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Bioengineering

Ein Tripeptid-stabilisierten Nanoemulsion Ölsäure

Published: February 27, 2019 doi: 10.3791/59034
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 4,5,6, 1,2,3
1Department of Chemistry, Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women's Health Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research, Western Connecticut Health Network

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode um eine Nanoemulsion eine Ölsäure acids-platinum(II) Konjugat mit einer Lysin-Tyrosin-Phenylalanin (KYF) Tripeptid stabilisiert zu synthetisieren. Die Nanoemulsion Formen unter milden synthetischen Bedingungen über Self-assembly von der KYF und das Konjugat.

Abstract

Wir beschreiben eine Methode um eine Nanoemulsion bestehend aus einem Ölsäure acids-Pt(II) Kern und einer Lysin-Tyrosin-Phenylalanin (KYF) Beschichtung (KYF-Pt-NE) zu produzieren. KYF-Pt-NE Pt(II) bei 10 Gew.-% kapselt, hat einen Durchmesser von 107 ± 27 nm und eine negative Oberflächenladung. KYF-Pt-NE ist stabil im Wasser und im Serum und ist biologisch aktiv. Die Konjugation der Fluorophor, KYF ermöglicht die Synthese von einem fluoreszierenden Nanoemulsion die für biologische Bildgebung geeignet sind. Die Synthese von der Nanoemulsion wird in einer wässrigen Umgebung und die KYF-Pt-NE Formen über Self-assembly eine kurze KYF-Peptid und ein Konjugat Ölsäure acids-platinum(II) durchgeführt. Die Selbstmontage Prozess hängt die Temperatur der Lösung, das molare Verhältnis der Substrate und der Durchflussmenge des Substrats hinaus. Entscheidende Schritte umfassen Beibehaltung der optimalen rühren Rate während der Synthesis, genügend Zeit für die Selbstmontage bei schönem und Pre-Konzentration der Nanoemulsion allmählich in eine zentrifugale Konzentrator.

Introduction

In den letzten Jahren gab es ein wachsendes Interesse an der Technik von Nanopartikeln für biomedizinische Anwendungen wie Drug Delivery und Bioimaging1,2,3,4. Die Multifunktionalität von Nanopartikel-basierten Systemen erfordert oft unter Einbeziehung mehrerer Komponenten innerhalb einer Formulierung. Die Bausteine, die oft auf Lipide oder Polymeren basieren unterscheiden sich hinsichtlich ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften sowie ihrer Biokompatibilität und biologische Abbaubarkeit, was letztlich die Funktion der Nanostruktur1, beeinträchtigt 5,6. Biologisch abgeleitete Materialien, wie Proteine und Peptide, wurden lange als viel versprechende Komponenten von multifunktionalen Nanostrukturen aufgrund ihrer Sequenz Flexibilität7,8anerkannt. Peptide, die selbst-zusammenbauen in hochgeordnete supramolekularen Architekturen bilden spiralförmige Bänder9,10, faserigen Gerüste11,12und viele mehr, und ebnete damit den Weg zu Haus Biomolekül-basierten Hybrid Nanostrukturen mit einem Bottom-up-Ansatz13.

Peptide wurden für Anwendungen in Medizin und Biotechnologie, vor allem für die Krebstherapie14 und Herz-Kreislauf-Krankheiten15 sowie für antibiotische Entwicklung16,17, metabolische untersucht Störungen18und Infektionen19. Es gibt über hundert kleinen Peptid-Therapeutika, die in klinischen Studien20. Peptide sind einfach zu ändern und schnell, kostengünstig zu synthetisieren. Darüber hinaus sind sie biologisch abbaubar, das erleichtert ihre biologische und pharmazeutische Anwendungen21,22. Die Verwendung von Peptiden als strukturelle Komponenten umfasst das Engineering von responsive, Peptid-basierte Nanopartikel und Hydrogel Depots für kontrollierte Freisetzung23,24,25,26 , 27, Peptid-basierte Biosensoren28,29,30,31, oder Bio-elektronische Geräte32,33,34. Wichtig ist, fanden sich auch kurze Peptide mit zwei oder drei Aminosäure-Resten, die Phenylalanin enthalten, führen die Selbstmontage35,36,37 verarbeitet und stabilisierte Emulsionen38 zu schaffen .

Platin-basierte Medikamente, aufgrund ihrer hohen Wirksamkeit in vielen Krebs-Behandlungsschemata, sowohl allein als auch in Kombination mit anderen Agenten39,40eingesetzt. Platin Verbindungen verursachen DNA-Schäden durch die Bildung von Interstrand, Monoadducts bzw. Intrastrand Querverbindungen. Die Pt-DNA-Läsionen sind durch die zelluläre Maschinerie erkannt und wenn nicht repariert, zu zellulären Apoptose führen. Der wichtigste Mechanismus, den PT(II) zum Krebs Zelltod beiträgt ist die Hemmung der DNA-Transkription41,42. Allerdings sind die Vorteile von Platin-Therapie durch systemische Toxizität des Pt(II) verringert, die schweren Nebenwirkungen auslöst. Dies führt zu niedrigeren klinische Dosierung von Pt(II)43, führt oft zu Sub-therapeutische Konzentrationen von Platin erreichen die DNA. Infolgedessen trägt die DNA-Reparatur, die folgt, Krebs Zelle überleben und den Erwerb von Pt(II) Widerstand. Die Platin Chemo-Widerstand ist ein großes Problem in der Anti-Krebs-Therapie und die Hauptursache für Behandlung Scheitern44,45.

Wir haben eine stabile Nanosysteme entwickelt, die den Pt(II)-Agent um eine Schirmwirkung im systemischen Kreislauf versorgen und die Pt II-induzierten Nebenwirkungen zu vermindern kapselt. Das System basiert auf einem Ölsäure acids-Pt(II) Kern mit einem KYF Tripeptid bilden eine Nanoemulsion (KYF-Pt-NE)46stabilisiert. Die Bausteine der KYF-Pt-NE, die Aminosäuren der Tripeptid sowie die Ölsäure, haben den Status im allgemeinen erkannt als Safe (GRAS) mit Food and Drug Administration (FDA). KYF-Pt-NE wird mithilfe einer Nanoprecipitation Methode47vorbereitet. Kurz gesagt, wird die Ölsäure acids-Pt(II) Konjugat in einem organischen Lösungsmittel gelöst und dann tropfenweise zu einer wässrigen Lösung KYF (Abbildung 1) bei 37 ° C. Die Lösung wird für mehrere Stunden in Selbstmontage KYF-Pt-ne erlauben gerührt. Die Nanoemulsion wird in 10 kDa zentrifugale Konzentratoren konzentriert und dreimal mit Wasser gewaschen. Die chemische Modifizierung von KYF mit einem Fluorophor ermöglicht die Synthese von fluoreszierenden FITC-KYF-Pt-NE für biomedizinische Bildgebung geeignet.

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Protocol

1. Synthese von Ölsäure Acids–Platinum(II) Konjugat

  1. Aktivierung von cisplatin
    1. Aussetzen von 50 mg (0.167 Mmol) von Cisplatin in 4 mL Wasser (z.B. Nanopure) bei 60 ° C.
    2. Die Lösung von Cisplatin tropfenweise 55,2 mg (0.325 Mmol) AgNO3 in 0,5 mL Wasser hinzu und rühren Sie die Reaktion für mindestens 2 h bei 60 ° C. Zeigt den Fortschritt der Reaktion bilden der weiße Niederschlag von AgCl.
    3. Um festzustellen, ob die Aktivierung Reaktion abgeschlossen ist, führen Sie den Test mit 10 % HCl auf das Vorhandensein von freien Ag+ -Ionen in Lösung. Sollte der Test negativ sein (keine zusätzliche AgCl Niederschlag sollte zu bilden).
    4. Zentrifugieren Sie das Reaktionsgemisch 3.220 x g für 10 min und entfernen Sie die weißen Niederschlag von AgCl.
    5. Den Überstand zu sammeln und über einen 0,2 mm Spritze Filter filtern. Den Überstand für die Anwesenheit von Platin indem Sie 2-3 Tropfen der Lösung über Pasteurpipette auf SnCl2 Kristalle zu testen. Der Test ist positiv, wenn die Farbe der Koordinate Komplex von Zinn mit Platin dunkel gelb/Orange ist.
    6. Verwenden Sie den Überstand mit aktivierten Pt(II) für den zweiten Schritt.
  2. Reaktion von Ölsäure mit aktivierten Pt(II)
    1. Aussetzen von 94,2 Ölsäure (0.333 Mmol) mg in 3 mL Wasser bei 60 ° C.
    2. Fügen Sie 13,3 mg (0.333 Mmol hinzu) von NaOH in 1 mL Wasser und mischen Sie sich mit der Lösung der aktivierten Pt(II) aus Schritt 1.1
    3. Rühren Sie die Reaktion für 2 h bei 60 ° C und anschließend bei Raumtemperatur über Nacht. Das Rohprodukt ist eine ölige braun/gelben Niederschlag.
    4. Das Reaktionsgemisch 3.220 x g für 10 min Zentrifugieren und den Überstand zu entfernen. Trocknen Sie das Rohprodukt bei 25 ° C mit einer Drehverdampfer. Reinigen Sie das Produkt, indem mehrere Wäschen mit Acetonitril. Die endgültige Farbe des reinen Ölsäure acids–Pt(II) Konjugat ist hellgelb.

2. Synthese von KYF-Pt-NE und die FITC-markierte Nanoemulsion FITC-KYF-Pt-NE

  1. Synthese von KYF Tripeptid und das Eindringmittel beschrifteten Tripeptid FITC-KYF
    1. Die KYF mit standard Solid-State-Peptidchemie zu synthetisieren. Verwenden Sie den folgenden Standard Kupplung Bedingungen jede Aminosäure zu befestigen: Wang Harz (2,19 Mmol), Fmoc geschützten Aminosäure (4.38 Mmol), 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium Tetrafluoroborate (TBTU) (4.38 Mmol) und Diisopropylethylamine (DIPEA) (8,76 Mmol). Auflösen der Aminosäuren mit TBTU in Dimethylformamid (DMF) und DIPEA.
    2. 5,7 g Fmoc-L-Phe-4-Alkoxybenzyl-Alkohol-Harz (0,382 Meq/g) in 25 mL DMF für 1 h vor der Verwendung einweichen.
    3. Deprotect der Amingruppe der Aminosäure L-Phenylalanin mit 15 mL 20 % Piperidin/DMF-Lösung für 5 min, das Lösungsmittel zu verwerfen und das Waschen mit 20 min Zyklus wiederholen.
    4. Das Harz für 1 min mit folgenden Lösungsmitteln waschen: DMF, Isopropylalkohol (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. Entsorgen Sie das Lösungsmittel nach jedem Waschen.
    5. Führen Sie den Kaiser-Test um festzustellen, das Vorhandensein von freien NH2 Gruppe auf dem Harz (siehe Teilschritte) und wenn positiv (der Harz-Samen ist lila), fügen Sie die Fmoc-L-Tyrosin Aminosäure und führen Sie die Kopplung über Nacht.
      1. Bereiten Sie Kaiser Testlösungen in separate Flaschen.
      2. 5 g Ninhydrin in 100 mL Ethanol auflösen.
      3. 80 g von Phenol in 20 mL Ethanol auflösen.
      4. Mischen Sie 2 mL 0.001 M wässrige Lösung von Zyankali mit
        98 mL Pyridin.
      5. Fügen Sie 2-3 Tropfen von jedem Kaiser Lösungen für Probe und Wärme in kochendem Wasser für 5 Minuten testen.
    6. Nach erfolgreicher Kopplung der zweiten Aminosäure, die Kaiser-Test durchführen und wenn Negative Deprotection Protokoll (Schritte 2.1.3 zu 2.1.5) fortsetzen. Wiederholen Sie den Vorgang mit der Fmoc-Phenylalanin-Aminosäure.
      1. Waschen Sie bei der Kopplung von allen Aminosäuren das Harz für 1 min mit 5 mL DMF, IPA, DMF, Methanol, Dichlormethan und Diethylether, nach jedem Waschen verwerfen das Lösungsmittel. Das Harz zur Weiterverarbeitung zu speichern.
      2. Verwenden Sie die Hälfte des Harzes für die nächsten Schritte (2.1.7-2.1.9) um das Peptid mit FITC ändern. Um unveränderte KYF Tripeptid zu erhalten, folgen Sie den Anweisungen ab 2.1.10.
    7. Ändern Sie die N-terminalen Aminosäure von KYF KYF-N3 mit 6-Azidohexanoic Säure. Zu diesem Zweck mix 1 g (0,382 Mmol) von KYF Wang Harz und 120,1 mg (0.764 Mmol) 6-Azidohexanoic Säure mit 245,2 mg (0.764 Mmol) aus TBTU und 197,1 mg (1.528 Mmol) DIPEA in 30 mL DMF. Rühren Sie die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur.
    8. Die Synthese von KYF-N-3 mit Propargyl Fluorescein per Klick Reaktion KYF-FITC einzuholen. Mischen Sie zu diesem Zweck 253 mg (0.097 Mmol) der KYF-N3 Wang Harz mit 3,78 mg (0.019 Mmol) CuI solide, 71,9 mg (0.193 Mmol) Propargyl Fluorescein und 2,24 mg (0.017 Mmol) DIPEA. Die Reaktion sollte seine Farbe von grün bis braun ändern.
    9. Waschen Sie nach 24 h das Harz für 1 min abwechselnd mit 5 mL DMF und IPA fünfmal, Methanol und Wasser dreimal, DMF und Wasser dreimal, und mit Dichlormethan und Diethylether dreimal. Entsorgen Sie das Lösungsmittel nach jedem Waschen.
    10. Cleave KYF-FITC oder KYF Peptid aus dem Harz mit einer Lösung aus Trifluoroacetic Säure (TFA) / Triisopropylsilane (Tipps) / h2O im Verhältnis des 95/2.5/2.5 mehr als 3 Stunden.
    11. Überstürzen Sie das rohe Peptid in einer kalten Diethylether, dreimal mit kalten Äther waschen, und dann trocknen unter Vakuum.
  2. Synthese von FITC-KYF-stabilisierten Nanoemulsion mit Pt(II) (FITC-KYF-Pt-NE) und KYF-Pt-NE
    1. 10 mg (0.0126 Mmol) der Ölsäure acids–Pt(II) Konjugat in 1,5 mL Isopropanol und Ort in einer 5 mL Spritze auflösen.
    2. Legen Sie die Spritze mit Ölsäure acids–Pt(II) Konjugat in eine Spritzenpumpe und den Fluss auf 0,1 mL/min festgelegt.
    3. Um die FITC-KYF-Pt-NE zu synthetisieren, 1 mg (0.00105 Mmol) FITC-KYF und 1 mg (0.00219 Mmol) KYF auflösen (1:2 molare Verhältnis von FITC-KYF:KYF) in 20 mL Wasser und stellen Sie die Temperatur der Lösung auf 37 ° C. Bedecken Sie die Wände des Behälters mit Alu-Folie, Immunofluoreszenz FITC Fluorophor zu vermeiden. Um dem KYF-Pt-NE zu synthetisieren, 2 mg (0.0044 Mmol) von KYF Tripeptid in 20 mL Wasser auflösen und die Temperatur der Lösung auf 37 ° C.
    4. Fügen Sie die Ölsäure acids–Pt(II) Konjugat tropfenweise zur Lösung der FITC-KYF/KYF oder KYF Tripeptid. Führen Sie diesen Schritt unter der Haube.
    5. Rühren Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur, organische Lösungsmittel verdunsten und ermöglichen die Selbstmontage der FITC-KYF-Pt-NE oder KYF-Pt-ne
    6. FITC-KYF-Pt-NE oder KYF-Pt-NE in einem zentrifugalen Konzentrator zu konzentrieren (10k MWCO), und dreimal mit 4 mL Nanopure Wasser waschen.
    7. Lagern Sie die wässrigen Lösungen von KYF-Pt-NE und FITC-KYF-Pt-NE bei 4 ° c
    8. Platin mit Atomabsorptionsspektroskopie (AAS), nach der Hersteller Handbuch48Inhalte analysieren.
      1. Die Eichkurve Platin Normen in 10 % HCl Lösung vorbereiten (effektive Reichweite für AAS liegt zwischen 100 bis 1.200 ppb (Teile pro Milliarde)).
      2. Lösen Sie 50 µL KYF-Pt-NE Lösung von Schritt 2.2 in 100 µL Aqua Regia (eine Mischung aus konzentrierter Salzsäure und Salpetersäure mit 3:1) und lassen Sie über Nacht bei Raumtemperatur. Fügen Sie 850 µL Wasser zu einem endgültigen Probenvolumen von 1 mL zu erreichen. Analysieren Sie die Probe mittels AAS. Die endgültige Säurekonzentration sollte 10 % in allen untersuchten Proben.
      3. Aufzeichnung der Lesung des Pt-Konzentration in ppb und den endgültigen Platin Inhalt in der Probe (Konto für Probenverdünnung und Ausgangsvolumen der Nanoemulsion) zu berechnen.

(3) confocal Imaging der zellulären Aufnahme von FITC-KYF-Pt-NE

  1. Samen 6 Eierstock-Krebs-Zelllinien (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G und ES2), in 4 Brunnen-Kammer konfokale Gerichte an der Dichte von 4,7 x 104 -Zellen pro Kammer und Pre-Kultur über Nacht bei 37 ° C.
  2. Nach 24 h, waschen Sie die Zellen dreimal mit Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS) und inkubieren Sie mit FITC-KYF-Pt-NE im Zellkulturmedium (siehe Schritt 6.1 für Zelle spezifische Details Linie) für 15 min bei 37 ° C.
  3. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
  4. Befestigen Sie die Zellen mit kaltem Methanol für 5 min bei-20 ° C und drei Mal mit 1 mL PBS waschen.
  5. Permeabilize der Zellen mit 1 mL 0,1 % Triton-X für 10 min bei Raumtemperatur und waschen dreimal mit 1 mL PBS.
  6. Inkubation der Zellen für 90 min mit LAMP1 Antikörper konjugiert mit Alexa Fluor 647 (1 mL) bei 01:50 Verdünnung mit PBS-Puffer bei Raumtemperatur. Als nächstes waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS.
  7. Verdünnen Sie DAPI-Stammlösung (1 mg/mL) auf 1 mg/mL in PBS. Dann fügen Sie 1 mL der verdünnten Lösung zu jeder Kammer und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS.
  8. Montieren Sie auf einer Folie mit Eindeckmedium Deckgläsern.
  9. Bild der Zellen mittels live Zelle confocal Mikroskop bei Erregung Wellenlänge von 405 nm, 488 nm und 633 nm. Die Erkennung-Parameter wie folgt eingestellt: Laserleistung von 0,2 % und nicht mehr als 1 %, Pinole 1 luftig Einheit gewinnen Meister 650-750, Digital Offset 0.
  10. Bild im imaging-Software öffnen. Unter angezeigte Bild wählen Sie Grafiken und Einfügeleiste Skala, der Maßstab für das Bild einfügen.

4. Freigabe Medikamentenstudien

  1. Führen Sie Freigabe Medikamentenstudien in PBS. Die pH-Werte der drei PBS-Puffer 7,4, 6.8 und 5.0 bzw. anpassen.
  2. 5 μL der KYF-Pt-NE in 180 μL der entsprechenden pH-PBS-Puffer verdünnen, transfer zum 3,5 kDa MWCO Mini Dialyse Tasse und Inkubation bei 37 ° C mit PBS-Puffer.
  3. Puffer aus jeweils drei Mini-Dialyse Rohre bei 2, 4, 6, 24, 48 und 140 h entfernen und die Platin-Konzentrationen von AAS zu messen. Alle Proben gemäß Schritt 2.2.8 vorbereiten, aber der letzte Band der Probe zu 500 µL anpassen.

(5) Zelle Kulturmethoden

  1. Kultur-Zelle Linien A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, TOV - 21G, ES-2 im Zellkulturmedium (DMEM) mit 10 % (A2780, CP70, SKOV-3, ES-2) oder mit 15 % (TOV - 21G, OV-90) fetalen bovine Serum (FBS), ergänzt mit L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin. Wachsen Sie alle Zellen in einer 5 % CO2und Wasser gesättigte Atmosphäre bei 37 ° C.
  2. 3 x 105 Samenzellen in jedem 96-Well-Platte und Vorkultur über Nacht für in-vitro-Inkubation Experimente. Bereiten Sie die KYF-Pt-NE, Cisplatin und Carboplatin Lösungen in Wasser. Passen Sie die Konzentration der Pt(II) im KYF-Pt-NE um die Konzentration von Carboplatin und Cisplatin für jede Zelllinie zu entsprechen. 72 Stunden bei 37 ° c inkubieren
  3. Bewerten Sie nach der Inkubation die zelluläre Lebensfähigkeit mit einer kolorimetrischen Assay (Zellproliferation MTT-Assay). Kurz, entfernen Sie Medium zu, und fügen Sie 110 μl 10 % MTT in Medium zu jedem gut und 2 h bei 37 ° c inkubieren Dann 100 μL Waschmittel in jede Vertiefung und 5 h bei 37 ° c inkubieren
  4. Überprüfen Sie die Extinktion bei 570 nm mit Platte Leser. Analysieren Sie Ergebnisse mit statistischer Analyse mit Z-Test und P-Test.

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Representative Results

Vertreter TEM Bild von KYF-Pt-NE unter Verwendung dieses Protokolls ist in Abbildung 2Adargestellt. KYF-Pt-NEs sind sphärische Morphologie, gut verteilt, und einheitlich in der Größe. Der Kerndurchmesser des KYF-Pt-NEs, gemessen direkt von drei TEM Bilder mit einem Minimum von 200 Messungen durchgeführt, ist 107 ± 27 nm. Die hydrodynamische Durchmesser von KYF-Pt-NE, mit dynamischen Licht Spektroskopie (DLS), analysiert erwies sich 240 nm mit einem Polydispersität Index von 0.156. Das Zeta-Potential von KYF-Pt-NE im Wasser wurde für drei unabhängige Synthesen mit dem Durchschnittswert des-60.1 bestimmt mV. Das hohe Ausmaß des Potenzials zeigt gute kolloidalen Stabilität der Formulierung und die negative Oberflächenladung wird ionisiertes COO– Oberflächengruppen Ölsäure Säuren zugeschrieben. Der isoelektrischen Punkt KYF ist 8.59, und es ist daher positiv geladen bei neutralem pH-Wert.

Die Fähigkeit der hochdosierter, überqueren die Zellmembran war mit Eindringmittel beschrifteten FITC-KYF-Pt-NE und Eierstock-Krebs-Zelllinien untersucht. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2 bdargestellt. Es ist deutlich erkennbar, dass FITC-KYF-Pt-NEs (grün) in das Zytosol verteilt sind aber noch nicht mit Lysosomen (rot) verbunden waren. Dieses Ergebnis zeigt, dass KYF-Pt-NEs Zellen eindringen und als intrazelluläre Medikament Lieferfahrzeug dienen können.

Die Stabilität der KYF-Pt-NEs und FITC-KYF-Pt-NEs wurde mit DLS bewertet. Der Durchmesser des hochdosierter im Wasser wurde über mehrere Monate hinweg gemessen und die Ergebnisse sind in Abbildung 3dargestellten. Der hydrodynamische Durchmesser der beiden Formulierungen langsam erhöht, während 4 Monaten eingelagert, bis 320 nm (KYF-Pt-NE) und 240 nm (FITC-KYF-Pt-NE), aber die nanoskaligen Dimensionen blieben erhalten. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die KYF Tripeptid effektiv hochdosierter über lange Zeiträume hinweg stabilisiert.

Die Pt(II) Kapselung Effizienz und Entlassung aus der Nanoemulsion wurden mit AAS gemessen. Die Pt(II)-Konzentration im KYF-Pt-NE wurde gegründet, um 10 wt.% werden. Die Pt(II) Entlassung aus KYF-Pt-NE bei pH 7,4 (physiologischen), 6,8 (des Tumors Interstitium)49und 5.0 (Endosomal)50 ist in Abbildung 4Apräsentiert. Die Pt(II) Version ist der langsamste bei pH 7.4 mit nur 20,8 % von Pt(II) nach 4 h, freigegeben, während bei pH 6,8 und 5.0 die Veröffentlichung 32,8 % und 47,5 %, bzw. war. Die gleiche Tendenz nach 24 h und nach 6 Tagen. Dieses Ergebnis zeigt, dass Pt(II) Entlassung aus dem KYF-Pt-NE pH-abhängig ist, und es kann in die systemische Zirkulation verzögert, und beschleunigt, sobald die hochdosierter in Tumor translozieren.

Die biologische Aktivität von KYF-Pt-NE in-vitro-mit der gleichen Eierstockkrebs Zelllinien in der bildgebenden gegründet. Die Zellen wurden mit KYF-Pt-NE für 72 h, bei entsprechenden IC50 für jede Zelllinie KYF-Pt-NE-Konzentrationen inkubiert. Die Tragfähigkeit wurde anhand des MTT-Tests und die Ergebnisse waren im Vergleich zu nur Zellen, KYF-NE, Ölsäure acids-Pt(II) Konjugat, Carboplatin und Cisplatin. Die Ergebnisse der biologischen Aktivität von KYF-Pt-NE sind in Abbildung 4 bdargestellt. KYF-Pt-NE reduziert bzw. die Lebensfähigkeit der isogenen Zelllinien A2780 (Pt empfindlich) und CP70 (Pt resistent) um 44,3 % und 46,2 %. Carboplatin, die klinisch relevanten analog, verringerte sich die Lebensfähigkeit von 18,5 % (A2780) und nur 9,6 % (CP70). Der gleiche Trend der größere KYF-Pt-NE Wirkung auf Zelltod wurde über andere Zell-Linien beobachtet. Die Lebensfähigkeit der empfindlichen Pt(II) TOV - 21G-Zellen wurde von 55,9 % nach Inkubation mit KYF-Pt-NE, reduziert, während Carboplatin führte die Lebensfähigkeit von nur 16,5 % zu senken. Im OV-90 Zellen mit zwischen-Pt(II) Widerstand wurde die Lebensfähigkeit von 55,3 % (KYF-Pt-NE) und 23,9 % (Carboplatin) gesenkt. Die zwei beständig Krebszelllinien, ES-2 und SKOV-3, zeigten Reduktion Lebensfähigkeit von 45,9 % und 54,3 % bzw. KYF-Pt-NE und 10,3 % (ES-2) und 16,8 % (SKOV-3) für Carboplatin.

Die biologische Aktivität von KYF-Pt-NE gegen Cisplatin wurde auch verglichen. Cisplatin ist der Pt II-basierte Agent der ersten Generation, die nicht mehr in der Klinik aufgrund seiner Toxizität Profil51begünstigt wird. In beiden Zelllinien, SKOV-3 und TOV - 21G, war die Lebensfähigkeit Reduktion um 15 % und 40 % größer bzw. für KYF-Pt-NE als Cisplatin. In den verbleibenden Zelllinien die Aktivität von KYF-Pt-NE war vergleichbar mit Cisplatin (A2780, CP70, OV-90) oder geringfügig niedrigere (ES-2). Die Ölsäure acids-Pt(II) Konjugat wurde auch gefunden, um biologisch aktiv zu sein. Allerdings zeigten KYF-Pt-NE höhere Reduktion Lebensfähigkeit als das Konjugat in Mehrheit der Zelllinien getestet, was die Bedeutung des Nanoformulation in Pt(II) Aktivität.

Die biologische Anwendungen der nanopartikulären Systeme erfordern Stabilität in biologisch relevanten Medien, damit die Stabilität der KYF-Pt-NE wurde in 20 % fetalen bovine Serum (FBS) ausgewertet und die Ergebnisse sind in Abbildung 4dargestellt. Wir haben keine Hinweise auf KYF-Pt-NE Opsonization im Serum nach einem Tag der Inkubation festgestellt.

Figure 1
Abbildung 1: Die Komponenten der hochdosierter (oben) und schematische Darstellung der Nanoemulsion Vorbereitung (unten). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: TEM Bild KYF-Pt-NE (A) und confocal Mikroskopbilder von FITC-KYF-Pt-NE (grün) Aufnahme von Eierstockkrebs Zellen (Kerne sind blau und Lysosomen sind rot) (B). Maßstabsleisten sind 10 μm. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Bioconjugate Chemie 2018, 29, 2514-2519 angepasst. 46 Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Stabilität der KYF-Pt-NE und FITC-KYF-Pt-NE im Wasser. Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert und die Standardabweichung von N = 3 und p <0,005. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Bioconjugate Chemie 2018, 29, 2514-2519 angepasst. 46 Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. KYF-Pt-NE Stabilität und biologische Aktivität. (A) Pt(II) befreien KYF-Pt-NE in PBS-Puffer in verschiedenen pHs (PBS, 37 ° C). Zelluläre Lebensfähigkeit der verschiedenen Eierstock-Krebs-Zell-Linien nach 72 h Inkubationszeit mit KYF-Pt-NE (B). Jede Spalte entspricht dem Mittelwert und Standardabweichung von N = 3 und p <0,005. Die Konzentrationen sind konstant in jede Zelllinie und sind wie folgt: 4,92 mM (A2780), 8,80 mM (CP70), 2,46 mM (TOV - 21G), 9,84 mM (SKOV3), 7,38 mM (ES-2), 19,7 mM (OV-90). Die Konzentration von KYF-Pt-NE und Ölsäure acids–Pt(II) Konjugat wurde gemessen an AAS Pt(II) inhaltlich angepasst. Abkürzungen: "Carbpt" – Carboplatin; "KYF-NE" – KYF Tripeptid-beschichtete Nanoemulsion; "KYF-Pt-NE" – KYF Tripeptid-beschichtete Nanoemulsion mit Pt(II); Cispt – Cisplatin; PT-Ölsäure – Ölsäure acids–Pt(II) konjugiert. (C) KYF-Pt-NE Stabilität im Serum. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Bioconjugate Chemie 2018, 29, 2514-2519 angepasst. 46 Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Wichtige Schritte bei der Nanoemulsion Synthese gehören das molare Verhältnis der Substrate anpassen, Erhaltung Temperatur und Durchflussmenge Tarifsteuerung während Ölsäure acids–Pt(II) Zugabe und ausreichend Zeit für die Selbstmontage und Reinigung das Produkt mit einer zentrifugale Konzentrator Spalte. Diese Parameter beeinflussen die Größe und Morphologie der KYF-Pt-NE; Daher ist es besonders wichtig, das richtige molare Verhältnis pflegen und die synthetischen Bedingungen korrekt einstellen.

Das Verhältnis der Substrate während der Nanoemulsion Synthese (Schritt 3) ist von entscheidender Bedeutung für die Selbstmontage Prozess- und bestimmt die endgültige Größe des Produkts. KYF, Ölsäure acid-Pt(II) molare Verhältnis ist 1:3, und die optimale Konzentration von KYF Tripepide im Wasser ist 0,2 mM. Darüber hinaus muss der organische Lösungsmittel verwendet, um die Ölsäure acid-Pt(II) Konjugat in Schritt 3.1 auflösen mischbar mit Wasser, kompatibel mit der Filteranlage und Verdunstung leicht bei Raumtemperatur.

Die entscheidenden Schritte gehört die tropfenweise Zugabe von Ölsäure acid-Pt(II) Konjugat KYF-Lösung (Schritt 3.4). Die Strömung sollte nicht langsamer als 0,1 mL/min und nicht schneller als 0,2 mL/min, weil eine Sub-optimale Geschwindigkeit die Ausfällung von der Nanoemulsion induzieren kann. Auch sollten die KYF-Lösung bei 37 ° C die Ölsäure acids–Pt(II) Konjugat hinzugefügt werden, rühren Sie die Mischung auf einen Teller Rühren bei 600 u/min. Sobald alle die Ölsäure acid-Pt(II) hinzugefügt wurden, sollte die Lösung bei Raumtemperatur und der Rührgeschwindigkeit bis 150 u/min reduziert gehalten werden. Schritt 3.5 sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Der optimale Zeitpunkt für die Selbstmontage KYF-Pt-NE (Schritt 3.5) beträgt 24 Stunden.

Besteht die Gefahr, die das Produkt herbeiführen kann, während der Nanoemulsion Pre konzentriert ist. Daher empfiehlt es sich, dass die Nanoemulsion vor zentrifugiert werden, in einem zentrifugalen Konzentrator mit zusätzlichem Wasser verdünnt und nicht schneller als 2.465 X ggesponnen. Verdünnte hochdosierter der zentrifugalen Konzentrator auf Aliquote zwischen den Spins hinzugefügt werden, und die Nanoemulsion sollte im Filter gemischt werden, bevor der nächste Teil hinzugefügt wird.

Die Fähigkeit, Form hochdosierter mit Fettsäuren Derivate als Ölsäure nicht getestet wurde und ist noch nicht bestimmt werden. Zukünftige Anwendungen umfassen die Verwendung von verschiedenen Peptiden, die Co Montage mit Ölsäure zu erleichtern. Ölsäure Konjugate mit Platin-basierten Medikamenten können auch als mögliche Kerne von hochdosierter verwendet werden.

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Disclosures

Autoren müssen kein Interessenkonflikt besteht, offen zu legen.

Acknowledgments

Gewähren Sie wir dankbar anerkennen, finanziellen Unterstützung durch das National Cancer Institute SC2CA206194. Keine finanziellen Interessenkonflikte werden erklärt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring

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Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).

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