Summary
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य के लिए लेबल, समृद्ध है, और एक जटिल जैविक नमूना से प्रोटीन कळेनासे CK2 के substrates की पहचान ऐसे एक सेल lysate या ऊतक homogenate के रूप में । इस विधि इस प्रयोजन के लिए CK2 जीव विज्ञान के अद्वितीय पहलुओं का लाभ उठाता है ।
Abstract
काइनेज-सब्सट्रेट संबंधों के अध्ययन के लिए इन एंजाइमों और दोनों शारीरिक और रोग राज्यों में उनके बहाव के लक्ष्य के कार्यों की एक पूरी समझ हासिल करने के लिए आवश्यक है । CK2 कई सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल substrates के सैकड़ों की बढ़ती सूची के साथ एक विकासवादी संरक्षित सेरीन/threonine कळेनासे है । इसकी अधिकता गुण के कारण, की पहचान करने और CK2 substrates के एक व्यापक सेट की विशेषता विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो गया है और इस महत्वपूर्ण एंजाइम के अध्ययन में एक बाधा बनी हुई है. इस चुनौती को संबोधित करने के लिए, हम एक बहुमुखी प्रयोगात्मक रणनीति है कि लक्षित संवर्धन और ख्यात CK2 substrates की पहचान के लिए सक्षम बनाता है तैयार किया है । यह प्रोटोकॉल अद्वितीय दोहरी सह-सब्सट्रेट विशिष्टता का लाभ लेता है CK2 की विशिष्ट थियोफॉस्फोरेलेशन के लिए अनुमति देता है एक सेल या ऊतक lysate में इसके substrate. इन सब्सट्रेट प्रोटीन बाद में alkylated हैं, immunoprecipitated, और तरल क्रोमेटोग्राफी द्वारा की पहचान की/अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-ms/ हम पहले इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है सफलतापूर्वक drosophila अंडाशय से CK2 substrates की पहचान करने के लिए और यहां हम मानव ग्लोब्लास्टोमा कोशिकाओं के लिए इस प्रोटोकॉल के आवेदन का विस्तार, इस विधि की जांच करने के लिए ग्राह्यता illustrating विभिन्न मॉडल जीवों और प्रायोगिक प्रणालियों में इस काइनेज की जैविक भूमिकाएं ।
Introduction
प्रोटीन kinases संकेत पारक्रमण cascades के प्रमुख घटक हैं । इन एंजाइमों द्वारा सब्सट्रेट प्रोटीन के फॉलिसिलेशन जैविक प्रतिक्रियाएं जो कोशिका विभाजन, चयापचय, और भेदभाव को नियंत्रित करने वाली महत्वपूर्ण घटनाओं को विनियमित करती हैं, दूसरों के बीच । CK2 एक बैरा व्यक्त किया है, acidophilic serine/threonine कळेनासे कि खमीर से मनुष्यों के लिए संरक्षित है और है कि कई सेलुलर प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है transcriptional विनियमन से सेल चक्र प्रगति करने के लिए apoptosis1 ,2,3. एंजाइम दो उत्प्रेरक α (या α ') उपयूनिटों और दो नियामक β उपयूनिटों4से बना विषमयुग्मक है । अत्यधिक pleiotropic होने के अलावा, CK2 दो अंय असामांय विशेषताओं है कि इसके विश्लेषण, अर्थात् संवैधानिक गतिविधि5 और दोहरी सह-सब्सट्रेट विशिष्टता6प्रदर्शित करता है । इस उत्तरार्द्ध संपत्ति को gtp का उपयोग करने की क्षमता के साथ CK2 endows के रूप में अच्छी तरह से सब्सट्रेट प्रोटीन के फास्फालिलेशन के लिए एटीपी.
CK2 के उत्प्रेरक या विनियामक उपइकाइयों के आनुवंशिक विलोपन में चूहों में परिणाम भ्रूण lethality का संकेत है कि यह विकास और ऑर्गेनोजेनेसिस7,8के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । CK2 भी कैंसर के कई प्रकार में overexpressed है और इस प्रकार एक होनहार चिकित्सकीय लक्ष्य9,10,11का प्रतिनिधित्व करता है । दरअसल, CK2 कळेनासे गतिविधि को लक्षित करने वाले विशिष्ट अवरोधक इस प्रयोजन के लिए वर्तमान में जांच कर रहे हैं12,13,14. जबकि CK2 के निषेध एक व्यवहार्य विकल्प है, उसके बहुप्रभावी प्रकृति, एक विकल्प और शायद अधिक तर्कसंगत दृष्टिकोण को देखते हुए महत्वपूर्ण CK2 substrates कि कुछ कैंसर की प्रगति आबाद लक्ष्य होगा । इसलिए, व्यापक पहचान और CK2 सब्सट्रेट प्रोटीन के लक्षण वर्णन विशिष्ट समारोह (ओं) एक विशेष ऊतक या ट्यूमर प्रकार के भीतर इस कळेनासे के elucidating के लिए महत्वपूर्ण लाभ का होगा ।
यहां, हम एक जटिल जैविक नमूने से एक सेल या ऊतक lysate के रूप में CK2 substrates की पहचान करने के लिए एक बहुमुखी जैव रासायनिक विधि का वर्णन । यह प्रोटोकॉल gtp एनालॉग gtpγs (ग्वानोसिन 5 '-[γ-thio] ट्राइफॉस्फेट) के उपयोग द्वारा CK2 की दोहरी सह-सब्सट्रेट विशिष्टता का लाभ उठाता है, जो अन्य अंतर्जात kinases का उपयोग नहीं कर सकता । यह प्रभावी ढंग से करने के लिए कळेनासे "लेबल" इसके बाद अलगाव और पहचान के लिए इस नमूने के भीतर substrates की अनुमति देता है ।
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Protocol
नोट: सुनिश्चित करें कि आवश्यक सामग्री उपलब्ध है और ठीक से तैयार कर रहे है ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
1. तैयारी
- यंत्रवत् लाइसे ऊतक नमूना (1-2 मिलीग्राम की १०० μl में ऊतक के lysis बफर, तालिका 1) या सुसंस्कृत कोशिकाओं (10 सेमी प्लेट कि 80-90 है% संगामी में ३५० μl of lysis बफर), प्रयोग के लिए नमूना के एक कुल इकट्ठा करने के लिए किया जा रहा लक्ष्य के साथ ९०० μl. ध्यान दें कि इस खंड में नीचे वर्णित प्रयोग के लिए क्या आवश्यक है, यह थोड़ा अधिक है ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए १७,५०० एक्स जी पर अपकेंद्रीकरण द्वारा नमूनों को स्पिन करना । पूरा होने पर, तीन नए १.७ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए सतह पर तैरनेवाला के २७० μl स्थानांतरण । इसमें लगभग ९० μl शेष होंगे । एक नया ट्यूब में एक "इनपुट नियंत्रण" और जगह के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए ४० μl निकालें । सभी नमूनों को बर्फ पर रखें ।
2. काइनेज परख: थायोफॉस्फोरेलेशन और ऐल्किलन
- लेबल तीन २७० μl प्रत्येक के रूप में इस प्रकार युक्त ट्यूबों: "kinase rxn", "केवल gtpγs", और "pnbm (पी-nitrobezyl mesylate) केवल" । काइनेज प्रतिक्रियाओं को तैयार करें ।
- करने के लिए "kinase rxn" ट्यूब, जोड़ें २.७ μl (१,३५० यू के बराबर) CK2, फिर जोड़ें २.७ μl के २.५ मिमी gtpγs.
- "केवल gtpγs" ट्यूब के लिए, २.५ मिमी gtpγs के २.७ μl जोड़ें, और फिर lysis बफर के २.७ μl जोड़ें ।
- "केवल pnbm" ट्यूब करने के लिए, जोड़ें ५.४ μl of lysis बफ़र. झटका सभी ट्यूबों मिश्रण करने के लिए और फिर तुरंत बर्फ पर जगह है ।
- एक 30 ° c पानी स्नान में 1 मिनट के लिए सभी तीन ट्यूबों सेते । ऊष्मायन के बाद, सभी तीन ट्यूबों के लिए 12 मिलीग्राम/एमएल pnbm के १३.५ μl जोड़ें । मिश्रण नमूनों को उलटो. 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर इन नमूनों को सेते हैं ।
- २.२ चरण में ऊष्मायन शुरू करने के बाद, जितनी जल्दी हो सके विलवटिंग कॉलम तैयार करें क्योंकि प्रक्रिया लगभग ४५ मिनट लेती है ।
3. विलवटिंग कॉलम तैयार करना
- शुरू में कॉलम (इस उदाहरण के प्रयोग के लिए 3) के लिए प्रत्येक स्तंभ को उलटा करने के लिए कई बार फिर से निलंबित sephadex जी-25 राल भंडारण बफर में तैयार करते हैं । राल एक दबाना खड़े हो जाओ और यह लगभग 5 मिनट के लिए अबाधित बैठने दे प्रत्येक कॉलम संलग्न द्वारा बसने की अनुमति दें ।
- sephadex जी-25 राल के निपटान के बाद, दोनों ऊपर और स्तंभ के नीचे से टोपियां हटाने के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा पलायन करने के लिए भंडारण बफर की अनुमति है और एक ट्यूब नीचे खोलने के नीचे रखा करने के लिए प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा करने के लिए छोड़ दें ।
- एक बार भंडारण बफर समाप्त हो गया है, लगभग २.७ मिलीलीटर lysis बफर के क्रम में कॉलम equilibrate करने के लिए जोड़ें । प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा और त्यागें । 3 बार दोहराएं । अंतिम समानता के बाद, कॉलम ४.१ चरण के लिए तैयार हैं ।
4. pnbm का निष्कासन
- 1 एच ऊष्मायन (चरण २.२) और कॉलम तैयार करने के बाद (चरण 3) पूरा कर रहे हैं, स्तंभों के लिए नमूने लागू होते हैं । प्रत्येक स्तंभ को निंनानुसार लेबल करें: "kinase rxn", "केवल gtpγs", और "केवल pnbm" । अपने संबंधित कॉलम पर प्रत्येक नमूने के सभी लोड । ले लीजिए और प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
- प्रत्येक स्तंभ के लिए lysis बफर के ४२० μl जोड़कर नमूने धो लें । lysis बफ़र स्तंभ के माध्यम से फ़िल्टर करने के लिए और प्रवाह-के माध्यम से छोड़ने के लिए एकत्रित करने की अनुमति दें । इस धोने कदम के बाद, नमूनों के संग्रह के लिए स्थिति में जगह ट्यूबों ।
- प्रत्येक कॉलम के लिए lysis बफर के ५०० μl जोड़कर elute नमूने । प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए कि अब thiophosphorylated और alkylated CK2 substrates शामिल हैं ।
5. इम्यूनोरेसिपिटेशन: मैं भाग
- पहले ८० μl एक "रेफरेंस इनपुट नियंत्रण" नमूने के लिए संबंधित elution से प्रत्येक ("kinase rxn", "gtpγs केवल", और "केवल pnbm") के लिए चरण ४.३ में एकत्र द्वारा immunopरेसिसिटेशन के लिए नमूने तैयार करें । प्रत्येक नमूने से ८० μl को हटाने के बाद, लगभग ४२० μl प्रति नमूना शेष होगा ।
- प्रत्येक २०० μl युक्त ट्यूबों में प्रत्येक नमूना भाजित । प्रत्येक संबंधित ट्यूब लेबल: "kinase rxn एंटी थियोफॉस्फेट एस्टर", "kinase rxn igg", "gtpγs एंटी थियोफॉस्फेट एस्टर", "gtpγs igg", "pnbm एंटी-थियोफॉस्फेट एस्टर", और "pnbm igg".
- एंटी-थियोफास्फेट एस्टर एंटीबॉडी के २.८ μg को एंटी-थियोफॉस्फेट एस्टर-लेबल ट्यूबों और आईईजी-लेबल ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए समप्ररूप नियंत्रण एंटीबॉडी के २.८ μg को जोड़ें । 2 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटर पर ट्यूबों प्लेस ।
- चरण ५.२ में 2 एच ऊष्मायन के पिछले 15 मिनट के दौरान प्रोटीन ए जी मनका की तैयारी शुरू करें ।
6. प्रोटीन ए जी agarose मनका वडा
- संक्षेप में, मोतियों को सुनिश्चित करने के लिए स्टोरेज ट्यूब को पूरी तरह से फिर से निलंबित कर दिया जाता है । एक P200 पिपेट टिप के अंत में कटौती आदेश में गेज आकार बढ़ाने के लिए एक साफ रेज़ ब्लेड का उपयोग । पिपेट १०० μl के मनका घोल प्रति immunopरेसिपिटेशन एक नया १.७ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में । इस उदाहरण के लिए, कुल 6 ट्यूबों की जरूरत है ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए १७,५०० एक्स जी पर ट्यूबों को सेंट्रेसेज । सतह पर तैरनेवाला निकालें और छोड़ें । lysis बफर और संक्षेप में भंवर के २०० μl में मोती फिर से निलंबित । दोहराएं स्पिन और धो कदम 3 बार ।
- अंतिम धोने के बाद, ५.२ कदम में ऊष्मायन पूरा हो गया है जब तक बर्फ पर मोती जगह है ।
7. इम्यूनोरेसिसिटेशन: भाग II
- चरण ५.२ से 2 एच ऊष्मायन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए १७,५०० एक्स जी पर नमूनों नीचे स्पिन । निम्नलिखित अपकेंद्रीकरण से धोया मोती के साथ ट्यूबों के लिए प्रत्येक नमूने से २०० μl जोड़ें । 1 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर पर ट्यूबों प्लेस ।
- 1 एच ऊष्मायन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए १७,५०० एक्स जी पर ट्यूबों को अपकेंद्रिप करें । अगले प्रत्येक नमूना से सतह पर तैरनेवाला के ४० μl निकालें और एक "कमी नियंत्रण" (कुल 6 ट्यूबों) के रूप में बचाने के लिए । सतह पर तैरनेवाला के शेष निकालें और त्यागें । मनकों को परेशान न करने का ख्याल रखें ।
- lysis बफर के २०० μl जोड़कर नमूनों को धो लें और संक्षेप में vortexing । फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए १७,५०० एक्स जी पर अपकेंद्रिका । सतह पर तैरनेवाला निकालें और छोड़ें । धो और स्पिन चरण 3 बार दोहराएं । इन कदमों के दौरान मोतियों को परेशान न करने का ख्याल रखें ।
- धोने चरणों को पूरा करने के बाद, मोती युक्त प्रत्येक नमूना करने के लिए 2x नमूना बफर के ५० μl जोड़ें । अन्य सभी नमूनों के लिए, 6x नमूना बफर के 8 μl जोड़ें: "इनपुट नियंत्रण", "रेफरेंस इनपुट नियंत्रण", और "कमी नियंत्रण".
- एक बार बफर ट्यूबों के लिए जोड़ा जाता है, पिपेट ऊपर और नीचे मिश्रण करने के लिए, और sds-पृष्ठ के साथ आगे बढ़ने से पहले 5 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर सभी नमूनों गर्मी.
8. परिणामों का विश्लेषण/
- सफल CK2-निर्भर थायोफॉस्फोरेलेशन और ऐल्कीलीकरण को मान्य करें ।
- चरण २.२ में CK2-mediated थियोफॉस्फोरेलेशन की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए, एक १२.५% polyacrylamide जेल पर ५.१ चरण में एकत्र "रेफरेंस इनपुट नियंत्रण" के 15-20 μl चलाकर एसडीएस पृष्ठ और पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन.
- निम्नलिखित एंटीबॉडी के साथ जांच झिल्ली: एंटी-थियोफॉस्फेट एस्टर, एंटी-CK2α, और एंटी-गैपढ (या अन्य उचित लोडिंग नियंत्रण) । यदि यह चरण सफल रहा था, एक बढ़ाया विरोधी थायोफॉस्फेट एस्टर संकेत अन्य दो लेन की तुलना में "kinase rxn" लेन में स्पष्ट किया जाना चाहिए (चित्रा 2).
- CK2 और प्रोटीन की पहचान का निर्धारण करने के लिए एक प्रकार की वनस्पति परिष्कृत substrates कल्पना ।
- immunopरेसिसिटेशन कदम सफल रहे थे का आकलन करने के लिए, एक अलग १२.५% polyacrylamide जेल पर ७.४ कदम में मोती से eluted नमूनों की 25-30 μl चलाते हैं । सुनिश्चित करें कि सभी उपकरण साफ है और इस कदम के दौरान हर समय दस्ताने पहनते है संदूषण को कम करने के लिए ।
- प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों से समृद्ध प्रोटीन कल्पना करने के लिए coomassie नीले रंग के साथ जेल दाग (चित्रा 3). नए razorblades का प्रयोग, ध्यान से उत्पाद अद्वितीय बैंड में मौजूद "kinase rxn विरोधी थायोफॉस्फेट एस्टर आईपी" लेन, उनके अनुमानित आणविक भार टिप्पण.
- इन बैंड्स को प्रोटीन पहचान के लिए लिक्विड क्रोमेटोग्राफी/टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-ms/ms) (चित्रा 4) द्वारा प्रस्तुत करें । अगर पहचान प्रोटीन के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी उपलब्ध हैं, एसडीएस द्वारा मास स्पेक्ट्रोमेट्री के परिणामों की पुष्टि-पृष्ठ और इनपुट के immunoblotting, समाप्त, और आईपी अंश प्रोटोकॉल के दौरान एकत्र (चित्रा 4).
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Representative Results
प्रायोगिक प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध आरेख चित्रा 1में प्रदान किया गया है । तकनीक का अंतर्निहित आधार फ़ॉस्फाइल समूह स्थानांतरण के लिए gtp का उपयोग करने के लिए CK2 की असामान्य क्षमता है । इसके अलावा exogenous CK2 होलोएंजाइम के साथ gtp एनालॉग, gtpγs, एक सेल lysate परिणाम के लिए अंतर्जात CK2 substrates के थियोफॉस्फोरेलेशन में । ऐल्किलन अभिकर्मक पी-nitrobenzyl mesylate (pnbm) के साथ lysate के बाद उपचार इन विशिष्ट सब्सट्रेट प्रोटीन है कि फिर एक विरोधी थियोफॉस्फेट एस्टर एंटीबॉडी का उपयोग कर immunoprecipitated किया जा सकता है पर एक थियोफॉस्फेट एस्टर मोइटी उत्पन्न और अंततः मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान की. चित्रा 2 CK2 और gtpγs के अलावा और फिर T98G के लिए pnbm (ग्लोब्लास्टोमा) सेल lysate के बाद एक सकारात्मक परिणाम दर्शाया गया है । इन परिणामों से यह प्रदर्शित होता है कि CK2-निर्भर थियोफॉस्फेट और बाद के ऐल्किलेशन सफल रहे । उम्मीद के रूप में, एक बढ़ाया विरोधी थायोफॉस्फेट एस्टर संकेत पश्चिमी सोख्ता द्वारा केवल पूर्ण काइनेज प्रतिक्रिया युक्त लेन में मनाया जाता है और केवल gtpγs में नहीं-और केवल pnbm-इलाज के नमूने । चित्रा 3 में दिखाया गया है एक coomassie ब्लू-immunoprecipitated और eluted प्रोटीन का जेल समप्ररूप नियंत्रण igg या विरोधी thiophosphate एस्टर एंटीबॉडी का उपयोग कर की उपस्थिति या अनुपस्थिति में अतिरिक्त CK2 और/ इन आंकड़ों को भी एक सकारात्मक परिणाम प्रदर्शित करता है के रूप में कई अद्वितीय बैंड केवल विरोधी थायोफॉस्फेट एस्टर आईपी लेन जिसमें lysate exogenous CK2 और gtpγs के साथ incubated में स्पष्ट कर रहे हैं । एक तारांकन के साथ संकेत बैंड जेल से excised और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन की पहचान के लिए प्रस्तुत किया गया था. चित्रा 4 प्रतिनिधि प्रोटीन पहचान, प्रतिशत कवरेज सहित मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा प्राप्त डेटा दिखाता है, और अद्वितीय बैंड के भीतर प्रोटीन प्रति की पहचान की पेप्टाइड की संख्या. दिखाए गए बैंड (चित्रा 3) और या नहीं प्रोटीन पहले CK215,16,17के एक सब्सट्रेट के रूप में पहचान की गई है या नहीं के बारे में जानकारी से शीर्ष दस हिट दिखाया गया है । ज्ञात immunoprecipitated CK2 सबस्ट्रेट्स में से एक की पहचान, न्यूकोलॉलिन15, एसडीएस-पेज द्वारा पुष्टि की गई थी और एक एंटी-न्यूक्लोलीन एंटीबॉडी का उपयोग करके इंगित अंशों का इम्यूनोलॉटिंग किया गया था ।
चित्र 1: प्रायोगिक कार्यनीति का योजनाबद्ध आरेख. gtp एनालॉग, gtpγS, अतिरिक्त पुनः संयोजक CK2 होलोएंजाइम के साथ एक सेल या ऊतक lysate करने के लिए जोड़ा गया है और CK2 द्वारा substrates के thiophosphorylation के लिए अनुमति देता है, लेकिन अन्य अंतर्जात kinases द्वारा नहीं. थियोफॉस्फोरिलेटेड सबस्ट्रेट्स pnbm के साथ अगले alkylated हैं, इन प्रोटीनों पर थियोफॉस्फेट एस्टर मोइटी पैदा कर रहे हैं, जो तब तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा अनुवर्ती पहचान के लिए इम्यूनोरेसिपिटेशन (आईपी) के माध्यम से कैप्चर किए जाते हैं-मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री ( LC-MS/MS). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 2: पूरे सेल lysate में CK2-निर्भर thiopहॉस्पिलन का सत्यापन । पूरी सेल lysates T98G कोशिकाओं से तैयार की उपस्थिति में gtpγएस के साथ incubated (काइनेज प्रतिक्रिया) या अनुपस्थिति (gtpγs केवल) exogenous पुनः संयोजक CK2 holoenzyme । बाद में pnbm संकेत प्रतिक्रियाओं के लिए जोड़ा गया था, और नमूने sds द्वारा हल किया गया था-पृष्ठ संकेत एंटीबॉडी के साथ immunoblotting द्वारा पीछा. प्रोटीन आणविक वजन मार्कर केडीए में संकेत दिया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 3: ख्यात CK2 सब्सट्रेट प्रोटीन की immunopरेसिसिटेशन । संवर्धन और पूतिकारी CK2 substrates (तीसरे लेन) के दृश्य विरोधी के साथ immunopरेसिसिटेशन के बाद कई अद्वितीय बैंड के रूप में स्पष्ट है थियोफॉस्फेट एस्टर एंटीबॉडी. immunoprecipitates एसडीएस-पेज द्वारा हल किए गए थे और जेल coomassie नीले रंग के साथ दाग था । एक तारांकन चिह्न के साथ चिह्नित बैंड जेल से excised और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन पहचान के लिए प्रस्तुत किया गया था. प्रोटीन आणविक वजन मार्कर केडीए में संकेत दिया जाता है । आईपी = immunopरेसिपिटेशन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 4: विट्रो मेंCK2 की substrates के रूप में प्रोटीन की पहचान और पुष्टि. मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्राप्त डेटा दर्शाता है कि दोनों पहले ज्ञात15,16,17 के रूप में अच्छी तरह के रूप में ख्यात उपन्यास CK2 substrates इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर की पहचान की गई. दिखाया शीर्ष दस excised बैंड (ऊपर) से पहचान प्रोटीन रहे हैं । न्यूकोलॉलिन, एक ज्ञात CK2 सब्सट्रेट की पहचान, एक एंटी-न्यूनालॉओलिन एंटीबॉडी (नीचे) का उपयोग कर इंगित अंशों के इम्यूनोलोटिंग द्वारा पुष्टि की गई थी । प्रोटीन आणविक वजन मार्कर केडीए में संकेत दिया जाता है । आईपी = immunopरेसिपिटेशन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
| अभिकर्मक स्टॉक सांद्रण | अभिकर्मक अंतिम सांद्रण | स्टॉक सांद्रता के आधार पर जोड़े गए उदाहरण खंड |
| 1 एम Tris पीएच ७.४ | २०.० एमएम | २०० μl |
| 4 M nacl | २०.० एमएम | ५० μl |
| 20% ट्राइटन एक्स-१०० | ०.५०% | २५० μl |
| 1 एम mgcl2 | १०.० एमएम | १०० μl |
| 1 एम डीटीटी | ०.५ एमएम | 5 μl |
| २०० मिमी न3VO4 | १.० एमएम | ५० μl |
| ५०० एमएम नफ | १०.० एमएम | २०० μl |
| ५०० एमएम β-ग्लिसरीन फॉस्फेट | १०.० एमएम | २०० μl |
| एच2ओ | ८.९४५ एमएल | |
| + 1 पूरा मिनी टैब/ | 1 tablet) |
तालिका 1. lysis बफर नुस्खा (10 मिलीलीटर, 1x) ।
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Discussion
यहां, हम एक जटिल जैविक नमूना से प्रोटीन कळेनासे CK2 की पहचान करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल जैव रासायनिक विधि का वर्णन । इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम असामान्य एंजाइमी गुणों पर आधारित हैं CK2 और gtpγS का उपयोग कर विशिष्ट सब्सट्रेट प्रोटीन का CK2-निर्भर थियोफॉस्फोरेलेशन और उनके बाद immunopरेसिसिटेशन और पहचान शामिल हैं । इन परिणामों के साथ, हम इस दृष्टिकोण की उपयोगिता और बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन किया है के रूप में हम अब दोनों मानव ग्लोब्लास्टोमा कोशिकाओं और drosophila अंडाशय18में इस रणनीति लागू किया है ।
मात्रात्मक फ़ॉस्फोप्रोटोमिक्स दृष्टिकोण का उपयोग कर पहले प्रकाशित अध्ययनों की एक संख्या वास्तव में उपन्यास की पहचान करने में सफल सिद्ध किया है CK2 substrates19,20,21,22, 23. हालांकि, इन रणनीतियों में से कुछ मैटीरियल सब्सट्रेट सरणियों का उपयोग करते हैं, और यह संभव है कि एक मैटीरियल प्रोटीन के अनुरूप एक संभावित फॉलीयलेशन साइट को काइनेज के लिए दुर्गम प्रदान कर सकता है । तकनीक यहां वर्णित एक और अधिक शारीरिक या देशी पर्यावरण (यानी, एक सेल lysate), जिससे साइट अप्राप्यता की संभावना को कम करने के भीतर फॉस्लिलेशन परमिट । इस रणनीति का एक और लाभ यह है कि एक बार प्रोटीन की पहचान मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा निर्धारित किया जाता है, पूतिकारी CK2 substrates के सत्यापन आसानी से प्रक्रिया के दौरान एकत्र नमूनों पर किया जा सकता है अगर एंटीबॉडी सब्सट्रेट के खिलाफ निर्देशित ब्याज की प्रोटीन (ओं) उपलब्ध हैं । उदाहरण के लिए, मानक पश्चिमी blotting का उपयोग कर, एक समाप्त में प्रासंगिक प्रोटीन के स्तर में कमी का पालन करना चाहिए (पोस्ट-IP) नमूने और विरोधी में अपनी उपस्थिति-thiophosphate एस्टर immunoprecipitates के रूप में हम ज्ञात CK2 के लिए प्रदर्शन किया है सब्सट्रेट न्यूक्सोलिन (चित्रा 4) ।
इस विधि की एक उल्लेखनीय सीमा है कि प्रक्रिया के अंतिम चरण से पहले विश्लेषण करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री एक जेल पर बैंडिंग पैटर्न में असतत मतभेद विचार करने की क्षमता पर निर्भर करता है. इस प्रकार, यह निश्चित रूप से संभव है कि विशिष्ट CK2 substrates अगर वे कम बहुतायत के है और इसलिए दृश्य का पता लगाने की सीमा के नीचे याद किया जा सकता है । यदि एक इस संभावना के बारे में चिंतित है, चांदी धुंधला जैसे एक और अधिक संवेदनशील विधि coomassie नीले रंग का उपयोग कर के बजाय इन प्रोटीन कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक अतिरिक्त विचार है कि स्वीकार किया जाना चाहिए यह है कि भौतिक रूप से प्रासंगिक साइटों पहले से ही vivo मेंफास्फाइलेटेड हो जाएगा के बाद से CK2 substrates की संख्या इस रणनीति का उपयोग नहीं पहचाना जा सकता है । यह लगभग निश्चित रूप से CK2 की संवैधानिक गतिविधि दिया मामला है । अंत में, यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस पद्धति केवल प्रोटीन की पहचान करता है के रूप में CK2 विट्रो मेंपुटटिव substrates. बाद में यह पुष्टि करने के लिए कि ये फिजियोलॉजिकल रूप से प्रासंगिक CK2 के सबस्ट्रेट्स हैं vivo में आवश्यक हैं और CK2-निर्भर फास्फ़ॉरिलेशन साइटों की पहचान करना चाहिए और यह आकलन करना चाहिए कि क्या इन विशेष अवशेषों का फास्फॉरिलेशन है CK2 कळेनासे गतिविधि के हेरफेर के जवाब में बदल दिया है ।
संक्षेप में, यह रणनीति अनुप्रवाह प्रायोगिक दृष्टिकोण के साथ युग्मित (फ़ॉस्सिलेशन साइट मैपिंग द्वारा जनचेतना/विलोपन विश्लेषण, साइट-निर्देशित म्यूटजेनेसिस, विट्रो में कार्यात्मक और vivo assays में, आदि) अध्ययन की सुविधा होगी इस असामांय कळेनासे के और विभिंन भूमिकाओं कि CK2 कई जैविक प्रणालियों में खेलता है की हमारी समझ में वृद्धि होगी ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम के हिस्से में एक राष्ट्रमंडल यूनिवर्सल अनुसंधान के स्वास्थ्य के पेनसिल्वेनिया विभाग से वृद्धि अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था t.i.s.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
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