Summary
このプロトコルの目的は、ラベル、豊かにする、および特定蛋白質キナーゼ CK2 細胞ライセートや組織ホモジネートなど複雑な生物的サンプルからの基板です。このメソッドは、この目的のため CK2 生物のユニークな側面を活用しています。
Abstract
キナーゼ基質の関係の研究は生理と病態におけるこれらの酵素とその下流の機能の完全な理解を得るために不可欠です。CK2 は複数の細胞プロセスに関与する基板の何百もの成長のリストに進化上保存されたセリン/スレオニン キナーゼです。その多面プロパティのため抽出と定量化 CK2 基板の包括的なセットは特に挑戦されているし、この重要な酵素の研究でハードルのまま。このような課題に対処するため、我々 は、ターゲットの濃縮と推定 CK2 基板の識別を可能にする汎用性の高い実験的戦略を考案した.このプロトコルは、ライセートその基質細胞または組織の特定の thiophosphorylation を可能にする CK2 のユニークな二重共同基質特異性の活用します。これらの基質タンパク質がその後は、アルキル化、沈澱と液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法 (MS/LCMS) によって識別されます。我々 はショウジョウバエ卵巣から CK2 基板を正しく識別するこのアプローチを使用している以前とここで我々 は調査方法の適応性を示すひと膠芽腫細胞にこのプロトコルのアプリケーションを拡張、各種のモデル生物・実験システムにおけるこのキナーゼの生物学的役割は。
Introduction
蛋白質キナーゼはシグナル伝達カスケードの主要なコンポーネントです。これらの酵素による基質タンパク質のリン酸化は細胞分裂、新陳代謝および他の中の分化を制御する重要なイベントを調節する生体反応を引き出します。CK2 は普遍的表現、好酸性セリン/スレオニン ・ キナーゼ人間に酵母から保存されているが、転写制御からアポトーシス1 細胞周期の進行に至るまで多くの細胞プロセスで重要な役割を果たしています。、2,3。酵素は 2 つの触媒 α で構成される heterotetramer (または α') サブユニットと 2 つの規制 β サブユニット4。高い, だけでなく、CK2 の特徴 2 他珍しいその分析を複雑にするすなわち、構成活動5と二重共同の基質特異性6。この後者のプロパティは、基質タンパク質のリン酸化のため ATP と同様に GTP を使用する能力を持つ CK2 を与えます。
マウス CK2 の触媒作用または規制のサブユニットの遺伝子の欠失は、開発と器官形成7、8時に重要な役割を果たしていることを示す胚性致死の結果します。CK2 は癌のいくつかの種類の過剰発現も、従って有望な治療上のターゲット9,10,11を表します。確かに、特異的阻害剤そのターゲット CK2 キナーゼ活動現在調査中ですこの目的12,13,14。一方、CK2 の阻害は, 本来の代わりを与え、可能なオプションと、おそらくより合理的なアプローチはある特定の癌の進行の根底にある重要な CK2 基板を対象とするでしょう。したがって、包括的な同定と CK2 基質タンパク質の機能解析は特定の組織や腫瘍の型の中でこのキナーゼの特定の機能を解明するための重要な利点のでしょう。
ここでは、細胞や組織ライセートなど複雑な生体試料から CK2 基板を識別するため多彩な生化学的手法について述べる。このプロトコルを用いて GTP アナログ GTPγS (その他の内因性のキナーゼを使用ことはできませんグアノシン 5'-[γ-thio]triphosphate) CK2 のデュアルの共同の基質特異性の活用します。これにより、このサンプルに後続の分離と同定のための基板を「ラベル」としてキナーゼ。
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Protocol
メモ: は、必要な材料は、使用可能な適切に準備を確認 (材料の表を参照してください)。
1. 準備
- 機械的に組織サンプル (表 1の換散バッファーの 100 μ L の組織の 1-2 mg) を溶解または培養細胞 (換散バッファーの 350 μ L で 80-90% の合流は、10 cm プレート)、実験用サンプルの 900 μ L の合計を収集することを目標とします。このボリュームは、以下の実験に必要なをわずかに超えることに注意してください。
- 4 ° C で 3 分間 17,500 × gで遠心分離によってスピン ・ ダウン サンプル完了すると、3 つの新しい 1.7 mL の遠心管のそれぞれに上澄みの 270 μ L を転送します。残り約 90 μ L があります。「入力コントロール」と新しい管の場所として使用される 40 μ l を削除します。氷の上には、すべてのサンプルを配置します。
2. キナーゼ試金: thiophosphorylation およびアルキル化
- ラベルを次のように各 270 μ L を含む 3 つの管:「キナーゼ rxn」、「GTPγS だけ」と「PNBM (p nitrobezyl メシル酸) だけ」。キナーゼ反応を準備します。
- 「キナーゼ rxn"チューブ CK2 の 2.7 μ L (1,350 U に相当) を追加し、2.5 mm GTPγS 2.7 μ L を追加。
- 「GTPγS だけ」管に 2.5 mm GTPγS、2.7 μ l を追加し、、換散バッファーの 2.7 μ L を追加。
- 「PNBM だけ」管の換散バッファーの 5.4 μ l を追加します。ミックスし、すぐに氷の上に配置するすべてのチューブをフリックします。
- 30 ° C の水浴中 1 分のすべての 3 つの管を孵化させなさい。インキュベーション、次すべての 3 つの管に 12 mg/mL PNBM の 13.5 μ L を追加します。サンプルをミックスに反転します。1 時間室温でこれらのサンプルをインキュベートします。
- 手順 2.2 で孵り後、約 45 分かかる、できるだけ早く脱塩カラムを準備します。
3. 脱塩カラムの準備
- 初期ストレージ バッファー内の樹脂のセファデックス G-25 を再停止を数回各列の反転によって列 (この例の実験のための 3) の準備します。各列をクランプ スタンドに接続して、約 5 分に邪魔されずに座ることによって解決する樹脂を許可します。
- 重力によって排出し、チューブの破棄の流れを通して収集する下部開口部の下に配置を持っているストレージ バッファーを許可する列の上下両方からキャップを削除次のセファデックス G-25 樹脂の定着します。
- 記憶域バッファーがなくなると、一度列を平衡するために約 2.7 mL の溶解バッファーを追加します。フローを通じて収集し、破棄します。3 回繰り返します。次の最終的な平衡列が 4.1 のステップの準備ができています。
4. PNBM の除去
- 1 時間培養 (手順 2.2) およびコラムの準備 (ステップ 3) が完了した後は、サンプル列に適用されます。ラベルの各列を次のように:「キナーゼ rxn」、「GTPγS だけ」、「PNBM だけ」。すべてのそれぞれの列に各サンプルのロードします。収集し、流れを破棄します。
- 換散バッファーの 420 μ L を各列に追加することによってサンプルを洗います。換散バッファーの列をフィルター処理して破棄の流れを介して収集を許可します。この洗浄ステップ次サンプルのコレクションの位置にチューブを配置します。
- 換散バッファーの 500 μ L を各列に追加することによってサンプルを溶出します。今 thiophosphorylated とアルキル化 CK2 基板を含むフロースルーを収集します。
5. 免疫沈降法: 第 1 報
- 免疫沈降のそれぞれ (「キナーゼ rxn」、「GTPγS だけ」、「PNBM だけ」) それぞれ有害溶出のステップ 4.3 で収集したから「溶出入力コントロール」サンプルの最初削除 80 μ l サンプルを準備します。次の各サンプルから 80 μ L を除去した残りの 1 サンプルあたり約 420 μ L になります。
- 各サンプルを各 200 μ L を含む 2 管に分割します。各それぞれのチューブにラベルを付ける:「キナーゼ rxn 反 thiophosphate エステル」、「キナーゼ rxn IgG」、「GTPγS 抗 thiophosphate エステル」、「GTPγS IgG」、「PNBM 抗 thiophosphate エステル」、「PNBM IgG」.
- 反 thiophosphate エステル抗体抗 thiophosphate エステル ラベル チューブのそれぞれの 2.8 μ g と 2.8 μ g のアイソタイプ コントロール抗体 IgG というラベルの付いた管のそれぞれに追加します。2 h の 4 ° C で回転子にチューブを置きます。
- 5.2 の手順で 2 時間インキュベーションの最後 15 分間蛋白質 A/G ビーズの準備を開始します。
6. タンパク質 A/G アガロース ビーズ準備
- 簡単に渦ビーズを確保するためのストレージ管が完全に再懸濁です。サイズを測るきれいなかみそりの刃を使用して高めるためにピペット チップ P200 の端を切り落とします。ピペット 100 μ L の新しい 1.7 mL 遠心チューブに免疫沈降あたりビード スラリー。この例では、6 管の合計が必要です。
- 4 ° C で 1 分 17,500 x gでチューブを遠心分離します。上澄みを除去し、破棄します。再換散バッファーと簡単に渦を 200 μ l 添加でビーズを中断します。スピンを繰り返し、3 回ステップを洗浄します。
- 次の最終的な洗浄ステップ 5.2 で孵化が完了するまで氷にビーズを配置します。
7. 免疫沈降: パート II
- 4 ° C で 3 分間 17,500 x gでサンプル手順 5.2 から 2 時間培養後スピンダウンします。以下の遠心洗浄ビーズ チューブに各サンプルから 200 μ L を追加します。1 h の 4 ° C で回転子にチューブを置きます。
- 1 時間培養後 4 ° C で 1 分 17,500 x gでチューブを遠心分離します。次に各サンプルから清 40 μ L を削除し、「枯渇コントロール」として保存 (合計 6 本).上澄みと破棄の残りの部分を削除します。ビーズを邪魔しないように注意してください。
- 換散バッファーとボルテックスの 200 μ L を簡単に追加することによって、サンプルを洗います。4 ° C で 1 分 17,500 × gで遠心分離します。上澄みを除去し、破棄します。洗浄を繰り返し、3 回手順をスピンします。これらの手順の中にビーズを邪魔しないように注意してください。
- 洗浄の手順を完了すると、ビーズを含む各サンプルに 2 x サンプルバッファーの 50 μ L を追加します。その他のすべてのサンプルのサンプル バッファー x 6 の 8 μ L を追加:「入力コントロール」、「溶出入力コントロール」と「枯渇コントロール」.
- 一度バッファーは、管、ピペットで移しなさい、ミックスして SDS のページに進む前に 5 分間 95 ° C ですべてのサンプルの熱を上下に追加されます。
8. 結果の分析/検証
- 成功した CK2 依存 thiophosphorylation およびアルキル化を検証します。
- 手順 2.2 CK2 を介した thiophosphorylation の有効性を判断するには、SDS のページおよび溶出入力「統制」12.5% ポリアクリルアミドゲルで手順 5.1 で収集の 15-20 μ l を実行することによって西部しみを実行します。
- 次抗体を用いた膜プローブ: 反 thiophosphate エステル、反 CK2α、アンチ GAPDH (やその他の適切な読み込み制御)。この手順が成功した場合強化対策 thiophosphate エステル信号は 2 車線 (図 2) と比較して「キナーゼ rxn"レーンで明白なはずです。
- CK2 の濃縮と推定される基板を視覚化し、蛋白質のアイデンティティを決定します。
- 免疫沈降法の手順が成功した場合を評価するには、別の 12.5% ポリアクリルアミドゲルの 7.4 手順でビーズから溶出サンプルの 25-30 μ L を実行します。すべての機器が清潔手袋を着用を常時この手順中に汚染を最小限に抑えることを確認します。
- Coomassie のゲル染色実験的プロトコル (図 3) の様々 な段階から濃縮タンパク質を視覚化するブルー。新しい razorblades を使用して、慎重に物品税ユニークなバンドは、彼らのおおよその分子量を指摘し「キナーゼ rxn 反 thiophosphate エステル IP」レーンに存在。
- 液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法 (MS/LC-MS) (図 4) によるタンパク質の同定のためのこれらのバンドを送信します。識別された蛋白質に対する抗体がある場合入力、枯渇、SDS-PAGE による質量分析の結果、イムノブロッティングを確認、プロトコル (図 4) のコースの間に収集された IP 分数。
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Representative Results
図 1に実験手順の概略図があります。技術の基盤には、リン酸化グループ転送に GTP を使用する CK2 の珍しい機能です。ホロ酵素 CK2 外因性内因性 CK2 基板の thiophosphorylation の細胞ライセート結果 GTP アナログ、GTPγS、に沿っての追加。ライセート アルキル化試薬p- ニトロベンジル イマチニブ (PNBM) との後の治療はエステル抗 thiophosphate 抗体を用いた免疫沈降したことができますこれらの特異的基質タンパク質の thiophosphate のエステル基を生成します質量分析法による最終的に識別されました。図 2は、T98G に CK2 と GTPγS と PNBM の添加に続いて肯定的な結果を示しています (膠芽腫) 細胞ライセート。これらの結果は、CK2 依存 thiophosphorylation およびそれ以降のアルキル化が成功したことを示します。予想通り、完全なキナーゼ反作用を含む車線でのみ、GTPγS のみ - と PNBM だけ扱わサンプルではなく西部にしみが付くことによって強化された反 thiophosphate エステル信号が観察されます。沈澱と過剰 CK2 および/または GTPγS の有無でアイソタイプ コントロール IgG またはエステルの抗 thiophosphate 抗体を用いた溶出タンパク質の Coomassie 青い染色ゲルは、図 3に示します。これらのデータは、複数のユニークなバンドが、ライセートだった培養と外因性 CK2 GTPγS 抗 thiophosphate エステル IP 車線でのみ明らかにも肯定的な結果を示します。アスタリスクで示されたバンドはゲルから摘出したされ、質量分析法によるタンパク質の同定のため提出します。図 4は、タンパク質同定、パーセントのカバレッジ、およびユニークなペプチド バンド内のタンパク質あたりの数を含む質量分析によって得られる代表的なデータを示します。提出されたバンド (図 3) からのトップ 10 ヒットは、CK215,16,17の基板としてタンパク質が以前発見されたかどうかに関する情報。ヌクレオリン15、知られている沈澱 CK2 基板の一つのアイデンティティは、SDS-PAGE および反ヌクレオリン抗体を使用して指定された分数のによって確認されました。
図 1: 実験的戦略の概略図。GTP アナログ GTPγS、余分な組換え CK2 ホロと共に細胞や組織ライセートに追加され、CK2 がないその他の内因性のキナーゼ基板の thiophosphorylation ことができます。Thiophosphorylated 基板、PNBM、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法 (その後識別のため免疫沈降法 (IP) 経由でキャプチャされたこれらの蛋白質の thiophosphate のエステル基を生成すると次にアルキル化します。LC-MS/MS)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 全細胞ライセートの CK2 依存性 thiophosphorylation の検証です。全体のセル lysates T98G 細胞から調製した存在 (キナーゼ反応) の有無 (GTPγS のみ) 外因性組換え CK2 ホロ酵素の GTPγS 培養しました。PNBM が指定された反応に追加された後、サンプルは、SDS-PAGE と示された抗体を用いたイムノブロットによって解決されました。KDa のタンパク質分子量マーカーが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 推定 CK2 基質タンパク質の免疫沈降します。濃縮と推定 CK2 基板の可視化 (第 3 レーン) は反 thiophosphate エステル抗体で免疫沈降の後複数のユニークなバンドとして明白であります。免疫沈降物は SDS-PAGE によって解決され、ゲルがブルーに染まっていました。アスタリスクの付いたバンドはゲルから摘出され、質量分析法によるタンパク質の同定のため提出します。KDa のタンパク質分子量マーカーが表示されます。IP = 免疫沈降。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 同定と体外CK2 の基板としてのタンパク質の確認。質量分析により得られたデータは、以前知られている15,16,17として推定される新規 CK2 基板はこの実験的アプローチを使用して識別されたを示します。10 蛋白質識別摘出バンド (top) から上部は示しています。アンチ ヌクレオリン抗体 (下) を使用して指定された分数のイムノブロット ヌクレオリン、知られていた CK2 基板の id を確認しました。KDa のタンパク質分子量マーカーが表示されます。IP = 免疫沈降。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 試薬ストック濃度 | 試薬最終濃度 | ボリューム追加に基づいてストック濃度の例 |
| 1 M トリス pH 7.4 | 20.0 mM | 200 Μ L |
| 4 M の NaCl | 20.0 mM | 50 Μ L |
| 20% トリトン X-100 | 0.50% | 250 Μ L |
| 1 M MgCl2 | 10.0 mM | 100 Μ L |
| 1 M の DTT | 0.5 mM | 5 Μ L |
| 200 mM Na3VO4 | 1.0 mM | 50 Μ L |
| 500 mM ナフ | 10.0 mM | 200 Μ L |
| 500 mM β グリセロール リン酸 | 10.0 mM | 200 Μ L |
| H2O | 8.945 mL | |
| + 1 の完全なミニ タブ/10 mL | 1 タブレット |
テーブル 1。換散バッファー調理法(10 mL、1 X)。
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Discussion
ここでは、複雑な生物的サンプルからの蛋白質キナーゼ CK2 の基板を識別するため比較的単純な生化学的手法について述べる。このプロトコルの重要なステップは、CK2 の異常な酵素学的性質に基づくし、CK2 依存 thiophosphorylation GTPγS 以降免疫沈降と識別を用いた特異的基質タンパク質が含まれています。これらの結果、ひと神経膠芽腫細胞、ショウジョウバエ卵巣18でこの戦略を適用している我々 としてのユーティリティとこのアプローチの多様性を説明してきました。
定量的プロテオミクス手法を用いた以前に発行された文献数実際に小説 CK2 基板19,20,21,22,を識別するに成功を収めている23. ただし、いくつかのこれらの戦略は、使用固定化基板の配列と、れ固定された蛋白質のコンフォメーションと潜在的なリン酸化部位のキナーゼにアクセスできなくなることが可能です。ここで説明する手法によりより生理学的またはネイティブ環境 (つまり、セル lysate)、内リン酸化それによりサイト到達不能の確率を減らします。この戦略のもう一つの利点は、質量分析法によるタンパク質の同定を決定したら、基板に対して指示される抗体である場合、プロシージャの間に収集されたサンプルの推定 CK2 基板検証が実行できることに簡単には興味の蛋白があります。たとえば、標準的な西部のしみを使用して、観察すべきレベルの劣化 (ポスト IP) サンプルに関連するタンパク質と抗 thiophosphate エステル免疫沈降物でのプレゼンスの削減知られている CK2 を実証してきた基板ヌクレオリン (図 4)。
このメソッドの主な制限は、質量分析法による分析の前にプロシージャの最後のステップがゲルのパターンをバンディングの離散の違いを識別する能力に依存することです。したがって、それは確かに低豊富の場合特定 CK2 基板を見逃す可能性があるための視覚的検出限界以下。1 つは、この可能性について懸念している、Coomassie 青いを使用する代わりにこれらの蛋白質を視覚化する銀製の汚損などのより機密性の高いメソッドが使えます。承認されるべき追加の考慮事項は生理関連サイトは既に生体内でリン酸化されるので、この戦略を使用して CK2 基板の数を識別するない場合があります。これはほぼ確実に CK2 の構成活動を与えられたケースであります。最後に、この方法はのみの in vitroCK2 の推定の基質として蛋白質を識別に注意も必要があります。CK2生体内の生理学的関連性の高い基板であることを検証するためその後の試金が必要で、これら特定の残基のリン酸化する場合 CK2 依存性リン酸化サイトと評価の同定を伴う必要があります。CK2 キナーゼ活動の操作への応答に変更。
要約すると、下流の実験的アプローチ (切り詰め/削除分析、サイト指示された突然変異誘発、機能のin vitroとin vivoアッセイ等によるリン酸化サイト マッピング) と相まってこの戦略が容易に研究するためこの異常なキナーゼ CK2 を複数の生物学的システムで果たしている様々 な役割の私達の理解を高める。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、授業を実施するペンシルベニア州保健省から連邦普遍的な研究強化助成金によって部分で支えられました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
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