Summary
该协议的目的是标记、丰富和识别复杂生物样品 (如细胞裂解物或组织均质) 中的蛋白激酶 ck2 底物。此方法利用 ck2 生物学的独特方面来实现这一目的。
Abstract
对激酶-底物关系的研究对于全面了解这些酶及其下游目标在生理和病理状态下的功能至关重要。ck2 是一种进化保守的血清/苏氨酸激酶, 在多个细胞过程中含有越来越多的数百种底物。由于其各向异性的特性, 识别和表征一套完整的 ck2 基板特别具有挑战性, 仍然是研究这一重要酶的一个障碍。为了应对这一挑战, 我们设计了一种通用的实验策略, 能够有针对性地丰富和识别假定的 ck2 基板。该协议利用了 ck2 独特的双基底物特异性, 允许其底物在细胞或组织裂解液中进行特定的硫代磷酸化。这些底物蛋白随后被烷基化, 免疫沉淀, 并通过液相色谱-串联质谱 (lc-msn) 进行鉴定。我们以前使用这种方法成功地识别 ck2 底物从嗜酸性粒细胞卵巢, 在这里我们扩大了该协议的应用, 人类胶质母细胞瘤细胞, 说明了这种方法的适应性, 以研究这种激酶在各种模型生物和实验系统中的生物学作用。
Introduction
蛋白激酶是信号转导级联的关键成分。这些酶对底物蛋白的磷酸化产生生物反应, 调节控制细胞分裂、代谢和分化等关键事件的关键事件。ck2 是一种普遍表达的嗜酸性血清-苏氨酸激酶, 从酵母保存到人类, 在许多细胞过程中发挥着重要作用, 从转录调节到细胞周期进展到细胞凋亡1 ,2,3。酶是由两个催化α (或α ') 亚基和两个调节β亚基4组成的异体体.ck2 除了具有高度的增压外, 还表现出另外两个使其分析复杂化的不寻常特征, 即本构活性5和双共底物特异性 6。后一种特性赋予 ck2 使用 gtp 以及 atp 对底物蛋白进行磷酸化的能力。
小鼠 ck2 催化或调控亚基的遗传缺失导致胚胎死亡, 表明其在发育和器官发生过程中起着至关重要的作用7,8。ck2 在几种癌症中也有过度表达, 因此是一个很有希望的治疗目标9、10、11.事实上, 目前正在为此目的研究针对 ck2 激酶活性的特定抑制剂12、13、14.虽然抑制 ck2 是一个可行的选择, 但鉴于其多向异性, 另一种也许更合理的办法是针对某些癌症进展的关键 ck2 基板。因此, ck2 底物蛋白的综合鉴定和鉴定对于阐明这种激酶在特定组织或肿瘤类型中的特异性功能将具有重要意义。
在这里, 我们描述了一种通用的生化方法, 用于识别 ck2 底物从复杂的生物样本, 如细胞或组织裂解液。该协议利用 ck2 的双共底物特性, 利用 gtp 模拟 gtpγs (鸟苷 5 '-[γ-thio] 三磷酸), 而其他内源激酶不能使用。这有效地允许激酶在此样本中 "标记" 其底物, 以便随后进行隔离和识别。
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Protocol
注: 确保所需材料可用并做好适当准备 (参见材料表)。
1. 准备工作
- 机械裂解组织样本 (1-2mg 的组织在100μl 的裂解缓冲液,表 1) 或培养的细胞 (10 厘米板, 在350μl 的裂解缓冲液中融合), 目标是为实验收集总共900μl 的样本。请注意, 此卷稍有超出下面描述的实验所需的内容。
- 在4°c 条件下, 以 17, 500 x克的离心速度将样品向下旋转3分钟。完成后, 将270μl 的上清液转移到三个新的 1.7 ml 微离心管中的每一个管。将剩余约90μl。取出40μl 作为 "输入控制", 放置在新的管中。将所有样品放在冰上。
2. 激酶测定: 硫代磷酸和烷基化
- 标记三个管, 每个含有 270μl, 如下所示: "激酶 rxn"、"仅限 gtpγs" 和 "仅限 pnbm (对苯二甲酸二硝基苯甲酯)"。准备激酶反应。
- 在 "激酶 rxn" 管中, 加入 2.7μl (相当于 1, 350 u) 的 ck2, 然后加入2.7μl 的 2.5 mm gt2ms2s。
- 在 "仅 gtpγs" 管中, 加入2.7μl 的 2.5 mm gtpγs, 然后加入2.7μl 的裂解缓冲液。
- 在 "仅 pnbm" 管中, 加入5.4μl 的裂解缓冲液。轻拍所有的管子混合, 然后立即放在冰上。
- 在30°c 的水浴中将所有三个管培养1分钟。孵育后, 在所有三个管中加入13.5μl 的 12 mgml pnbm。反转以混合样品。在室温下将这些样品培养1小时。
- 在步骤2.2 中开始孵育后, 尽快准备脱盐柱, 因为该过程大约需要45分钟。
3. 脱盐柱的制备
- 最初准备列 (3 为本示例实验), 通过反转每列几次, 以重新悬挂 Sephadex g-25 树脂在存储缓冲液。允许树脂通过将每个柱连接到夹具支架上, 让其不受干扰地坐5分钟左右来沉淀。
- 在 Sephadex g-25 树脂沉淀后, 从柱的顶部和底部取下瓶盖, 使储存缓冲液通过重力排出, 并在底部开口下方放置一个管, 以收集流经以丢弃。
- 一旦存储缓冲区耗尽, 添加约 2.7 ml 的裂解缓冲区, 以平衡列。收集流经并丢弃。重复3次。经过最后的平衡, 这些列已准备好执行4.1 步。
4. 删除 pnbm
- 1小时孵育 (步骤 2.2) 和列准备 (步骤 3) 完成后, 将样本应用于列。每列的标签如下: "激酶 rxn"、"仅限 gtp2ms" 和 "仅 pnbm"。将所有示例加载到其各自的列中。收集和丢弃流通。
- 在每根柱中加入420μl 的裂解缓冲液来清洗样品。允许裂解缓冲区在列中进行筛选, 并收集流经以进行丢弃。在这一清洗步骤之后, 放置管道以收集样品。
- 通过在每根柱中加入500μl 的裂解缓冲液来洗脱样品。收集现在含有硫代磷酸化和烷基化 ck2 基板的流动。
5. 免疫沉淀: 第一部分
- 通过首先从步骤4.3 中收集的 "洗脱输入控制" 样品 ("激酶 rxn"、"仅 gtpm2ns" 和 "仅 pnbm") 中取出 80μl, 为免疫沉淀准备样品。从每个样品中取出80μl 后, 每个样品将剩余约420μl。
- 将每个样品分成2个管, 每个管包含200μl。标签各自的管: "激酶 rxn 抗硫代磷酸盐酯", "激酶 rxn igg", "gtpγs 抗硫代磷酸盐酯", "gtpγs igg", "pnbm 抗硫代磷酸盐酯", 和 "pnbm igg"。
- 在每个抗硫代磷酸盐酯标记管中加入2.8 微克的抗硫代磷酸盐酯抗体, 在每个 igg 标记管中加入2.8 微克的同型控制抗体。在4°c 的旋转器上放置管2小时。
- 在步骤5.2 中2小时孵育的最后15分钟内开始制备蛋白质阿比珠。
6. 蛋白质阿格琼脂糖珠制剂
- 在存储管中创建简单的旋回, 以确保珠子完全重新悬浮。使用干净的剃须刀刀片切断 p200 移液器尖端的末端, 以增加仪表尺寸。将每个免疫沉淀的珠浆的皮瓣100μl 放入新的 1.7 ml 微离心管中。在本例中, 总共需要6个管。
- 在4°c 条件下, 以 17, 500 x克离心管1分钟。取下上清液, 丢弃。在200μl 的裂解缓冲液中重新悬浮珠子, 并短暂地产生涡流。重复旋转和清洗步骤3次。
- 最后清洗后, 将珠子放在冰上, 直到步骤5.2 中的孵化完成。
7. 免疫沉淀: 第二部分
- 从步骤5.2 开始2小时孵育后, 在4°c 下, 以 17, 500 x克的速度将样品旋转3分钟。离心后, 用清洗过的珠子从每个样品中加入200μl。将管放在4°c 旋转器上1小时。
- 孵育1小时后, 在4°c 下, 以 17, 500 x克的离心机1分钟。下一步从每个样品中去除40μl 的上清液, 并保存为 "消耗控制" (共6个管)。取出剩余的上清液并丢弃。注意不要打扰珠子。
- 加入200μl 的裂解缓冲液, 并进行短暂的涡流处理, 对样品进行清洗。然后在 17,500 x克离心, 在4°c 下1分钟。取下上清液, 丢弃。重复清洗和旋转步骤3次。在这些步骤中, 请注意不要打扰珠子。
- 完成清洗步骤后, 在每个含有珠子的样品中添加50μl 的2x 样品缓冲液。对于所有其他样品, 添加8μl 的6x 样品缓冲区: "输入控制"、"洗脱输入控制" 和 "损耗控制"。
- 一旦缓冲液被添加到管中, 向上和向下的移液混合, 并在95°c 加热所有样品 5分钟, 然后再进行 sds-page。
8. 分析/结果的验证
- 验证成功的 ck2 依赖性硫代磷酸化和烷基化。
- 为了确定 ck2 介导的硫代磷酸化在步骤2.2 中的有效性, 在12.5% 的聚丙烯酰胺凝胶上运行步骤5.1 中收集的 "洗脱输入控制" 15-20μl, 执行 sds-page 和西部印迹。
- 具有以下抗体的探针膜: 抗硫代磷酸盐酯、抗 ck2α和抗 gapdh (或其他适当的负载控制)。如果这一步骤成功, 增强的抗硫代磷酸盐酯信号应该是明显的在 "激酶 rxn" 车道相比, 其他两个车道 (图 2)。
- 可视化 ck2 的浓缩底物, 确定蛋白质的同一性。
- 要评估免疫沉淀步骤是否成功, 请在单独的12.5% 聚丙烯酰胺凝胶上运行步骤7.4 中从珠子中洗脱的样本的25-30μl。确保所有设备清洁, 并在此步骤中始终戴手套, 以最大限度地减少污染。
- 用 Coomassie 染色凝胶, 以显示实验方案各个阶段的浓缩蛋白质 (图 3)。使用新的剃须刀片, 仔细切除存在于 "激酶 rxn 抗硫代磷酸盐酯 ip" 车道上的独特带, 并注意到它们的大致分子量。
- 用液相色谱-串联质谱 (lc-msms) 提交这些波段进行蛋白质鉴定 (图 4)。如果有针对已识别蛋白质的抗体, 请通过 sds-page 进行质谱分析的结果, 并在协议过程中收集的输入、耗尽和 ip 分数的免疫印迹 (图 4)。
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Representative Results
图 1提供了实验过程的示意图。该技术的基础是 ck2 在磷基转移中使用 gtp 的异常能力。在外源 ck2 全酶与 gtp 类似物 gtpγs 一起添加到细胞裂解液中, 可导致内源性 ck2 底物的硫代磷酸化。随后用烷基化试剂对苯甲磺酸对硝基苯 (pnbm) 处理裂解液, 在这些特定底物蛋白上生成硫代磷酸酯, 然后使用抗硫代磷酸酯抗体进行免疫沉淀并最终通过质谱技术进行鉴定。图 2显示了 ck2 和 gtpγs 加入 t98g (胶质母细胞瘤) 细胞裂解液后的阳性结果。这些结果表明, ck2 依赖性硫代磷酸化和随后的烷基化反应是成功的。正如所料, 只有在含有完整激酶反应的车道上, 而不是在仅经过处理的 gtpγs 和 pnbm 样品中, 才观察到西方印迹增强的抗硫代磷酸盐酯信号。图 3中显示的是在存在或不存在多余的 ck2 和/或 gtp2mss 的情况下使用异型控制 igg 或抗硫代磷酸盐酯抗体的免疫沉淀和洗脱蛋白的库马西蓝染色凝胶。这些数据还显示了一个积极的结果, 因为多个独特的带只在抗硫代磷酸盐酯 ip 车道上是显而易见的, 在该通道中, 裂解液是用外源 ck2 和 gtpγs 孵育的。用星号表示的带从凝胶中切除, 并通过质谱进行蛋白质鉴定。图 4显示了通过质谱分析获得的代表性数据, 包括蛋白质识别、覆盖率百分比以及在波段内每个蛋白质识别的独特肽的数量。显示的是提交波段的前10位命中 (图 3) 以及有关该蛋白质以前是否已被确定为 ck215、16、17的底物的信息。sds-page 证实了已知免疫沉淀的 ck2 基板之一----核苷15----的同一性, 并利用抗核苷抗体对所指示的组分进行免疫印迹。
图 1: 实验策略示意图.gtp 类似物 gtpγs 与多余的重组 ck2 全酶一起被添加到细胞或组织裂解液中, 并允许通过 ck2 而不是由其他内源性激酶对底物进行硫磷化。硫磷化底物与 pnbm 进行了下烷基化处理, 在这些蛋白质上生成硫代磷酸酯部分, 然后通过免疫沉淀 (ip) 捕获, 以便随后通过液相色谱-串联质谱 (LC-MSMS)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 验证 ck2 依赖硫代磷化在整个细胞裂解液中的有效性。用 t98g 细胞制备的全细胞裂解物在外源重组 ck2 全酶存在 (激酶反应) 或不存在 (gtpγs)的情况下孵育.随后, pnbm 被添加到所述反应中, 样品通过 sds-page 进行分解, 然后用所述抗体进行免疫印迹。蛋白质分子量标记在 kda 中表示。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 假定的 ck2 基板蛋白的免疫沉淀.在使用抗硫代磷酸盐酯抗体进行免疫沉淀后, 假定的 ck2 基板 (第三车道) 的浓缩和可视化表现为多个独特带。用 sds-page 测定免疫沉淀, 用库马西蓝染色凝胶。用星号标记的带从凝胶中切除, 并通过质谱进行蛋白质鉴定。蛋白质分子量标记在 kda 中表示。ip = 免疫沉淀。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 体外蛋白质作为 ck2 底物的鉴定和确认.质谱分析获得的数据表明, 利用该实验方法对先前已知的15、16、17以及假定的新型 ck2 基板进行了鉴定。显示的是从切除带 (上图) 中识别出来的十大蛋白质。核蛋白, 一个已知的 ck2 底物, 通过免疫印迹的指示分数使用反核蛋白抗体 (底部) 确认。蛋白质分子量标记在 kda 中表示。ip = 免疫沉淀。请点击这里查看此图的较大版本.
| 试剂库存浓度 | 试剂最终浓度 | 根据库存集中度添加的示例卷 |
| 1 m tris ph 值7。4 | 20.0 mm | 200μl |
| 4 m 氯化钠 | 20.0 mm | 50μl |
| 20% triton x-100 | 0.50 | 250μl |
| 1 m mgcl2 | 10.0 毫米 | 100μl |
| 1 m dtt | 50万米 | 5μl |
| 200 mmna 3 vo4 | 1.0 mm | 50μl |
| 500 mm naf | 10.0 毫米 | 200μl |
| 500 mm β-甘油磷酸盐 | 10.0 毫米 | 200μl |
| h2o | 8.945 毫升 | |
| + 1 coplete mini tab\ 10 ml | 1片 |
表1。裂解缓冲配方(10 毫升, 1x)。
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Discussion
在这里, 我们描述了一种相对简单的生化方法来识别复杂生物样本中的蛋白激酶 ck2 底物。该协议的关键步骤是基于 ck2 的不寻常酶特性, 包括 ck2 依赖硫代化特定底物蛋白使用 gtp γ-s 及其随后的免疫沉淀和鉴定。通过这些结果, 我们已经证明了这种方法的效用和多功能性, 因为我们现在已经将这一策略应用于人类胶质母细胞瘤细胞和食子细胞瘤卵巢18。
以前发表的一些使用定量磷蛋白组学方法的研究确实证明了成功地识别了新的 ck2 底物19,20,21, 22, 23. 然而, 其中一些战略使用固定化底物阵列, 固定化蛋白的构象有可能使激酶无法进入潜在的磷酸化位点。这里描述的技术允许在更多的生理或本地环境 (即细胞裂解物) 内进行磷酸化, 从而降低了现场无法进入的可能性。这种策略的另一个好处是, 一旦通过质谱法确定蛋白质识别, 如果抗体指向底物, 则可以很容易地对过程中采集的样品进行假定的 ck2 基板的验证有兴趣的蛋白质。例如, 使用标准的西方印迹, 人们应该观察到耗尽 (ip 后) 样本中相关蛋白质水平的降低, 以及它在抗硫代磷酸盐酯免疫沉淀剂中的存在, 正如我们已经为已知的 ck2 所证明的那样基材核蛋白 (图 4)。
这种方法的一个显著局限性是, 质谱分析之前的程序的最后一步依赖于识别凝胶上条带图案的离散差异的能力。因此, 如果特定的 ck2 基板的丰度较低, 因此低于视觉检测的极限, 则肯定有可能会漏掉这些基板。如果人们担心这种可能性, 可以使用银染色等更敏感的方法来可视化这些蛋白质, 而不是使用库马西蓝色。另一个应该承认的考虑因素是, 一些 ck2 基板可能无法使用这一战略来确定, 因为生理相关的位点将在体内进行磷酸化。考虑到 ck2 的构成活动, 情况几乎可以肯定。最后, 还应该指出的是, 这种方法只确定蛋白质作为假定的底物的 ck2 在体外。随后的检测, 以验证这些是生理上相关的底物的 ck2 在体内是必需的, 应包括识别 ck2 依赖磷酸化位点, 并评估这些特定残留物的磷酸化是否为改变, 以响应对 ck2 激酶活性的操纵。
总之, 该策略与下游实验方法 (通过截断-删除分析进行磷酸化站点映射、站点定向诱变、体外功能和体内检测等) 相结合, 将有助于研究这种不寻常的激酶, 将增加我们对 ck2 在多个生物系统中所扮演的各种角色的理解。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了宾夕法尼亚州卫生部向 t. i. s. 提供的英联邦普遍研究增强赠款的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
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