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Bioengineering

Una nanoemulsión tripéptido-estabilizado del ácido oleico

Published: February 27, 2019 doi: 10.3791/59034
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 4,5,6, 1,2,3
1Department of Chemistry, Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women's Health Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research, Western Connecticut Health Network

Summary

Este protocolo describe un método eficiente para sintetizar una nanoemulsión de un conjugado de ácido oleico acids-platinum(II) estabilizado con un tripéptido de lisina-tirosina-fenilalanina (KYF). Las formas de nanoemulsión condiciones suaves sintético a través de autoensamblaje de lo KYF y el conjugado.

Abstract

Se describe un método para producir una nanoemulsión compuesto de un núcleo de ácido oleico acids-Pt(II) y una capa de (KYF) de fenilalanina-tirosina-lisina (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE encapsula Pt(II) en 10% en peso, tiene un diámetro de 107 ± 27 nm y una carga superficial negativa. KYF-Pt-NE es estable en agua y suero y es biológicamente activo. La conjugación de un fluoróforo a KYF permite la síntesis de una nanoemulsión fluorescente adecuado para la proyección de imagen biológica. La síntesis de la nanoemulsión se realiza en un ambiente acuoso y las formas de KYF-Pt-NE a través de uno mismo-montaje de un péptido corto de KYF y un conjugado de ácido oleico acids-platinum(II). El proceso uno mismo-Asamblea depende de la temperatura de la solución, la fracción molar de los sustratos y la tasa de flujo de la adición del sustrato. Pasos cruciales incluyen mantener el ritmo óptimo de agitación durante la síntesis, permitiendo suficiente tiempo para uno mismo-Asamblea y la concentración la nanoemulsión gradualmente en un concentrador centrífugo.

Introduction

En los últimos años ha habido un creciente interés en la ingeniería de nanopartículas para aplicaciones biomédicas como la entrega de la droga y Bioimagen1,2,3,4. La multifuncionalidad de los sistemas basados en nanopartículas requiere a menudo incorporando múltiples componentes dentro de una formulación. Los bloques que se basan en lípidos o polímeros a menudo difieren en cuanto a sus propiedades fisicoquímicas así como su biocompatibilidad y biodegradabilidad, que podría afectar la función de la nanoestructura1, 5,6. Materiales derivados biológicamente, tales como proteínas y péptidos, durante mucho tiempo han sido reconocidos como componentes prometedores de nanoestructuras multifuncionales debido a su flexibilidad de secuencia7,8. Péptidos, uno mismo-montar en arquitecturas supramoleculares altamente ordenadas formación helicoidal cintas9,10, andamios fibroso11,12y muchos más, allanando así el camino para la construcción Nanoestructuras basados en biomoléculas híbrido utilizando un fondo enfoque13.

Péptidos se han explorado para aplicaciones en medicina y biotecnología, especialmente para la terapia contra el cáncer14 y enfermedades cardiovasculares15 así como en cuanto a desarrollo de antibiótico16,17, metabólicos trastornos18y19de las infecciones. Hay más de un centenar de pequeños péptidos terapéuticos sometidos a ensayos clínicos20. Péptidos son fáciles de modificar y a sintetizar a bajo costo. Además, son biodegradables, que facilita sus aplicaciones biológicas y farmacéuticas21,22. El uso de péptidos como componentes estructurales incluye la ingeniería de nanopartículas basada en péptidos, sensibles y depósitos de hidrogel para liberación controlada23,24,25,26 , 27, biosensores basados en péptidos28,29,30,31o dispositivos bio-electrónicos32,33,34. Lo importante, se encontraron péptidos cortos incluso con dos o tres residuos de aminoácidos que incluyen fenilalanina para guiar a la uno mismo-Asamblea35,36,37 los procesos y crear emulsiones estabilizadas38 .

Fármacos basados en platino, debido a su alta eficacia, se utilizan en muchos regimenes de tratamiento del cáncer, tanto solos como en combinación con otros agentes39,40. Compuestos de platino inducen daño en el ADN por formación de enlaces cruzados de monoadducts e intrafilamentoso o interstrand. Las lesiones de Pt-ADN son reconocidas por la maquinaria celular y, si no se repara, conducen a la apoptosis celular. El mecanismo más importante, por que Pt(II) contribuye a la muerte de la célula de cáncer, es la inhibición de DNA transcripción41,42. Sin embargo, los beneficios de la terapia de platino son disminuidos por la toxicidad sistémica de Pt(II) que provoca efectos secundarios graves. Esto conduce a baja dosificación clínicos de Pt(II)43, que a menudo resulta en concentraciones subterapéuticas de platino alcanzando el ADN. Como consecuencia, la reparación del ADN que sigue contribuye a la supervivencia de la célula de cáncer y adquisición de resistencia de Pt(II). La quimio-resistencia del platino es un problema importante en la terapia contra el cáncer y la principal causa de fracaso de tratamiento44,45.

Hemos desarrollado un estable nanosistemas que encapsula al agente Pt(II) para proporcionar un efecto protector en la circulación sistémica y a disminuir los efectos secundarios inducidos por el Pt II. El sistema se basa en un núcleo de ácido oleico acids-Pt(II) estabilizado con un tripéptido KYF para formar una nanoemulsión (KYF-Pt-NE)46. Los bloques de edificio de KYF-Pt-NE, los aminoácidos de la tripéptido así como el ácido oleico, poseen el estado generalmente reconocido como seguro (GRAS) con alimentos y drogas (FDA). KYF-Pt-NE se prepara utilizando un método de nanoprecipitation47. En Resumen, el acids-Pt(II) oleico conjugado es disuelto en un solvente orgánico y luego se agrega gota a gota a una solución acuosa de KYF (figura 1) a 37 ° C. La solución se agita durante varias horas permitir que uno mismo-Asamblea de KYF-Pt-ne La nanoemulsión está concentrada en concentradores centrífugos de 10 kDa y lavaron tres veces con agua. La modificación química de KYF con un fluoróforo permite la síntesis de FITC-KYF-Pt-NE fluorescente adecuado para la proyección de imagen biomédica.

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Protocol

1. síntesis del Acids–Platinum(II) ácido oleico conjugado

  1. Activación de cisplatino
    1. Suspender (0.167 mmol) de 50 mg de cisplatino, en 4 mL de agua (por ejemplo, nanopure) a 60 ° C.
    2. Añadir gota a gota 55,2 mg (0.325 mmol) de AgNO3 en 0,5 mL de agua a la solución de cisplatino y revuelva la reacción durante al menos 2 h a 60 ° C. El precipitado blanco de AgCl forma indicando el progreso de la reacción.
    3. Para determinar si la reacción de activación se ha completado, realice la prueba con 10% ácido clorhídrico la presencia de iones de Ag+ libre en solución. La prueba debe ser negativa (no debe formar más precipitado de AgCl).
    4. Centrifugar la mezcla de reacción a 3.220 x g por 10 min y remover el precipitado blanco de AgCl.
    5. Recoger el sobrenadante y filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,2 mm. Prueba el sobrenadante para detectar la presencia de platino aplicando 2 ó 3 gotas de la solución mediante pipeta Pasteur al SnCl2 cristales. La prueba es positiva si el color del complejo coordinado de lata con platino es amarillo y naranja oscuro.
    6. Utilice el sobrenadante con Pt(II) activado para el segundo paso.
  2. Reacción de ácido oleico con Pt(II) activado
    1. Suspender 94,2 mg de ácido oleico (0.333 mmol) en 3 mL de agua a 60 ° C.
    2. Añadir 13,3 mg (0.333 mmol) de NaOH en 1 mL de agua y mezclar con la solución de Pt(II) activados en el paso 1.1
    3. Revuelva la reacción 2 h a 60 ° C y luego a temperatura ambiente durante la noche. El producto crudo es un precipitado marrón/amarillo aceitoso.
    4. Centrifugar la mezcla de reacción a 3.220 x g por 10 min y retirar el sobrenadante. Secar el producto crudo a 25 ° C utilizando un evaporador rotatorio. Purifique el producto por múltiples lavados con acetonitrilo. El color final de puro acids–Pt(II) ácido oleico conjugado es amarillo pálido.

2. síntesis de KYF-Pt-NE y el marcado con FITC nanoemulsión FITC-KYF-Pt-NE

  1. Síntesis del tripéptido KYF y el tripéptido marcada fluorescencia FITC-KYF
    1. Sintetizar la KYF usando química de péptidos de estado sólido estándar. Utilice el estándar siguiente condiciones de acoplamiento para conectar cada aminoácido: Wang resina (2.19 mmol), protegido de Fmoc Aminoácidos (4.38 mmol), tetrafluoroborato 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium (TBTU) (4.38 mmol) y diisopropylethylamine (DIPEA) (8.76 mmol). Disolver los aminoácidos con TBTU en dimetilformamida (DMF) y DIPEA.
    2. Remoje 5,7 g de resina de alcohol 4-alkoxybenzyl de Fmoc-L-Phe (0.382 meq/g) en 25 mL de DMF para 1 h antes de su uso.
    3. Desprotejera el grupo amino del aminoácido L-fenilalanina con 15 mL de solución al 20% piperidina/DMF durante 5 minutos, eliminar el disolvente y repetir el lavado con ciclo de 20 minutos.
    4. Lavar la resina durante 1 min con los siguientes solventes: DMF, alcohol isopropílico (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. Desechar el disolvente después de cada lavado.
    5. Realizar la prueba de Kaiser para determinar la presencia de grupo de2 NH libre en la resina (ver pasos) y positivo (la semilla de la resina es morada), añadir los aminoácidos Fmoc-L-tirosina y realizar el acoplamiento durante la noche.
      1. Preparar a Kaiser prueba soluciones en botellas separadas.
      2. Disolver 5 g de ninhidrina en 100 mL de etanol.
      3. Disolver 80 g de fenol en 20 mL de etanol.
      4. Mezclar 2 mL de solución acuosa de 0,001 M de cianuro de potasio con
        98 mL de piridina.
      5. Añadir 2-3 gotas de cada Kaiser probar soluciones muestra y calor en agua hirviendo durante 5 minutos.
    6. Al acoplamiento exitoso del segundo aminoácido, realice la prueba de Kaiser y en caso negativo continuar con protocolo de desprotección (pasos 2.1.3 a 2.1.5). Repita el proceso con el aminoácido fenilalanina Fmoc.
      1. Al acoplamiento de los aminoácidos, lave la resina durante 1 minuto con 5 mL de DMF, IPA, DMF, metanol, diclorometano y éter dietílico, después de cada lavado deseche el solvente. Guardar la resina para su posterior procesamiento.
      2. Utilizar la mitad de la resina para los siguientes pasos (2.1.7-2.1.9) para modificar el péptido con FITC. Para obtener el tripéptido KYF sin modificar, siga el procedimiento a partir de 2.1.10.
    7. Modificar el aminoácido N-terminal de KYF KYF-N3 con ácido 6-azidohexanoic. Para ello, mezcle 1 g (0.382 mmol) de resina de KYF Wang y 120,1 mg (0.764 mmol) de ácido 6-azidohexanoic con 245,2 mg (0.764 mmol) de TBTU y 197,1 mg (1.528 mmol) de DIPEA en 30 mL de DMF. Revuelva la reacción durante la noche a temperatura ambiente.
    8. Obtener KYF-FITC de la síntesis de KYF-N3 con fluoresceína propargyl vía una reacción de clic. Para ello, mezcle de 253 mg (0.097 mmol) de KYF-N3 Wang resina 3,78 mg (0.019 mmol) de CuI sólido, 71,9 mg (0.193 mmol) de fluoresceína propargyl y 2,24 mg (0.017 mmol) de DIPEA. La reacción debe cambiar de color de verde a marrón.
    9. Después de 24 h, lavar tres veces la resina durante 1 min alternativamente con 5 mL de DMF y IPA cinco veces, metanol y agua tres veces, DMF y tres veces y con diclorometano y éter dietílico. Desechar el disolvente después de cada lavado.
    10. Hender el KYF-FITC o péptido KYF de la resina con una solución de ácido trifluoroacético (TFA) / Triisopropilsilano (consejos) / h2O en el cociente del 95/2.5/2.5 más de 3 horas.
    11. Precipitar el crudo péptido en un éter dietílico frío, luego seco bajo el vacío y lavar tres veces con éter frío.
  2. Síntesis de nanoemulsión FITC-KYF-estabilizado con ((FITC-KYF-Pt-NE) II) y Pt-KYF-NE
    1. Disolver 10 mg (0.0126 mmol) de acids–Pt(II) ácido oleico conjugado en 1,5 mL de isopropanol y coloque en una jeringa de 5 mL.
    2. Colocar la jeringa con acids–Pt(II) ácido oleico conjugado en una bomba de jeringa y ajuste el flujo a 0,1 mL/min.
    3. Para sintetizar el FITC-KYF-Pt-NE, disolver 1 mg (0.00105 mmol) de FITC-KYF y 1 mg (0.00219 mmol) de KYF (relación molar 1:2 de FITC-KYF:KYF) en 20 mL de agua y ajustar la temperatura de la solución a 37 ° C. Cubren las paredes del recipiente con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo de fluoróforo FITC. Para sintetizar la NE-Pt-KYF, disolver 2 mg (0,0044 mmol) de tripéptido KYF en 20 mL de agua y ajustar la temperatura de la solución a 37 ° C.
    4. Añadir el conjugado de ácido oleico acids–Pt(II) gota a gota a la solución de FITC-KYF/KYF o KYF tripéptido. Realizar este paso bajo el capó.
    5. Agitar la solución durante la noche a temperatura ambiente para evaporar los solventes orgánicos y permitir el uno mismo-Asamblea de FITC-KYF-Pt-NE o KYF-Pt-ne
    6. Concentrar el FITC-KYF-Pt-NE o KYF-Pt-NE en un concentrador centrífugo (10k MWCO) y lavar tres veces con 4 mL de agua nanopure.
    7. Almacenar las soluciones acuosas de KYF-Pt-NE y FITC-KYF-Pt-NE a 4 ° C.
    8. Análisis de contenido de platino mediante espectroscopia de absorción atómica (AAS), después guía48 del fabricante de la.
      1. Preparar normas de platino en la solución de ácido clorhídrico 10% para la curva de calibración (alcance efectivo de AAS es entre 100 a 1.200 ppb (partes por billón)).
      2. Disolver 50 μl de solución de KYF-Pt-NE de paso 2.2 en 100 μl de agua regia (una mezcla 3:1 de ácido clorhídrico concentrado y ácido nítrico) y dejar a temperatura ambiente durante la noche. Agregar 850 μl de agua para alcanzar un volumen de muestra final de 1 mL. Análisis de la muestra mediante AAS. La concentración final de ácido debe ser de 10% en todas las muestras analizadas.
      3. Registrar la lectura de la concentración de Pt en el MPP y calcular el contenido final de platino de la muestra (cuenta para dilución de la muestra y el volumen inicial de nanoemulsión).

3. confocal proyección de imagen de la captación celular de FITC-KYF-Pt-NE

  1. 6 líneas de células de cáncer de ovario (A2780 CP70, SKOV3, OV90, TOV21G y ES2), la semilla en 4 platos confocales de cámara bien en la densidad de 4.7 x 104 células por cámara y la cultura durante la noche a 37 ° C.
  2. Después de 24 h, lavar las células tres veces con solución salina buffer fosfato (PBS) e Incube con FITC-KYF-Pt-NE en medio de cultivo celular (ver paso 6.1 para celular línea detalles específicos) por 15 min a 37 ° C.
  3. Después de la incubación, retirar los medios de comunicación y lavar las células 3 veces con PBS.
  4. Fijar las células con metanol frío por 5 min a-20 ° C y lavar tres veces con 1 mL de PBS.
  5. Permeabilizar las células con 1 mL de 0.1% de Triton X durante 10 min a temperatura ambiente y lavar tres veces con 1 mL de PBS.
  6. Incube las células durante 90 minutos con LAMP1 anticuerpo conjugado con Alexa Fluor 647 (1 mL) en 1:50 dilución en PBS a temperatura ambiente. A continuación, lavar las células 3 veces con PBS.
  7. Diluir la solución madre de DAPI (1 mg/mL) a 1 mg/mL en PBS. Luego, añadir 1 mL de la solución diluida a cada cámara e incubar por 15 min a temperatura ambiente. Lavar las células 3 veces con PBS.
  8. Monte el cubreobjetos sobre un portaobjetos con medio de montaje.
  9. Imagen de las células con el microscopio confocal de células vivas en longitud de onda de excitación de 405 nanómetro, 488 nm y 633 nm. Configurar los parámetros de detección como sigue: energía del laser de 0.2% y no más del 1%, unidad Pinole 1 ventilado, Gain master offset Digital de 650-750, 0.
  10. Imagen abierta en software de imágenes. En imagen visualizada, seleccionar gráficos y seleccione Insertar barra de escala, para insertar la barra de escala a la imagen.

4. drogas liberación estudios

  1. Realizar los estudios de liberación de droga en PBS. Ajuste los valores de pH de tres buffers PBS a 7.4, 6.8 y 5.0 respectivamente.
  2. Diluir 5 μL de KYF-Pt-NE en 180 μL de tampón PBS de pH apropiado, transferencia a 3.5 taza de diálisis mini de MWCO kDa e incubar a 37 ° C en PBS.
  3. Elimine el tampón cada tres tubos de diálisis mini en 2, 4, 6, 24, 48 y 140 h y medir las concentraciones de platino por AAS. Preparar las muestras según el paso 2.2.8 pero ajustar el volumen final de la muestra de 500 μl.

5. métodos de cultivo celular

  1. Cultivo celular líneas A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, TOV - 21G, ES-2 en la célula cultura medio (DMEM) suplementado con 10% (A2780, CP70, SKOV-3, ES-2) o con suero bovino fetal (FBS), de 15% (TOV 21G, OV-90) con L-glutamina y penicilina/estreptomicina. Crecen todas las células en un 5% CO2, ambiente saturado de agua a 37 ° C.
  2. Semillas 3 x 105 células cada placa de 96 pocillos y la cultura durante la noche para los experimentos de incubación in vitro. Preparar las soluciones KYF-Pt-NE, el cisplatino y el carboplatino en el agua. Ajustar la concentración de Pt(II) en KYF-Pt-NE para que coincida con la concentración de carboplatino y cisplatino para cada línea celular. Incubar por 72 horas a 37 ° C.
  3. Después de la incubación, evaluar la viabilidad celular mediante un ensayo colorimétrico (el ensayo de MTT la proliferación celular). Brevemente, quite medio y añadir 110 μL de 10% MTT en medio a cada uno bien e incubar por 2 h a 37 ° C. Luego agregar 100 detergente μL a cada pozo e incubar durante 5 h a 37 ° C.
  4. Compruebe la absorbancia a 570 nm usando el lector de placas. Analizar los resultados utilizando el análisis estadístico con la prueba Z y prueba de P.

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Representative Results

Imagen de TEM representante de KYF-Pt-NE preparado mediante este protocolo se muestra en la figura 2A. KYF-Pt-NEs son esféricos en morfología, bien dispersa y uniforme en tamaño. El diámetro del núcleo de KYF-Pt-NEs, medido directamente en tres imágenes TEM con un mínimo de 200 medidas hecho, es 107 ± 27 nm. Diámetro hidrodinámico de KYF-Pt-NE, analizada mediante espectroscopia de luz dinámica (DLS), fue encontrado para ser 240 nm con un índice de polidispersidad de 0.156. Se determinó el potencial Zeta de KYF-Pt-NE en el agua para las tres síntesis independiente con el valor medio de-60.1 mV. La gran magnitud del potencial indica buena estabilidad coloidal de la formulación y la carga de superficie negativa se atribuye a ionizado COO– grupos superficiales de ácido oleico. El punto isoeléctrico de KYF es 8.59, y por lo tanto está cargado positivamente a pH neutro.

La capacidad de las nanoemulsiones para cruzar la membrana celular fue examinada usando las líneas celulares de fluorescencia etiquetada cáncer FITC-KYF-Pt-NE y de ovario. Los resultados se presentan en la figura 2B. Puede verse claramente que el FITC-KYF-Pt-NEs (verde) se distribuyen en el citosol pero todavía no se asociaron con lisosomas (rojo). Este resultado demuestra que KYF-Pt-NEs entre las células y pueden servir como vehículo de entrega de drogas intracelular.

Se evaluó la estabilidad de KYF-Pt-NEs y FITC-KYF-Pt-NEs con DLS. Se midió el diámetro de las nanoemulsiones en agua durante varios meses y los resultados se presentan en la figura 3. Diámetro hidrodinámico de ambas formulaciones aumentó lentamente durante 4 meses en almacenamiento hasta 320 nm (KYF-Pt-NE) y 240 nm (FITC-KYF-Pt-NE), pero las dimensiones de nanoescala fueron preservados. Este resultado sugiere que el tripéptido KYF estabiliza eficazmente nanoemulsiones durante largos períodos de tiempo.

La Pt(II) eficacia de encapsulación y liberación de la nanoemulsión se midieron con AAS. La concentración de Pt(II) en KYF-Pt-NE se estableció para ser 10 wt.%. El Pt(II) lanzamiento de KYF-Pt-NE a pH 7,4 (fisiológico), 6.8 (intersticio del tumor)49y 5.0 (endosomal)50 se presenta en la Figura 4A. La Pt(II) es la más lenta a pH 7.4 con sólo 20,8% de Pt(II) liberado después de 4 h, mientras que a pH 6.8 y 5.0 el lanzamiento fue de 32,8% y 47.5%, respectivamente. La misma tendencia continuó después de 24 h y después de 6 días. Este resultado indica que Pt(II) de KYF-Pt-NE es dependiente del pH, y puede ser retrasada en la circulación sistémica y aceleró una vez que las nanoemulsiones se translocan en tumor.

La actividad biológica de KYF-Pt-NE se estableció in vitro utilizando las mismas líneas de células de cáncer de ovario como en los estudios por imágenes. Las células se incubaron con KYF-Pt-NE durante 72 h, a concentraciones de KYF-Pt-NE correspondiente a IC50 para cada línea celular. La viabilidad se evaluó mediante el ensayo MTT y los resultados fueron comparados a las células sólo, KYF-NE, acids-Pt(II) ácido oleico conjugado, carboplatino y cisplatino. Los resultados de la actividad biológica de KYF-Pt-NE se muestran en la Figura 4B. KYF-Pt-NE redujo la viabilidad de líneas de células isogénicas A2780 (Pt sensible) y CP70 (Pt resistente) 44.3% y 46.2% respectivamente. Carboplatino, el análogo clínico relevante, disminución de la viabilidad por 18.5% (A2780) y 9,6% (CP70) sólo. Se observó la misma tendencia de mayor efecto de KYF-Pt-NE en la muerte celular a través de otras líneas celulares, así. La viabilidad de células sensibles de TOV 21G Pt(II) redujo 55,9% después de la incubación con KYF-Pt-NE, mientras que carboplatino resultó en la disminución de la viabilidad por apenas el 16.5%. En OV-90 células con resistencia intermedia Pt(II), la viabilidad fue bajada por el 55,3% (KYF-Pt-NE) y 23.9% (carboplatino). Las dos líneas de células resistentes al cáncer ES-2 y SKOV-3, demostraron reducción en la viabilidad del 45,9% y 54.3%, respectivamente, KYF-Pt-NE y 10.3% (ES-2) y 16,8% (SKOV-3) para el carboplatino.

También se comparó la actividad biológica de KYF-Pt-NE versus cisplatino. Cisplatino es el agente basado en Pt II de primera generación que ya no se ve favorecida en la clínica debido a su perfil de toxicidad51. En dos líneas celulares, SKOV-3 y TOV - 21G, la reducción de la viabilidad fue mayor en un 15% y 40%, respectivamente, para KYF-Pt-NE que de cisplatino. En las restantes líneas celulares, la actividad de KYF-Pt-NE era comparable al cisplatino (A2780, CP70, OV-90) o bajar (ES-2). El acids-Pt(II) oleico conjugado también fue encontrado para ser biológicamente activa. Sin embargo, KYF-Pt-NE mostró mayor reducción en la viabilidad que el conjugado en la mayoría de las líneas celulares probadas, indicando la importancia de nanoformulation en Pt(II) actividad.

Las aplicaciones biológicas de sistemas nanoparticulados requieren estabilidad en medios biológicamente relevantes, la estabilidad de KYF-Pt-NE se evaluó en 20% de suero bovino fetal (FBS) y los resultados se presentan en la figura 4. No se detectó ninguna evidencia de la opsonización de KYF-Pt-NE en suero después de un día de incubación.

Figure 1
Figura 1. Los componentes de las nanoemulsiones (arriba) y esquema de la preparación de nanoemulsión (parte inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Imagen TEM de KYF-Pt-NE (A) e imágenes de microscopio confocal de absorción de FITC-KYF-Pt-NE (verde) por las células de cáncer de ovario (los núcleos son de color azules y lisosomas son de color rojos) (B). Barras de escala son 10 μm. Esta figura ha sido adaptada con permiso de la Química de Bioconjugate 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Estabilidad de KYF-Pt-NE y FITC-KYF-Pt-NE en el agua. Cada punto representa la media y desviación estándar de N = 3 y p <0.005. Esta figura ha sido adaptada con permiso de la Química de Bioconjugate 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. KYF-Pt-NE estabilidad y actividad biológica. Pt(II) (A) liberación de KYF-Pt-NE en tampón PBS a diferentes pHs (PBS, 37 º C). Viabilidad celular de líneas celulares de cáncer de ovario diferentes después de 72 h de incubación con KYF-Pt-NE (B). Cada columna representa la media y desviación estándar de N = 3 y p <0.005. Las concentraciones son constantes en cada línea celular y son los siguientes: 4,92 mM (A2780) 8,80 mM (CP70), 2,46 mM (TOV - 21G), 9,84 mM (SKOV3) 7,38 mM (ES-2), 19,7 mM (OV-90). La concentración de acids–Pt(II) KYF-Pt-NE y oleico conjugado fue ajustada con respecto al contenido de Pt(II) medida por AAS. Abreviaturas: "Carbpt" – carboplatino; "KYF-NE" – KYF nanoemulsión revestido de tripéptido; "KYF-Pt-NE" – KYF nanoemulsión tripéptido recubierto que contiene Pt(II); Cispt – cisplatino; PT-oleico – oleico acids–Pt(II) conjugado. (C) estabilidad de KYF-Pt-NE en el suero. Esta figura ha sido adaptada con permiso de la Química de Bioconjugate 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Pasos críticos en la síntesis de nanoemulsión incluyen ajustar la relación molar de los substratos, mantener la temperatura y el flujo de control de la frecuencia durante acids–Pt(II) oleico además, proporcionando suficiente tiempo para uno mismo-Asamblea y purificar el producto usando un columna del concentrador centrífugo. Estos parámetros influyen en el tamaño y la morfología de KYF-Pt-NE; por lo tanto, es particularmente importante mantener la relación molar apropiada y ajustar correctamente las condiciones sintético.

La proporción de los sustratos durante la síntesis de nanoemulsión (paso 3) es crucial para el proceso uno mismo-Asamblea y determina el tamaño final del producto. KYF acid-Pt(II) oleico relación molar es 1:3, y la concentración óptima de la KYF tripepide en agua es de 0,2 mM. Además, el solvente orgánico utilizado para disolver el acid-Pt(II) oleico conjugado en el paso 3.1 debe ser miscible con agua, compatible con el sistema de filtración y evaporación fácilmente a temperatura ambiente.

Uno de los pasos críticos es la adición gota a gota del conjugado acid-Pt(II) oleico a la solución KYF (paso 3.4). El flujo no debe ser menor de 0,1 mL/min y no superior a 0,2 mL/min, debido a una velocidad óptima puede inducir la precipitación de la nanoemulsión. También, el acids–Pt(II) oleico conjugado debe agregarse a la solución KYF a 37 ° C agitando la mezcla en un plato mezclar a 600 rpm. Una vez agregado todo el acid-Pt(II) oleico, la solución debe conservarse a temperatura ambiente y la velocidad de agitación a 150 rpm. Paso 3.5 debe llevarse a cabo a temperatura ambiente. El momento óptimo para la uno mismo-Asamblea de KYF-Pt-NE (paso 3.5) es de 24 horas.

Hay un riesgo que puede precipitar el producto mientras la nanoemulsión está siendo concentrada previamente. Por lo tanto, se recomienda que la nanoemulsión diluida con agua antes de ser centrifugadas en un concentrador centrífugo y girar no más rápido que 2.465 x g. Nanoemulsiones diluido se deben agregar al concentrador centrífugo en partes alícuotas entre giros y la nanoemulsión debe ser mezclada en el filtro antes de añade la siguiente porción.

La capacidad de forma de nanoemulsiones con derivados de ácidos grasos excepto el ácido oleico no ha sido probada y está aún por determinarse. Aplicaciones futuras pueden incluir el uso de péptidos diferentes para facilitar el montaje conjunto con ácido oleico. También, pueden usarse ácido oleico conjugados con fármacos basados en platino no como núcleos potenciales de nanoemulsiones.

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Disclosures

Autores no tienen un conflicto de interés que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos el apoyo financiero del Instituto Nacional del cáncer, concesión de SC2CA206194. No se declaran intereses financieros que compiten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring

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Una nanoemulsión tripéptido-estabilizado del ácido oleico
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Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., … More

Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).

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