) DIPEA in 30 mL DMF. Roer de reactie 's nachts bij kamertemperatuur.
    8. De KYF-FITC verkrijgen bij de synthese van de KYF-N3 met propargyl fluoresceïne via een klik op reactie. Te dien einde, meng 253 mg (0.097 mmol) van de KYF-N3 Wang hars met 3.78 mg (0.019 mmol) CuI solide, 71.9 mg (0.193 mmol) propargyl fluoresceïne en 2.24 mg (0.017 mmol) van DIPEA. De reactie moet wijzigen kleur van groen naar bruin.
    9. Na 24u, door het hars voor 1 min afwisselend met 5 mL DMF en IPA vijf keer, methanol en water driemaal, DMF en driemaal, water en met dichloormethaan en diethylether driemaal te wassen. Gooi het oplosmiddel na elke wasbeurt.
    10. Klieven van de KYF-FITC of KYF peptide uit de hars met een oplossing van trifluorazijnzuur (TFA) / triisopropylsilane (TIPS) /H2O op de verhouding van de 95/2.5/2.5 meer dan 3 uur.
    11. Het neerslaan van de ruwe peptide in een koude diethylether, wassen driemaal met koude ether, en vervolgens droog onder het vacuüm.
  2. Synthese van FITC-KYF-gestabiliseerde nanoemulsion met Pt(II) (FITC-KYF-Pt-NE) en KYF-Pt-NE
    1. Los 10 mg (0.0126 mmol) van oliezuurgehalte acids–Pt(II) geconjugeerde in 1,5 mL isopropanol en breng dit in een 5 mL spuit.
    2. Plaats de injectiespuit met oliezuurgehalte acids–Pt(II) geconjugeerde in een spuitpomp en de stroom ingesteld op 0,1 mL/min.
    3. Om de FITC-KYF-Pt-NE synthetiseren, los 1 mg (0.00105 mmol) van FITC-KYF en 1 mg (0.00219 mmol) van KYF (de molaire verhouding 1:2 van de FITC-KYF:KYF) in 20 mL water en aanpassen van de temperatuur van de oplossing tot 37 ° C. Betrekking hebben op de muren van de container met aluminiumfolie om te voorkomen dat photobleaching van de FITC-fluorophore. Om de KYF-Pt-NE synthetiseren, 2 mg (0.0044 mmol) los van KYF tripeptide in 20 mL water en aanpassen van de temperatuur van de oplossing tot 37 ° C.
    4. De geconjugeerde oliezuurgehalte acids–Pt(II) ontkleuring aan de oplossing van de FITC-KYF/KYF of KYF-tripeptide toevoegen. Voer deze stap onder de motorkap.
    5. Roer de oplossing om 's nachts bij kamertemperatuur kunnen organische oplosmiddelen verdampen en kunnen de zelf-assemblage van FITC-KYF-Pt-NE of KYF-Pt-NE.
    6. De FITC-KYF-Pt-NE of KYF-Pt-NE concentreren in een centrifugaal concentrator (10k MWCO), en wassen driemaal met 4 mL van het nanopure water.
    7. Opslaan van de waterige oplossingen van KYF-Pt-NE en FITC-KYF-Pt-NE bij 4 ° C.
    8. Analyseren voor platina inhoud met behulp van atomaire absorptie spectroscopie (AAS), na de fabrikant gids48.
      1. Platina normen in 10% HCl-oplossing te bereiden voor de ijkcurve (effectieve bereik voor AAS ligt tussen 100 tot 1.200 ppb (deeltjes per miljard)).
      2. Los 50 µL van KYF-Pt-NE oplossing van stap 2.2 in 100 µL van aqua regia (een mengsel van 3:1 van geconcentreerd zoutzuur en salpeterzuur) en laat op kamertemperatuur 's nachts. Voeg 850 µL van water tot een volume van het uiteindelijke monster van 1 mL. Analyseren van het monster met behulp van AAS. De definitieve zuurconcentratie moeten 10% in alle geanalyseerde monsters.
      3. Noteer de lezing van Pt concentratie in ppb en berekenen van de uiteindelijke platina inhoud in de steekproef (account voor monsterverdunning en eerste volume van nanoemulsion).

3. confocal beeldvorming van de cellulaire opname van FITC-KYF-Pt-NE

  1. 6 cellijnen van eierstokkanker (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G en ES2), zaad in 4 goed-kamer confocal gerechten op de dichtheid van 4.7 x 104 cellen per kamer, en vooraf cultuur 's nachts bij 37 ° C.
  2. Na 24 h, het wassen van de cellen driemaal met fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) en incubeer met FITC-KYF-Pt-NE in cel kweekmedium (zie stap 6.1 voor cel lijn specifieke details) gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
  3. Na incubatie, verwijder het medium en wassen van de cellen drie keer met PBS.
  4. Herstellen van de cellen met de koude methanol gedurende 5 minuten bij-20 ° C en was driemaal met 1 mL PBS.
  5. Permeabilize van de cellen met 1 mL 0,1% Triton-X gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en wassen drie keer met 1 mL PBS.
  6. Incubeer de cellen gedurende 90 minuten met LAMP1 antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 647 (1 mL) bij 1:50 verdunning in PBS bij kamertemperatuur. Vervolgens wassen de cellen 3 keer met PBS.
  7. Verdun DAPI stockoplossing (1 mg/mL) tot 1 mg/mL in PBS. Vervolgens 1 mL van de verdunde oplossing toevoegen aan elke kamer en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Wassen van de cellen 3 keer met PBS.
  8. Mount coverslips op een dia met behulp van montage medium.
  9. Afbeelding van de cellen met behulp van levende cellen confocal microscoop bij excitatie golflengte van 405 nm, 488 nm en 633 nm. Stel de detectie-parameters als volgt: laser vermogen van 0,2% en niet meer dan 1%, Pinole 1 luchtige eenheid, krijgen meester 650-750, digitaal offset 0.
  10. Afbeelding openen in beeldbewerkingssoftware. Onder de afbeelding van de weergegeven, selecteert u afbeeldingen en selecteer Invoegen schaal Bar, de bar van de schaal naar de afbeelding invoegen.

4. drug Release Studies

  1. De drug release studies in PBS verrichten. De pH-waarden van drie PBS buffers 7.4, 6,8 en 5.0 respectievelijk aanpassen.
  2. Verdun 5 μL van KYF-Pt-NE in 180 μL van de juiste pH PBS buffer, transfer naar 3,5 kDa MWCO mini dialyse cup en Incubeer bij 37 ° C in PBS.
  3. Buffer te verwijderen van elk drie mini dialyse buizen op 2, 4, 6, 24, 48 en 140 h en meten van de platina concentraties door AAS. Alle monsters volgens stap 2.2.8 bereiden maar het uiteindelijke volume van het monster tot 500 µL.

5. cel kweekmethoden

  1. Cultuur cel lijnen A2780 CP70 SKOV-3, OV-90, TOV - 21G, ES-2 cel kweekmedium (DMEM) met 10% (A2780, CP70 SKOV-3, ES-2) of met 15% (TOV - 21G, OV-90) foetale runderserum (FBS), aangevuld met L-Glutamine en penicilline/streptomycine. Groeien alle cellen in een 5% CO2, water verzadigde atmosfeer bij 37 ° C.
  2. Zaad 3 x 105 cellen in elke 96-wells-plaat en pre cultuur 's nachts voor in vitro incubatie experimenten. De KYF-Pt-NE, cisplatine en carboplatin oplossingen in water voor te bereiden. Aanpassen van de concentratie van Pt(II) in KYF-Pt-NE aan de concentratie van carboplatin en cisplatine voor elke regel van de cel. Incubeer gedurende 72 uur bij 37 ° C.
  3. Na incubatie, evalueren van de cellulaire levensvatbaarheid met behulp van een colorimetrische bepaling (de bepaling van MTT celproliferatie). Kort, medium verwijderen en toevoegen van 110 μL van 10% MTT op middellange tot elk goed en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C. Dan 100 μl wasmiddel toevoegen aan elk putje en incubeer gedurende 5 uur bij 37 ° C.
  4. Controleer de extinctie bij 570 nm met behulp van-afleesapparaat. Analyseer de resultaten met behulp van statistische analyse met Z- en P-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vertegenwoordiger TEM afbeelding van KYF-Pt-NE opgesteld op basis van dit protocol wordt getoond in figuur 2A. De KYF-Pt-NEs zijn bolvormig in morfologie, goed verspreid, en uniform in grootte. De kerndiameter van de KYF-Pt-NEs, gemeten vanuit drie TEM beelden met een minimum van 200 metingen gedaan, is 107 ± 27 nm. De hydrodynamische diameter van KYF-Pt-NE, geanalyseerd met behulp van dynamische lichte spectroscopie (DLS), bleek te zijn 240 nm met een polydispersiteit index van 0.156. Het potentieel van de Zeta van KYF-Pt-NE in water voor drie onafhankelijke synthese met de gemiddelde waarde van-60.1 werd bepaald mV. De hoge omvang van de potentiële geeft goede colloïdale stabiliteit van de formulering en de negatieve lading van de oppervlakte wordt toegeschreven aan geïoniseerde COO- oppervlak groepen van oliezuur zuren. De elektrisch punt van KYF is 8.59, en daarom is het positief geladen bij een neutrale pH.

Het vermogen van de nanoemulsions te steken van het cellulaire membraan werd onderzocht met behulp van de cellijnen fluorescently geëtiketteerde FITC-KYF-Pt-NE en ovariële kanker. In figuur 2Bzijn de resultaten gepresenteerd. Het kan duidelijk worden gezien dat de FITC-KYF-Pt-NEs (groen) binnen het cytosol worden gedistribueerd, maar nog niet gekoppeld aan lysosomen (rood waren). Dit resultaat toont aan dat KYF-Pt-NEs cellen invoeren en als intracellulaire drug leverende voertuig dienen kunnen.

De stabiliteit van KYF-Pt-NEs en FITC-KYF-Pt-NEs evalueerden met Distributielijsten. De diameter van de nanoemulsions in water gedurende enkele maanden werd gemeten en de resultaten worden gepresenteerd in Figuur 3. De hydrodynamische diameter van beide formuleringen langzaam verhoogd gedurende 4 maanden in opslag, 320 nm (KYF-Pt-NE) en 240 nm (FITC-KYF-Pt-NE), maar de nanoschaal afmetingen werden bewaard. Dit resultaat wijst erop dat de KYF-tripeptide nanoemulsions over langere tijd effectief stabiliseert.

De Pt(II) inkapseling efficiëntie en de vrijlating van de nanoemulsion werden gemeten met de AAS. De concentratie van de Pt(II) in KYF-Pt-NE opgericht als 10 wt.%. De Pt(II) die vrijkomt bij KYF-Pt-NE met een pH van 7,4 (fysiologische), 6,8 (tumor het interstitium)49en 5.0 (endosomal)50 wordt gepresenteerd in figuur 4A. De Pt(II)-release is het langzaamst met een pH van 7,4 met slechts 20,8% van Pt(II) die zijn vrijgegeven na 4 uur, terwijl met een pH van 6,8 en 5.0 de release 32,8% van 47,5%, respectievelijk was. Dezelfde trend voortgezet na 24 h en na 6 dagen. Dit resultaat geeft aan dat Pt(II) release van KYF-Pt-NE pH afhankelijk, en het kan worden vertraagd in de systemische circulatie en versneld zodra de nanoemulsions in de tumor translocate.

De biologische activiteit van de KYF-Pt-NE werd opgericht in vitro met behulp van de dezelfde eierstokkanker cellijnen zoals in de beeldvorming studies. De cellen werden geïncubeerd met KYF-Pt-NE voor 72 uur, KYF-Pt-NE concentratie overeenstemt met IC50 voor elke regel van de cel. De levensvatbaarheid werd beoordeeld met behulp van de MTT-test en de resultaten werden vergeleken met alleen cellen, KYF-NE oliezuurgehalte acids-Pt(II) geconjugeerde, carboplatin en cisplatine. De resultaten van biologische activiteit van KYF-Pt-NE zijn weergegeven in figuur 4B. De KYF-Pt-NE verminderde de levensvatbaarheid van isogene cellijnen A2780 (Pt gevoelig) en CP70 (Pt resistente) met 44,3% en 46,2% respectievelijk. Carboplatin, de klinisch relevante analoog, daalde de levensvatbaarheid van 18,5% (A2780) en 9,6% (CP70) alleen. Dezelfde trend van groter KYF-Pt-NE effect op celdood werd waargenomen in andere cellijnen ook. De levensvatbaarheid van Pt(II) gevoelige TOV - 21G cellen was met 55,9% verlaagd na incubatie met KYF-Pt-NE, terwijl carboplatin resulteerde in het verlagen van de levensvatbaarheid slechts 16,5 procent. In OV-90 cellen met tussenliggende Pt(II) weerstand, werd de levensvatbaarheid verlaagd met 55,3% (KYF-Pt-NE) en 23,9% (carboplatin). De twee cellijnen van resistente kanker, ES-2 en SKOV-3, andere daling in levensvatbaarheid 45.9% en 54,3%, respectievelijk, voor KYF-Pt-NE, en 10,3% (ES-2) en 16,8% (SKOV-3) voor carboplatin.

De biologische activiteit van KYF-Pt-NE versus cisplatine werd ook vergeleken. Cisplatine is de Pt II gebaseerde agent van de eerste generatie zijn die niet langer in de kliniek als gevolg van zijn toxiciteit profiel51is favoriet. In twee cellijnen, SKOV-3 en TOV - 21G, was de vermindering van de levensvatbaarheid groter met 15% en 40%, respectievelijk, voor KYF-Pt-NE dan voor cisplatine. In de resterende cellijnen, de activiteit van KYF-Pt-NE vergelijkbaar was met cisplatine (A2780, CP70, OV-90), of iets lager (ES-2). De geconjugeerde oliezuurgehalte acids-Pt(II) bleek ook biologisch actief te zijn. KYF-Pt-NE toonde echter hogere reductie in levensvatbaarheid dan de geconjugeerde in meerderheid van de cellijnen getest, met vermelding van de betekenis van nanoformulation activiteit van de Pt(II).

De biologische toepassingen van nanoparticulate systemen vereisen stabiliteit in biologisch relevante media, dus de stabiliteit van KYF-Pt-NE werd geëvalueerd in 20% foetale runderserum (FBS) en de resultaten worden gepresenteerd in figuur 4C. Wij ontdekt geen bewijs van KYF-Pt-NE opsonization in serum na één dag van incubatie.

Figure 1
Figuur 1. De componenten van de nanoemulsions (boven) en het schema van de voorbereiding van de nanoemulsion (onder). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. TEM beeld van KYF-Pt-NE (A) en beelden van de confocal microscoop van ICT wordt FITC-KYF-Pt-NE (groen) door ovariële kankercellen (kernen zijn blauw en lysosomen zijn rood) (B). Schaal bars zijn 10 μm. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Bioconjugate chemie 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. Stabiliteit van de KYF-Pt-NE en FITC-KYF-Pt-NE in water. Elk punt vertegenwoordigt het gemiddelde en de standaarddeviatie van N = 3 en p <0,005. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Bioconjugate chemie 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4. KYF-Pt-NE stabiliteit en de biologische activiteit. (A) Pt(II) release van KYF-Pt-NE in PBS buffer op verschillende pHs (PBS, 37 ° C). Cellulaire levensvatbaarheid van verschillende eierstokkanker cellijnen na 72 uur incubatie met KYF-Pt-NE (B). Elke kolom vertegenwoordigt het gemiddelde en de standaarddeviatie van N = 3 en p <0,005. De concentraties zijn constant in elke cel-regel en zijn als volgt: 4.92 mM (A2780), 8.80 mM (CP70), 2,46 mM (TOV - 21G), 9.84 mM (SKOV3), 7,38 mM (ES-2), 19.7 mM (OV-90). De concentratie van KYF-Pt-NE en oliezuurgehalte acids–Pt(II) geconjugeerde werd aangepast met betrekking tot de inhoud van de Pt(II) gemeten door AAS. Afkortingen: "Carbpt" – carboplatin; "KYF-NE" – KYF tripeptide-gecoate nanoemulsion; "KYF-Pt-NE" – KYF tripeptide-gecoate nanoemulsion met Pt(II); Cispt – cisplatine; PT-oliezuurgehalte – oliezuurgehalte acids–Pt(II) geconjugeerde. (C) KYF-Pt-NE stabiliteit in serum. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Bioconjugate chemie 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritische stappen in de nanoemulsion synthese omvatten aanpassing van de molaire verhouding van de substraten, temperatuur en debiet tarief controle houden tijdens oliezuurgehalte acids–Pt(II) toevoeging bieden voldoende tijd voor zelf-assemblage en zuiveren met behulp van het product een Centrifugaal concentrator kolom. Deze parameters invloed op de grootte en morfologie van de KYF-Pt-NE; het is dus belangrijk de juiste molaire verhouding te handhaven en de synthetische voorwaarden correct aan te passen.

De verhouding van de substraten tijdens de nanoemulsion synthese (stap 3) is van cruciaal belang voor de zelf-assemblage proces en bepaalt de uiteindelijke grootte van het product. De KYF oliezuurgehalte acid-Pt(II) molaire verhouding is 1:3, en de optimale concentratie van de KYF tripepide in water is 0,2 mM. Daarnaast heeft de organisch oplosmiddel gebruikt te ontbinden de oliezuurgehalte acid-Pt(II) geconjugeerde in stap 3.1 mengbaar met water, compatibel met de filtratie-systeem, en verdampingsemissies gemakkelijk bij kamertemperatuur.

Een van de kritische stappen is de dropwise toevoeging van de geconjugeerde oliezuurgehalte acid-Pt(II) aan de oplossing van KYF (stap 3.4). De stroom mag niet langzamer dan 0,1 mL/min en niet sneller dan 0,2 mL/min, omdat een sub-optimale snelheid kan het neerslaan van de nanoemulsion veroorzaken. De geconjugeerde oliezuurgehalte acids–Pt(II) moet ook worden toegevoegd aan de oplossing van de KYF bij 37 ° C terwijl het mengsel roeren op een bord roer bij 600 omwentelingen per minuut. Zodra alle van de oliezuurgehalte acid-Pt(II) istoegevoegd; moet de oplossing worden bewaard bij kamertemperatuur en de opzwepende snelheid teruggebracht tot 150 rpm. Stap 3.5 moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. De optimale tijd voor de zelf-assemblage van de KYF-Pt-NE (stap 3.5) is 24 uur.

Er is een risico dat het product precipiteren kan tijdens de nanoemulsion is vooraf wordt geconcentreerd. Daarom is het aangeraden dat de nanoemulsion worden verdund met extra water voordat het in een centrifugaal concentrator wordt gecentrifugeerd en niet sneller dan 2,465 x ggesponnen. De verdunde nanoemulsions moet worden toegevoegd aan de centrifugaal concentrator op aliquots tussen de draaiingen, en de nanoemulsion moet worden gemengd in het filter voordat het volgende deel wordt toegevoegd.

De mogelijkheid om de vorm nanoemulsions met vetzuren derivaten dan oliezuur is niet getest en wordt nog vastgesteld. Toekomstige toepassingen kunnen het gebruik van verschillende peptiden ter vergemakkelijking van de vergadering van de mede met oliezuur omvatten. Oliezuur geconjugeerde met platina gebaseerde drugs kunnen ook worden gebruikt als potentiële kernen van nanoemulsions.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Auteurs hebben niet een belangenconflict openbaar te maken.

Acknowledgments

Wij nogmaals mijn dankbaarheid uitspreken financiële steun van de National Cancer Institute, verlenen SC2CA206194. Geen concurrerende financiële belangen worden gedeclareerd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
  2. Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Nanoparticles in the clinic. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (1), 10-29 (2016).
  3. Peer, D., Karp, J. M., Hong, S., Farokhzad, O. C., Margalit, R., Langer, R. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nature Nanotechnology. 2 (12), 751-760 (2007).
  4. Roy Chowdhury, M., Schumann, C., Bhakta-Guha, D., Guha, G. Cancer nanotheranostics: Strategies, promises and impediments. Biomedicine & Pharmacotherapy. 84, 291-304 (2016).
  5. Jeevanandam, J., Chan, Y. S., Danquah, M. K. Nano-formulations of drugs: Recent developments, impact and challenges. Biochimie. , 99-112 (2016).
  6. Meerum Terwogt, J. M., Groenewegen, G., Pluim, D., Maliepaard, M., Tibben, M. M., Huisman, A., ten Bokkel Huinink, W. W., Schot, M., Welbank, H., Voest, E. E., Beijnen, J. H., Schellens, J. M. Phase I and pharmacokinetic study of SPI-77, a liposomal encapsulated dosage form of cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 49 (3), 201-210 (2002).
  7. Fan, Z., Sun, L., Huang, Y., Wang, Y., Zhang, M. Bioinspired fluorescent dipeptide nanoparticles for targeted cancer cell imaging and real-time monitoring of drug release. Nature Nanotechnology. 11 (4), 388-394 (2016).
  8. Jeong, Y., et al. Enzymatically degradable temperature-sensitive polypeptide as a new in-situ gelling biomaterial. Journal of Controlled Release. 137 (1), 25-30 (2009).
  9. Uesaka, A., et al. Morphology control between twisted ribbon, helical ribbon, and nanotube self-assemblies with his-containing helical peptides in response to pH change. Langmuir. 30 (4), 1022-1028 (2014).
  10. Hwang, W., Marini, D. M., Kamm, R. D., Zhang, S. Supramolecular structure of helical ribbons self-assembled from a B-sheet peptide. Journal of Chemical Physics. 118 (1), 389-397 (2003).
  11. Svobodova, J., et al. Poly(amino acid)-based fibrous scaffolds modified with surface-pendant peptides for cartilage tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 831-842 (2017).
  12. Kumar, V. A., et al. Highly angiogenic peptide nanofibers. ACS Nano. 9 (1), 860-868 (2015).
  13. Romera, D., Couleaud, P., Mejias, S. H., Aires, A., Cortajarena, A. L. Biomolecular templating of functional hybrid nanostructures using repeat protein scaffolds. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 825-831 (2015).
  14. Medina, S. H., Schneider, J. P. Cancer cell surface induced peptide folding allows intracellular translocation of drug. Journal of Controlled Release. 209, 317-326 (2015).
  15. Recio, C., Maione, F., Iqbal, A. J., Mascolo, N., De Feo, V. The Potential Therapeutic Application of Peptides and Peptidomimetics in Cardiovascular Disease. Frontiers in Pharmacology. 7, 526 (2016).
  16. McCarthy, K. A., et al. Phage Display of Dynamic Covalent Binding Motifs Enables Facile Development of Targeted Antibiotics. Journal of the American Chemical Society. 140 (19), 6137-6145 (2018).
  17. Lazar, V., et al. Antibiotic-resistant bacteria show widespread collateral sensitivity to antimicrobial peptides. Nature Microbiology. 3 (6), 718-731 (2018).
  18. Czeczor, J. K., McGee, S. L. Emerging roles for the amyloid precursor protein and derived peptides in the regulation of cellular and systemic metabolism. Journal of Neuroendocrinology. 29 (5), (2017).
  19. Branco, M. C., Sigano, D. M., Schneider, J. P. Materials from peptide assembly: towards the treatment of cancer and transmittable disease. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (3), 427-434 (2011).
  20. Cheetham, A. G., et al. Targeting Tumors with Small Molecule Peptides. Current Cancer Drug Targets. 16 (6), 489-508 (2016).
  21. Ndinguri, M. W., Solipuram, R., Gambrell, R. P., Aggarwal, S., Hammer, R. P. Peptide targeting of platinum anti-cancer drugs. Bioconjugate Chemistry. 20 (10), 1869-1878 (2009).
  22. Eskandari, S., Guerin, T., Toth, I., Stephenson, R. J. Recent advances in self-assembled peptides: Implications for targeted drug delivery and vaccine engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 110, 169-187 (2017).
  23. Zhou, J., Du, X., Yamagata, N., Xu, B. Enzyme-Instructed Self-Assembly of Small D-Peptides as a Multiple-Step Process for Selectively Killing Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (11), 3813-3823 (2016).
  24. Sun, J. E., et al. Sustained release of active chemotherapeutics from injectable-solid beta-hairpin peptide hydrogel. Biomaterials Science. 4 (5), 839-848 (2016).
  25. Lock, L. L., Reyes, C. D., Zhang, P., Cui, H. Tuning Cellular Uptake of Molecular Probes by Rational Design of Their Assembly into Supramolecular Nanoprobes. Journal of the American Chemical Society. 138 (10), 3533-3540 (2016).
  26. Kalafatovic, D., Nobis, M., Son, J., Anderson, K. I., Ulijn, R. V. MMP-9 triggered self-assembly of doxorubicin nanofiber depots halts tumor growth. Biomaterials. 98, 192-202 (2016).
  27. Frederix, P. W., et al. Exploring the sequence space for (tri-)peptide self-assembly to design and discover new hydrogels. Nature Chemistry. 7 (1), 30-37 (2015).
  28. Horsley, J. R., et al. Photoswitchable peptide-based 'on-off' biosensor for electrochemical detection and control of protein-protein interactions. Biosensors and Bioelectronics. 118, 188-194 (2018).
  29. Hoyos-Nogues, M., Gil, F. J., Mas-Moruno, C. Antimicrobial Peptides: Powerful Biorecognition Elements to Detect Bacteria in Biosensing Technologies. Molecules. 23 (7), 1683 (2018).
  30. Xiao, X., et al. Advancing Peptide-Based Biorecognition Elements for Biosensors Using in-Silico Evolution. ACS Sensors. 3 (5), 1024-1031 (2018).
  31. Puiu, M., Bala, C. Peptide-based biosensors: From self-assembled interfaces to molecular probes in electrochemical assays. Bioelectrochemistry. 120, 66-75 (2018).
  32. Wang, J., et al. Developing a capillary electrophoresis based method for dynamically monitoring enzyme cleavage activity using quantum dots-peptide assembly. Electrophoresis. 38 (19), 2530-2535 (2017).
  33. Etayash, H., Thundat, T., Kaur, K. Bacterial Detection Using Peptide-Based Platform and Impedance Spectroscopy. Methods in Molecular Biology. 1572, 113-124 (2017).
  34. Handelman, A., Apter, B., Shostak, T., Rosenman, G. Peptide Optical waveguides. Journal of Peptide Science. 23 (2), 95-103 (2017).
  35. Chen, C., Liu, K., Li, J., Yan, X. Functional architectures based on self-assembly of bio-inspired dipeptides: Structure modulation and its photoelectronic applications. Advances in Colloid and Interface Science. 225, 177-193 (2015).
  36. Reddy, S. M., Shanmugam, G. Role of Intramolecular Aromatic pi-pi Interactions in the Self-Assembly of Di-l-Phenylalanine Dipeptide Driven by Intermolecular Interactions: Effect of Alanine Substitution. Chemphyschem. 17 (18), 2897-2907 (2016).
  37. Marchesan, S., et al. Unzipping the role of chirality in nanoscale self-assembly of tripeptide hydrogels. Nanoscale. 4 (21), 6752-6760 (2012).
  38. Scott, G. G., McKnight, P. J., Tuttle, T., Ulijn, R. V. Tripeptide Emulsifiers. Advanced Materials. 28 (7), 1381-1386 (2016).
  39. Galanski, M., Jakupec, M. A., Keppler, B. K. Update of the preclinical situation of anticancer platinum complexes: novel design strategies and innovative analytical approaches. Current Medicinal Chemistry. 12 (18), 2075-2094 (2005).
  40. Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
  41. Oberoi, H. S., Nukolova, N. V., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Nanocarriers for delivery of platinum anticancer drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (13-14), 1667-1685 (2013).
  42. Fichtinger-Schepman, A. M., van Oosterom, A. T., Lohman, P. H., Berends, F. cis-Diamminedichloroplatinum(II)-induced DNA adducts in peripheral leukocytes from seven cancer patients: quantitative immunochemical detection of the adduct induction and removal after a single dose of cis-diamminedichloroplatinum(II). Cancer Research. 47 (11), 3000-3004 (1987).
  43. Englander, E. W. DNA damage response in peripheral nervous system: coping with cancer therapy-induced DNA lesions. DNA Repair. 12 (8), 685-690 (2013).
  44. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cisplatin resistance. Oncogene. 31 (15), 1869-1883 (2012).
  45. Boeckman, H. J., Trego, K. S., Turchi, J. J. Cisplatin sensitizes cancer cells to ionizing radiation via inhibition of nonhomologous end joining. Molecular Cancer Research. 3 (5), 277-285 (2005).
  46. Dragulska, S. A., et al. Tripeptide-Stabilized Oil-in-Water Nanoemulsion of an Oleic Acids-Platinum(II) Conjugate as an Anticancer Nanomedicine. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2514-2519 (2018).
  47. Martinez Rivas,, J, C., et al. Nanoprecipitation process: From encapsulation to drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 532 (1), 66-81 (2017).
  48. Agilent Technologies. Analytical Methods for Graphite Tube Atomizers, User's Guide Manual, 8th edition. , (2012).
  49. Park, S. Y., et al. A smart polysaccharide/drug conjugate for photodynamic therapy. Angewandte Chemie. 50 (7), 1644-1647 (2011).
  50. Canton, I., Battaglia, G. Endocytosis at the nanoscale. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2718-2739 (2012).
  51. Lokich, J., Anderson, N. Carboplatin versus cisplatin in solid tumors: an analysis of the literature. Annals of Oncology. 9 (1), 13-21 (1998).

Tags

Bioengineering kwestie 144 Nanoemulsion oliezuur tripeptide AntiKanker therapie biologische beeldvorming drug delivery
Een Tripeptide-gestabiliseerde Nanoemulsion van oliezuur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., … More

Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter