Summary
Etiket, zenginleştirmek ve protein kinaz CK2 hücre lysate veya doku homogenate gibi karmaşık bir biyolojik örnekten yüzeylerde belirlemek için bu iletişim kuralını hedefidir. Bu yöntem CK2 Biyoloji benzersiz özelliklerini bu amaç için kaldıraç görevi yapar.
Abstract
Kinaz-substrat ilişkileri Bu enzimler ve aşağı akım hedeflerine fizyolojik ve patolojik Birleşik Devletleri fonksiyonları tam bir anlayış kazanmak için önemli bir çalışmadır. CK2 bir evrimsel korunmuş serin/treonin kinaz ile gittikçe artan sayıda yüzeylerde birden çok hücresel süreçlerinde yer alan yüzlerce var. Pleiotropic özellikleri nedeniyle belirlenmesi ve CK2 yüzeylerde kapsamlı bir dizi karakterize özellikle zor olmuştur ve bu önemli enzim çalışmada bir engel olarak kalır. Bu sorun adrese hedeflenen zenginleştirme ve sözde CK2 yüzeylerde tanımlaması sağlayan çok yönlü bir deneysel strateji geliştirmiştir. Bu iletişim kuralı, bir hücre veya doku onun yüzeylerde özel thiophosphorylation için lysate izin benzersiz Çift ortak substrat özgüllüğü CK2 yararlanır. Daha sonra bu substrat proteinler vardır, immunoprecipitated, alkylated ve sıvı Kromatografi/tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) tarafından tespit edilmiştir. Biz daha önce bu yaklaşım başarılı bir şekilde CK2 yüzeylerde Drosophila yumurtalıklar üzerinden tanımlamak için kullanılan ve burada araştırmak için bu yöntemin uyum gösteren insan glioblastoma hücreleri, bu iletişim kuralını uygulamaya uzatmak Bu kinaz çeşitli model organizmalar ve deneysel sistemleri biyolojik rolleri.
Introduction
Protein kinaz sinyal iletim cascades anahtar bileşenleridir. Fosforilasyon tarafından Bu enzim substrat proteinlerin biyolojik yanıt-e doğru kontrol hücre bölünmesi, metabolizma ve farklılaşma, diğerleri arasında kritik olayları düzenleyen ortaya çıkarır. Bu Maya insanlar için korunmuş ve bu transkripsiyon Yönetmeliği hücre döngüsü ilerleme apoptosis1 kadar uzanan birçok hücresel süreçler önemli roller oynar ubiquitously ifade, acidophilic serin/treonin kinaz CK2 olduğunu ,2,3. İki katalitik α oluşan bir heterotetramer enzimdir (veya α') alt birimleri ve iki düzenleyici β alt birimleri4. Son derece pleiotropic olmasının yanı sıra, CK2, analizleri, karmaşık hale iki diğer sıradışı özellikleri Yani bünye etkinlik5 ve ikili ortak substrat özgüllüğü6sergiler. Bu ikinci özellik GTP hem de ATP substrat protein fosforilasyon için kullanma yeteneği ile CK2 endows.
Embriyonik ölümcül geliştirme ve organogenesis7,8sırasında çok önemli roller oynayan gösteren CK2 katalitik veya düzenleyici altbirimden farelerde genetik silinmesiyle sonuçlanır. CK2 de kanser çeşitli overexpressed ve böylece gelecek vaat eden bir terapötik hedef9,10,11temsil eder. Gerçekten de, belirli inhibitörleri bu hedef CK2 kinaz aktivitesi vardır şu anda bu amaç12,13,14soruşturma altında. Süre CK2 inhibisyonu pleiotropic doğası, alternatif verilen uygun bir seçenek ve belki de daha akılcı yaklaşım bazı kanserler ilerlemesini altında yatan kritik CK2 yüzeylerde hedef olacaktır. Bu nedenle, kapsamlı kimlik ve CK2 yüzey proteinleri karakterizasyonu bu kinaz belirli bir doku veya tümör tür içinde belirli function(s) elucidating için önemli yararı olacaktır.
Burada, bir hücre veya doku lysate gibi karmaşık bir biyolojik örnek üzerinden CK2 yüzeylerde tanımlamak için çok yönlü bir biyokimyasal yöntem açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı CK2 ikili ortak substrat özgüllüğü GTP analog GTPγS (diğer endojen kinaz kullanamazsınız guanozin 5'-[γ-thio]triphosphate). kullanımı tarafından yararlanır Bu etkili bir şekilde "onun yüzeylerde içinde bu örnek sonraki yalıtım ve kimlik için etiketlemek" kinaz sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: gerekli malzemeler kullanılabilir ve düzgün hazırlanmış olduğundan emin olun ( Tablo malzemelerigörmek).
1. hazırlık
- Mekanik olarak doku örneği (1-2 mg 100 µL lizis arabelleği, Tablo 1doku) koşullar veya toplam 900 µL deney için örnek toplamak için amaç ile hücreleri (10 cm tabak), lizis arabelleği 350 µL % 80-90 birleşmesi olan kültürlü. Bu birim ne aşağıda açıklanan deney için gerekli olduğu hafif fazla olduğuna dikkat edin.
- 4 ° C'de 3 dakika 17.500 x g de Santrifüjü tarafından örnekleri spin Tamamlandıktan sonra her üç yeni 1.7 mL microcentrifuge tüpler süpernatant ile 270 µL aktarın. Yaklaşık 90 µL kalan olacak. Bir "giriş denetimi" ve yeni bir tüp yerde kullanılmak üzere 40 µL kaldırın. Tüm örneklerini Buza koyun.
2. kinaz tahlil: thiophosphorylation ve alkillenme
- 270 µL aşağıdaki gibi içeren üç tüpler etiket: "kinaz rxn", "Sadece GTPγS", ve "PNBM (p-nitrobezyl mesylate) sadece". Kinaz reaksiyonlar hazırlayın.
- "Kinaz rxn" tüp CK2, 2.7 µL (1350 U eşdeğer) ekleyin, sonra 2.5 mm GTPγS 2.7 µL ekleyin.
- "Sadece GTPγS" tüp 2.5 mm GTPγS 2.7 µL ekleyin ve sonra lizis arabelleği 2.7 µL ekleyin.
- "Sadece PNBM" tüp lizis arabelleği 5.4 µL ekleyin. Tüm tüplere karıştırın ve daha sonra hemen yere buz üzerinde hafifçe vur.
- Tüm üç tüpler 30 ° C su banyosunda 1 dk. için kuluçkaya. Kuluçka 12 mg/ml PNBM 13.5 µL tüm üç tüpler için ekleyin. Örnekleri karıştırmak için ters çevir. Bu örnekler, oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
- Kuluçka adım 2.2 başlattıktan sonra desalting sütun işlemi yaklaşık 45 dakika sürer gibi en kısa zamanda hazır olun.
3. sütun desalting hazırlık
- Başlangıçta sütun (3 Bu örnek deneme için) her sütunu yeniden askıya Sephadex G-25 reçine depolama arabellek birkaç kez ters çevirme hazırlayın. Reçine her sütun için bir kelepçe stand ekleyerek ve yaklaşık 5 dakika için rahatsız edilmeden oturmak izin tarafından yerleşmek izin verir.
- Sephadex G-25 reçine yerleşme aşağıdaki düşük yerçekimi tarafından drenaj ve akışı üzerinden atmak için toplamak için alt açıklıklı aşağıda yerleştirilen bir tüp var depolama arabellek sütunun alt ve üst kapaklar kaldırabilirsiniz.
- Depolama arabellek tükendiğinde, yaklaşık 2.7 mL lizis arabellek sütunları equilibrate için ekleyin. Akışı aracılığıyla toplamak ve atın. 3 kez tekrarlayın. Son denge sütunları 4.1 adım için hazır.
4. PNBM kaldırılması
- 1 h kuluçka (Adım 2.2) ve sütun hazırlık (Adım 3) tamamlandıktan sonra örnekleri sütunlarla. Her sütun aşağıdaki gibi etiketleyin: "kinaz rxn", "Sadece GTPγS" ve "Sadece PNBM". Yük tüm ilgili sütuna her örneğinin. Toplamak ve akışı aracılığıyla atın.
- Örnekleri her sütun için 420 µL lizis arabelleği ekleyerek yıkayın. Lizis arabellek sütun filtre ve akışı üzerinden atmak için toplamak izin. Bu yıkama adım tüpler örnekleri topluluğu için pozisyon yerleştirin.
- Örnekleri her sütun için 500 µL lizis arabelleği ekleyerek elute. Akış-şimdi thiophosphorylated ve alkylated CK2 yüzeylerde içeren aracılığıyla toplamak.
5. Immunoprecipitation: Bölüm ı
- Örnekleri immunoprecipitation için ilk kaldırma 80 µL her ("kinaz rxn", "Sadece GTPγS" ve "Sadece PNBM") ilgili elutions adım 4.3 toplanan "elüsyon denetim giriş" örnek için hazırlayın. Her örnek üzerinden 80 µL kaldırılmasını, örnek kalan yaklaşık 420 µL olacak.
- Her örnek 200 µL içeren 2 tüpler içine bölünmüş. İlgili her tüpün etiket: "kinaz rxn anti-thiophosphate ester", "kinaz rxn IgG", "GTPγS anti-thiophosphate ester", "GTPγS IgG", "PNBM anti-thiophosphate ester" ve "PNBM IgG".
- Anti-thiophosphate ester antikor her anti-thiophosphate ester etiketli tüplerinin 2.8 µg ve izotip kontrol antikor IgG etiketli tüpler herbiri için 2.8 µg ekleyin. Tüpler 4 ° C 2 h için bir rotator yerleştirin.
- Protein A/G boncuk hazırlanması sırasında son 15 dk, 2 h kuluçka adım 5.2 başlar.
6. protein A/G özel boncuk hazırlık
- Kısaca girdap boncuk sağlamak için depolama tüp tamamen yeniden askıya alınmış. Bir P200 ucunu kesmek pipet ucu artırmak için temiz bir jilet kullanarak boyutu ölçer. Damlalıklı 100 µL boncuk Bulamaç başına yeni bir 1,7 mL microcentrifuge tüp içine immunoprecipitation. Bu örnekte, toplam 6 tüplerinin ihtiyaç vardır.
- 17500 x g 4 ° C'de 1 dk. için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldırmak ve atın. Boncuk lizis arabellek ve kısaca girdap 200 µL yeniden askıya alma. Spin yineleyin ve adımları 3 kez yıkayın.
- Adım 5.2 kuluçka tamamlanana kadar son yıkama boncuk Buza koyun.
7. Immunoprecipitation: Part II
- 5.2. adımdaki 2 h kuluçka sonra spin aşağı 17.500 x g 4 ° C'de 3 dk de örnekleri Santrifüjü 200 µL yıkanmış boncuk tüplerini her örnek ekleyin. Tüpler 4 ° C için 1 h bir rotator yerleştirin.
- 1 h kuluçka 17.500 x g 4 ° C'de 1 dk. için de tüpler santrifüj kapasitesi Sonraki 40 µL süpernatant, her örnekten kaldırmak ve "tükenmesi denetimi" olarak kaydetmek (Toplam 6 tüpler). Süpernatant ve atma kısmı kaldırın. Boncuk bozmamaya özen.
- Örnekleri lizis arabellek ve vortexing 200 µL kısaca ekleyerek yıkayın. 17500 x g 4 ° C'de 1 dk. için de santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldırmak ve atın. Yıkama tekrarlayın ve adımları 3 kere dön. Boncuk bu adımları uyguladığınızda bozmamaya özen.
- Yıkama adımları tamamladıktan sonra 2 x örnek arabelleği 50 µL boncuk içeren her örnek ekleyin. Diğer örnekler için örnek arabellek x 6 8 µL ekleyin: "giriş", "elüsyon giriş denetimleri" ve "tükenmesi denetimi".
- Bir kez arabellek tüpler, yukarı ve aşağı karıştırmak ve tüm örneklerini SDS-sayfa işlemine devam etmeden önce 5 min için 95 ° c ısı damlalıklı eklenir.
8. sonuçlarının analizi/doğrulama
- Başarılı CK2 bağlı thiophosphorylation ve alkillenme doğrulayın.
- CK2-aracılı thiophosphorylation adım 2.2 etkinliğini belirlemek için SDS-sayfa ve Western Blot 15-20 µL "Adım %5.1 12,5 polyacrylamide jel üzerinde toplanan elüsyon giriş denetimleri" çalıştırarak gerçekleştirin.
- Membranlar aşağıdaki antikorlar ile yoklama: anti-thiophosphate ester, anti-CK2α ve anti-GAPDH (veya diğer uygun yükleme denetimi). Bu adım başarılı olursa, bir gelişmiş anti-thiophosphate ester sinyal diğer iki şeritli (Şekil 2) göre "kinaz rxn" şeritte belirgin olmalıdır.
- CK2 zenginleştirilmiş sözde yüzeylerde görselleştirmek ve protein kimliği belirlenemedi.
- İmmunoprecipitation adım başarılı olursa değerlendirmek için 25-30 µL kimden adım 7,4 üzerinde ayrı bir % 12,5 polyacrylamide jel boncuklar eluted örnekleri çalıştırın. Tüm ekipmanları temiz ve giyim eldiven her zaman bu adımı sırasında kontaminasyon en aza indirmek için emin olun.
- Jel Coomassie ile zenginleştirilmiş proteinler (şekil 3) deneysel protokol çeşitli aşamalarında gelen görselleştirmek için mavi leke. Yeni razorblades kullanarak, dikkatli bir şekilde onların yaklaşık moleküler ağırlık belirterek "kinaz rxn anti-thiophosphate ester IP" şeritte tüketim benzersiz grup mevcut.
- Bu grup protein tanımlama için sıvı Kromatografi/tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) (şekil 4) gönderin. Yönetmen saptanan proteinler karşı antikor yoksa, SDS-sayfa tarafından kütle spektrometresi sonuçlarını ve immunoblotting, onaylayın giriş, tükenmiş ve IP kesirler Protokolü (şekil 4) boyunca toplanan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneysel işlemin bir şematik diyagramı şekil 1' de verilmiştir. Temel teknik GTP phosphoryl grup transferi için alışılmadık kullanabilme, CK2 temelidir. Ayrıca eksojen CK2 holoenzyme ile birlikte bir hücreye lysate GTP analog, GTPγS, endojen CK2 yüzeylerde thiophosphorylation içinde sonuçlanır. Sonraki tedavi etmen reaktif p- nitrobenzyl (PNBM) mesylate ile lysate, o zaman bir anti-thiophosphate ester antikor kullanarak immunoprecipitated olabilir bu belirli substrat proteinler üzerinde thiophosphate ester yan oluşturur ve sonuçta kütle spektrometresi tarafından tanımlanan. Şekil 2 gösteriyor Ayrıca CK2 ve GTPγS ve sonra PNBM T98G için aşağıdaki olumlu bir sonuç (glioblastoma) hücre lysate. Bu sonuçlar CK2 bağımlı thiophosphorylation ve sonraki alkillenme başarılı olduğunu göstermektedir. Beklendiği gibi Western Blot tarafından bir gelişmiş anti-thiophosphate ester sinyal tam kinaz tepki içeren şeritli ve GTPγS tek - ve PNBM sadece tedavi edilen örnekleri görülmektedir. Şekil 3 ' te gösterilen immunoprecipitated ve eluted proteinler izotip kontrol IgG veya anti-thiophosphate ester antikor varlığı veya yokluğu aşırı CK2 ve/veya GTPγS kullanarak bir Coomassie jel mavi lekeli olan. Birden çok benzersiz grup içinde lysate eksojen CK2 ve GTPγS ile inkübe sadece anti-thiophosphate ester IP şeritte belirgin olarak bu veriler olumlu bir sonuç da göstermektedir. Yıldız ile belirtilen grup jel varlığına ve protein tanımlama için kütle spektrometresi tarafından gönderilmiş. Şekil 4 kitle spektrometrik analizi protein tanımlama, yüzde kapsam ve benzersiz peptidler grup içinde protein başına tanımlanan sayısı da dahil olmak üzere tarafından alınan temsilcisi verileri gösterir. İlk on sayısı (şekil 3) gönderilen gruptan gösterilmiştir ve bilgi ile ilgili olsun veya olmasın protein daha önce CK215,16,17bir substrat belirlenmiştir. Nucleolin15, bilinen immunoprecipitated CK2 yüzeylerde birinin kimliğini SDS-sayfa ve bir anti-nucleolin antikor kullanarak belirtilen kesir immunoblotting tarafından doğrulandı.
Şekil 1: deneysel strateji şematik diyagramı. GTP analog, GTPγS, aşırı rekombinant CK2 holoenzyme ile birlikte bir hücre veya doku lysate eklenir ve yüzeylerde CK2 ancak değil diğer endojen kinazlar tarafından thiophosphorylation sağlar. Thiophosphorylated yüzeylerde sonraki thiophosphate ester yan üzerinde daha sonra immunoprecipitation (IP) yakalanır bu proteinler için sonraki kimlik oluşturma sıvı Kromatografi-tandem kütle spektrometresi () tarafından PNBM ile alkylated LC-MS/MS). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: CK2 bağlı thiophosphorylation bütün hücre lysate içinde doğrulanmasını. Tüm cep telefonu lysates T98G hücrelerden hazırlanan GTPγile S (kinaz reaksiyon) olup (GTPγS sadece) eksojen rekombinant CK2 holoenzyme içinde inkübe. PNBM daha sonra belirtilen tepkileri eklendi ve örnekleri SDS-sayfa belirtilen antikorlar ile immunoblotting ardından tarafından çözüldü. Protein molekül ağırlığı işaretleri kDa içinde gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: sözde CK2 substrat proteinlerin Immunoprecipitation. Zenginleştirme ve sözde CK2 yüzeylerde görselleştirme (üçüncü lane), birden çok benzersiz grup immunoprecipitation anti-thiophosphate ester antikorlar ile takip olarak belirgindir. Immunoprecipitates SDS-PAGE tarafından çözüldü ve jel ile Coomassie mavi lekeli. Bir yıldız ile işaretlenmiş grup jel varlığına ve protein tanımlama için kütle spektrometresi tarafından gönderilmiş. Protein molekül ağırlığı işaretleri kDa içinde gösterilir. IP immunoprecipitation =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Kimlik ve yüzeylerde CK2 vitroolarak proteinlerin onay. Kütle spektrometresi tarafından elde edilen veri hem önceden bilinen15,16,17 , hem de sözde roman CK2 yüzeylerde deneysel bu yaklaşımı kullanarak belirlendi gösterir. On proteinler eksize grubu (top) tanımlanan üst gösterilmiştir. Nucleolin, bilinen bir CK2 substrat kimliğinin bir anti-nucleolin antikor (alt) kullanarak belirtilen kesir immunoblotting tarafından doğrulandı. Protein molekül ağırlığı işaretleri kDa içinde gösterilir. IP immunoprecipitation =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Reaktif hisse senedi toplama | Reaktif son konsantrasyonu | Örnek birim dayalı hisse senedi konsantrasyonları eklendi |
| 1 M Tris pH 7.4 | 20,0 mM | 200 ΜL |
| 4 M NaCl | 20,0 mM | 50 ΜL |
| % 20 Triton X-100 | % 0.50 | 250 ΜL |
| 1 M MgCl2 | 10.0 mM | 100 ΜL |
| 1 M DTT | 0,5 mM | 5 ΜL |
| 200 mM Na3VO4 | 1.0 mM | 50 ΜL |
| 500 mM NaF | 10.0 mM | 200 ΜL |
| 500 mM β-gliserol fosfat | 10.0 mM | 200 ΜL |
| H2O | 8.945 mL | |
| + 1 tam Mini sekmesini/10 mL | 1 tablet |
Tablo 1. Lizis arabellek tarifi (10 mL, 1 X).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, karmaşık bir biyolojik örnek üzerinden protein kinaz CK2 yüzeylerde tanımlamak için nispeten basit bir biyokimyasal yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol kritik adımları CK2 enzimatik sıradışı özelliklerini temel alan ve CK2 bağlı thiophosphorylation GTPγS ve onların sonraki immunoprecipitation ve kimlik kullanarak belirli yüzey proteinleri içerir. Şimdi bu strateji insan glioblastoma hücreleri ve Drosophila yumurtalık18uyguladığınız gibi bu sonuçlar ile biz yardımcı programı ve bu yaklaşımın çok yönlülük gösterdi.
Daha önce yayımlanmış çalışmalar nicel phosphoproteomics yaklaşımları kullanarak bir dizi gerçekten başarılı roman CK2 yüzeylerde19,20,21,22, teşhis etmek için kanıtlanmış 23. ancak, bazı bu stratejileri yapmak immobilize substrat dizileri kullanılır ve uyum immobilize bir protein bir potansiyel fosforilasyon site kinaz erişilemez hale gelebilir mümkündür. Burada açıklanan tekniği fosforilasyon daha fizyolojik veya yerel ortamı (örneğin, bir hücre lysate), böylece izin veren sitesine erişilememesi olasılığını azaltır. Protein kimlik tarafından kütle spektrometresi belirlendikten sonra sözde CK2 yüzeylerde doğrulanmasını kolayca eğer belgili tanımlık substrate karşı antikorlar yönetmen işlem sırasında toplanan örnekleri üzerinde yapılabilir Bu strateji başka bir faydası nedir protein(s) ilgi mevcuttur. İçin bilinen CK2 göstermiştir gibi örneğin, standart western Blot kullanarak, bir düzeyde tükenmiş (post-IP) örnekleri ilgili protein ve anti-thiophosphate ester immunoprecipitates varlığını bir azalma dikkat etmelisiniz substrat nucleolin (şekil 4).
Bu yöntemin önemli bir sınırlama kütle spektrometresi son adım önce analiz prosedürünün bir jel desen bantlama ayrık farklılıklar ayırt etmek yeteneğine dayalı olduğunu. Böylece, düşük bolluk böyle bir durumda belirli CK2 yüzeylerde cevapsız kesinlikle mümkün ve bu nedenle görsel algılama sınırın altındaki. Eğer biri bu olasılığı hakkında söz konusu olduğunda, gümüş boyama gibi daha hassas bir yöntem Coomassie mavi kullanmak yerine bu proteinler görselleştirmek için kullanılabilir. CK2 yüzeylerde çok sayıda fizyolojik ilgili siteleri zaten fosforile vivo içindeolacağından bu strateji kullanarak tanımlanmamış olabilir olduğunu kabul bir ek unsurlardan biridir. Bu neredeyse kesin CK2 kurucu aktivite verilen durumda olmaktır. Son olarak, Ayrıca bu yöntemi sadece protein CK2 vitrosözde yüzeyler tanımlayan dikkat edilmelidir. Bunlar CK2 in vivo fizyolojik ilgili yüzeylerde olduğunu doğrulamak için sonraki deneyleri gereklidir ve bu belirli kalıntılarının fosforilasyon ise CK2 bağımlı fosforilasyon siteleri ve değerlendirilmesi yol açmak Yanıt CK2 kinaz aktivitesinin manipülasyon olarak değişmiş.
Özet olarak, aşağı akım deneysel yaklaşımlar (fosforilasyon site eşleme tarafından kesme/silme analiz, site yönettiği mutagenesis, işlev içinde in vitro ve in vivo deneyleri, vb) ile birleştiğinde bu strateji çalışma kolaylaştırmak Bu alışılmadık kinaz ve anlayışımızı CK2 birden çok biyolojik sistemlerde oynar çeşitli rolleri artacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser kısmen Pennsylvania Sağlık Bakanlığı T.I.S. bir İngiliz Milletler Topluluğu evrensel araştırma geliştirme hibe tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
- Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
- Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
- Meggio, F., Pinna, L. A. One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2. The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).
- Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
- Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
- Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
- Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
- Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
- Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
- Tawfic, S., et al. Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).
- Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
- Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).
- Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).
- Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
- Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).
- Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
- Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
- McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
- Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
- Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).
- Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460 (2013).
- Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
- Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).
