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Cancer Research

स्वचालित लाइव-सेल Imager का उपयोग करके एक साधारण माइग्रेशन/

Published: February 2, 2019 doi: 10.3791/59042
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Medical Genetics, Hunter Medical Research Institute, 2Priority Research Centre for Cancer Research, Innovation and Translation, School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle, 3Pathology North, John Hunter Hospital

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल वास्तविक समय में एक ही मंच पर कैंसर सेल प्रवास और आक्रमण की जांच एक एकीकृत विधि का वर्णन करता है, एक आसानी से reproducible और समय कुशल सेल गतिशीलता और आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए विकल्प प्रदान करते हैं ।

Abstract

कैंसर कोशिका गतिशीलता मेटास्टेसिस की दीक्षा के लिए महत्वपूर्ण है । इसलिए, सेल आंदोलन और इनवेसिव क्षमता की जांच बहुत महत्व की है । प्रवास परख एक 2d स्तर पर सेल आंदोलन के बुनियादी अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, जबकि आक्रमण परख और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं, मूल साइट से vivo कैंसर सेल विज्ञान में नकल उतार और extracellular मैट्रिक्स के माध्यम से हमला । वर्तमान प्रोटोकॉल माइग्रेशन और आक्रमण की परख के लिए एक एकल कार्यप्रवाह प्रदान करता है । साथ में वास्तविक समय HD छवियों और निर्मित विश्लेषण मॉड्यूल के लिए एकीकृत स्वचालित माइक्रोस्कोपी कैमरा के साथ, यह शोधकर्ताओं एक समय कुशल, सरल और reproducible प्रयोगात्मक विकल्प देता है. इस प्रोटोकॉल में उपभोग्य सामग्रियों और उपयोगकर्ताओं के लिए वैकल्पिक विश्लेषण विधियों में से चुनने के लिए प्रतिस्थापन भी शामिल हैं ।

Introduction

सेल प्रवास और आक्रमण महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं है कि मानव शरीर में सामान्य कार्यों, जैसे कि घाव बंद करने, गर्भाशय और स्तन ग्रंथि morphogenesis1,2,3में अपरा के आक्रमण को सक्षम कर रहे हैं । मानव शरीर इन जैविक घटनाओं का सटीक और सख्त नियंत्रण है; हालांकि, कुछ अपवाद हैं । घातक ट्यूमर, उदाहरण के लिए, इस रक्षा, प्रदर्शन असामान्य प्रसार से बचने और पड़ोसी ऊतक, जो मेटास्टेसिस कहा जाता है में आक्रमण करने में सक्षम हैं । मेटास्टेसिस कैंसर से संबंधित मृत्युदर4का प्रमुख कारण है ।

स्तन कैंसर महिलाओं में सबसे अधिक निदान कैंसर है, और दुनिया भर में विकसित देशों में5महिलाओं के बीच कैंसर से संबंधित मौत का दूसरा सबसे अधिक कारण है । स्तन कैंसर नलिकाओं या खण्डों है कि उपकला कोशिकाओं की एक या एक से अधिक परतों से मिलकर बनता है । सामान्य स्तन में, उपकला कोशिकाओं को एक दूसरे के लिए और इस तरह के ई-cadherin और integrins6के रूप में झिल्ली प्रोटीन के माध्यम से तहखाने झिल्ली का पालन. हालांकि, आक्रामक स्तन कैंसर की कोशिकाओं को उनके ध्रुवीकरण और सेल-सेल आसंजन खो दिया है, और क्लासिकल उपकला mesenchymal संक्रमण (EMT) से गुजरना और स्थानांतरित करने की क्षमता हासिल । extravasation के बाद, इन कोशिकाओं extracellular मैट्रिक्स भर में कदम (ECM) और रक्त वाहिका या लसीका प्रणाली में प्रवेश, तो intravasation और मेटास्टेटिक विकास7द्वारा पीछा किया । तंत्र को समझना जिसके द्वारा यह बहुत महत्व का होता है, क्योंकि मेटास्टेसिस कैंसर से संबंधित मृत्यु का सबसे आम कारण है और निकट कैंसर सेल प्रवास के लिए संबंधित/ कैंसर की कोशिकाओं, प्रवास और आक्रमण परख के आंदोलन कल्पना करने के लिए आदर्श 2d और 3 डी सेल आंदोलन, क्रमशः अध्ययन मॉडल हैं । प्रवासन सीधे आक्रमण जबकि कोशिकाओं के आंदोलन का आकलन microenvironment और जैविक बाधाओं नीचा करने की क्षमता के साथ बातचीत शामिल है । दो प्रक्रियाओं को एक दूसरे के पूरी तरह से स्वतंत्र नहीं हैं, के रूप में प्रवास के आक्रमण की आवश्यकता है ।

प्रवास और आक्रमण का अध्ययन करने के लिए कई विधियां विकसित की गई हैं । के रूप में क्रेमर एट अल द्वारा समीक्षित., इस तरह के घाव हीलिंग, बाड़ और सूक्ष्म वाहक परख के रूप में प्रवास परख एक सेल मुक्त क्षेत्र के लिए कोशिकाओं में स्थानांतरित करने की अनुमति, क्षेत्र के परिवर्तन का आकलन उत्पंन; जबकि, transwell और केशिका परख कोशिकाओं है कि एक आकर्षित8की ओर कदम की संख्या पर आधारित हैं । आक्रमण की परख के लिए, एक ECM पर्यावरण के लिए ECM जेल या कोलेजन के साथ उदाहरण के लिए स्थापित किया जाना है, और 3 डी आंदोलन आक्रमण क्षेत्र, दूरी और कोशिका गिनती (जैसे transwell परख, platypus परख)8निगरानी द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । आक्रमण परख का एक अंय प्रकार के लिए गैर इनवेसिव कोशिकाओं के साथ आक्रामक कोशिकाओं गठबंधन और इनवेसिव कोशिकाओं के व्यवहार का आकलन है (अंडाकार आकृति परख) । इसके बाद के संस्करण तरीकों उनके पेशेवरों और बुरा है, और एक तरीका है कि दृष्टिकोण आसान है, को दोहराना आसान है, और एक समान कार्यप्रवाह में प्रवास परख और आक्रमण परख गठबंधन प्रयोगात्मक डिजाइन में तरजीह है ।

इस प्रोटोकॉल एक जीवित सेल imager का उपयोग कर सेल प्रवास और आक्रमण की माप का वर्णन । यह एक वास्तविक समय सेल निगरानी प्रणाली एक मानक सेल संस्कृति मशीन में स्थापित है । यह कोशिकाओं या फ्लोरोसेंट लक्ष्य के लिए उपयुक्त मास्क लगाने के द्वारा सेट स्कैनिंग अंतराल और माप के अनुसार उच्च परिभाषा छवियों लेता है । प्रवास के मॉड्यूल/आक्रमण परख एक ९६-पिन खरोंच उपकरण है, जो एक ९६-अच्छी तरह से थाली में एक सेल monolayer पर सजातीय खरोंच बनाने के लिए उपयुक्त है का उपयोग भी शामिल है । तंत्र इन विट्रो घाव हीलिंग परख, एक प्लास्टिक या लेपित सतह पर 2 डी सेल आंदोलन की निगरानी पर आधारित है । आक्रमण या खरोंच घाव के भीतर एक अतिरिक्त ECM भर में 3 डी आंदोलन भी मूल्यांकन किया जा सकता है । चित्रा 1में एक संक्षिप्त कार्यप्रवाह सचित्र है ।

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Protocol

नोट: दो कक्ष रेखाओं को अलग से हैंडल किया जाना चाहिए । निंन कार्यविधियों को एक एकल कक्ष पंक्ति के लिए लागू किया जाना चाहिए यदि निर्दिष्ट नहीं है ।

1. अनुकूलन सेल घनत्व से पहले घायल

  1. T75 सेमी में संस्कृति अनुयाई कोशिकाओं2 ऊतक संस्कृति phenol में लगभग ८०% संगम के लिए कुप्पी-लाल मुक्त Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक, २०० mM L-glutamine और 2 µ g/mL इंसुलिन ३७ ° c के साथ 5% CO2 ( सबसे कैंसर सेल लाइनों के लिए मानक गर्मी की स्थिति, संस्कृति योगों सेल लाइन पर निर्भर हैं) ।
  2. एक अपशिष्ट कंटेनर में बंद pipetting द्वारा संस्कृति मीडिया निकालें । प्लास्टिक के 2 मिलीलीटर पूर्व गर्म ०.१% trypsin-EDTA को संक्षेप में कुल्ला करने के लिए सेल monolayer और प्लास्टिक बंद । ०.१% trypsin के एक और 2 मिलीलीटर जोड़ें-EDTA और 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मानक गर्मी की स्थिति के तहत कुप्पी जगह है ।
  3. धीरे से कोशिकाओं की टुकड़ी सुनिश्चित करने के लिए कुप्पी नल और फिर proteolytic प्रतिक्रिया को रोकने के लिए पूर्व गर्म संस्कृति मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
  4. एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए २०० x g पर नीचे स्पिन (आरटी) । ध्यान से सेल गोली आंदोलन के बिना supernatant निकालें और एक और 10 मिलीलीटर पूर्व गर्म संस्कृति मीडिया के साथ resuspend ।

2. एक स्वचालित सेल काउंटर (या किसी भी गिनती तरीकों का उपयोग कर कक्ष संख्या गिनती)

  1. पतला २०० µ के साथ resuspend सेल निलंबन के ८०० µ l के साथ 1x Dulbecco की फास्फेट बफर खारा (DPBS) में एक १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब ।
  2. सेल काउंटर के लिए एक ६० µm सेल गणना सेंसर संलग्न, टॉगल नीचे पकड़ और सेल निलंबन में टिप विलय । धीरे से सेल निलंबन सफलतापूर्वक संवेदक में तैयार की है जब तक टॉगल जारी । कोशिका एकाग्रता कोशिकाओं में प्रदर्शित किया जाता है/
  3. 10 एमएल सेल सस्पेंशन में सेल नंबर की गणना करें ।

3. सेल चढ़ाना

  1. प्लेट कोशिकाओं की एक श्रेणी में सेल घनत्व (40000-90000 कोशिकाओं/तपसिल में एक ९६ अच्छी तरह से थाली में ।
  2. जियो-सेल imager में प्लेट प्लेस, और हर 2 एच के लिए 24 एच स्कैनिंग अनुसूची ।
    1. सॉफ़्टवेयर में, कार्य सूची से स्कैन शेड्यूल करेंक्लिक करें । दराज सेटअप फलक में, प्लेट की स्थिति का निर्धारण, पोत जोड़ें क्लिक करें और प्लेट प्रकार चुनें । स्कैन सेटअप फलक में, चुनें या प्रायोगिक प्लेट सेटअप के अनुसार स्कैन पैटर्न को संपादित करें, और मानकके रूप में स्कैन प्रकार सेट.
    2. समयरेखा पर दायां क्लिक करें और सेट अंतरालका चयन करें । एक 24-एच अनुसूची में प्रत्येक 2 घंटे के लिए स्कैन जोड़ें सेट करें । लागूकरेंक्लिक करें ।

4. माइग्रेशन परख के लिए इष्टतम कोशिका बोने की सघनता निर्धारित करें

  1. Stसेशन स्कैनिंग 24 ज के बाद, संगम प्रसंस्करण विश्लेषण उपकरण लागू करने के लिए HD-चरण कंट्रास्ट छवियों को स्वचालित रूप से एकत्र, और समय के खिलाफ एक सेल प्रसार वक्र उत्पंन करते हैं ।
    1. 3-6 प्रतिनिधि छवियों का निर्धारण और उंहें एक नई छवि संग्रहमें जगह है ।
    2. प्रसंस्करण परिभाषाके रूप में एक उचित मुखौटा निर्धारित करें ।
    3. कोई विश्लेषण कार्य लॉंच करना ।
    4. निर्धारित समय के खिलाफ संगम के अनुसार अनुकूलित सेल घनत्व (6 -18 एच के भीतर लगभग १००% संगम जब प्रवास परख शुरू के आधार पर) ।
      नोट: यह संगम करने के लिए कोशिकाओं को विकसित करने के लिए लेता है समय की मात्रा बोने कमजोर पड़ने के आधार पर बदलता है ।

5.1 दिन और 2: प्रवास और आक्रमण परख के लिए तैयारी

  1. 1 दिन पर, कोट आक्रमण परख के लिए थाली ।
    नोट:     ECM जेल हमेशा बर्फ पर और सुझाव है कि रात भर फ्रिज में रखा गया है के साथ संभाला जाना चाहिए ।
    1. पतला ECM जेल बर्फ के साथ-शीत संस्कृति मीडिया १०० µ g/एमएल और जोड़ें ५० µ पतला ECM जेल के एल/
    2. मानक मशीन रात भर की स्थिति में थाली प्लेस ।
  2. 2 दिन पर, धीरे से अतिरिक्त मीडिया महाप्राण । २ ९६ में अनुकूलित सेल घनत्व के साथ प्लेट कोशिकाओं-अच्छी तरह से प्रवास परख के लिए नामित (अनकोट) और आक्रमण परख (लेपित) triplicates में देर से दोपहर में 1-3 वर्गों के बाद (वर्तमान प्रोटोकॉल में, के लिए अनुकूलित सीडिंग घनत्व ZR75-1 और एमडीएस-एमबी-२३१ 90000/अच्छी तरह से और 50000/
  3. मानक मशीन रात भर की स्थिति में प्लेटों प्लेस ।

6.3 दिन: घाव खरोंच

  1. स्प्रे और उंहें सुरक्षा मंत्रिमंडल में रखने से पहले ७०% इथेनॉल के साथ खरोंच उपकरण और 2 धोने नौकाओं पोंछ । धो नाव 1 और 2 बाँझ (autoclaved) आसुत जल और ७०% इथेनॉल क्रमशः के साथ ठीक ४५ मिलीलीटर भरें ।
  2. नसबंदी के लिए, 5 मिनट प्रत्येक के लिए वाशिंग नाव 1 और 2 पर स्क्रैच उपकरण पिन ब्लॉक (ऊपर) रखें ।
  3. प्रवास परख थाली के साथ शुरू करो ।
    1. मशीन से कोशिकाओं को युक्त हटो और सुनिश्चित करें कि कोई अच्छी तरह से खरोंच उपकरण की क्षति से बचने के लिए सूखी है । प्लेट कवर निकालें और स्क्रैच उपकरण के आधार प्लेट धारक में डालें, और ध्यान से dowels मार्गदर्शक द्वारा आधार भाग पर शीर्ष हिस्सा जगह है । प्रेस और काले लीवर पकड़, और इस बीच ध्यान से पिन ब्लॉक उठा । प्रत्येक कुआं में अंतराल आमतौर पर नग्न आंखों के साथ और माइक्रोस्कोप के नीचे दिखाई दे रहे हैं ।
    2. जल्दी से पानी में पिन सोख; इस खरोंच उपकरण साफ करने के लिए पहले आक्रमण परख प्लेट scratching अगर प्लेट सेटअप समान है करने के लिए पर्याप्त है । अंयथा, बाँझ आसुत जल के साथ नसबंदी कदम दोहराने और फिर 5 मिनट प्रत्येक के लिए ७०% इथेनॉल ।
  4. थाली धो पूर्व गर्म संस्कृति मीडिया के साथ 1 या 2 बार अलग कोशिकाओं या सेल शीट से बचने के लिए अच्छी तरह से पुनः अनुलग्न ।
  5. के साथ या उपचार के बिना नामित कुओं में ताजा गर्म मीडिया के १०० µ एल जोड़ें ।
  6. आक्रमण परख के लिए अतिरिक्त कदम ।
    1. equilibrate के लिए 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर आक्रमण परख थाली प्लेस और ध्यान से ठंडा मीडिया महाप्राण ।
    2. पतला ECM जेल बर्फ के साथ-शीत संस्कृति मीडिया 5 मिलीग्राम/एमएल, ५० µ नामित कुओं में पतला ECM जेल के एल जोड़ने के लिए, और मानक मशीन के तहत 30 मिनट के लिए जगह है ।
    3. के साथ या परीक्षण यौगिकों के बिना गर्म अप मीडिया के १०० µ एल जोड़ें ।
  7. थाली को जियो-सेल imager में लगाएं और इसे 5 मिन के लिए equilibrate दें । imagelock प्लेट के रूप में पोत प्रकार चुनें । सेट स्कैन प्रकार खरोंच घावके रूप में, चुनें या संपादित करें प्रयोगात्मक प्लेट सेटअप (1 छवि/अच्छी तरह से और व्यापक मोड) के अनुसार स्कैन पैटर्न और अनुसूची 24-एच ७२ के लिए हर 1-2 एच स्कैनिंग दोहराने जब तक घाव चंगा कर रहे हैं ।
  8. स्क्रैच उपकरण को साफ करने के लिए, निंनलिखित समाधानों में से प्रत्येक में शीर्ष पिन ब्लॉक रखो (धुलाई नौकाओं में ४५ मिलीलीटर) 5 मिनट के लिए: ०.५% डिटर्जेंट 1 ( सामग्री की तालिकादेखें), 1% डिटर्जेंट 2 ( सामग्री की तालिकादेखें), बाँझ आसुत पानी और ७०% इथेनॉल । स्क्रैच उपकरण को वापस अपनी आधार प्लेट पर रखें और धूल-मुक्त वातावरण में स्टोर करें ।

7. डेटा विश्लेषण

  1. निर्दिष्ट प्लेट स्कैनिंग बंद करो के बाद सभी घावों दराज सेटअप पर प्रयोगात्मक प्लेट चुनने और पोत को हटानेपर क्लिक करके चंगा किया है ।
  2. इकट्ठा 3-6 प्रतिनिधि छवियों को सही घाव के बाद छवियों सहित ध्वनि प्रतिशत की एक सीमा फैले, 10% और ५०% द्वारा घाव बंद ।
  3. एक उचित प्रसंस्करण परिभाषा का निर्धारण करने के लिए, उचित खरोंच घाव मास्क और संगम मुखौटालागू करने के लिए फॉल्ट समायोजन, सफाई और फिल्टर का उपयोग करें । मास्क की शुद्धता देखने के लिए पूर्वावलोकन वर्तमान/
  4. विश्लेषण कार्य लॉंच ।
  5. डेटा सॉफ्टवेयर के भीतर विश्लेषण किया जा सकता है या आगे विश्लेषण के लिए निर्यात । तीन मीट्रिक सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान की HD चरण छवियों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता: घाव चौड़ाई (µm), घाव संगम (%) और सापेक्ष घाव घनत्व (%) । तुलना निम्न अनुभाग में चर्चा की जाएगी ।

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Representative Results

इस प्रवास/आक्रमण परख घाव हीलिंग परख है, जो एक सेल मुक्त ९६-पिन स्क्रैच उपकरण के द्वारा बनाई गई क्षेत्र में जाने की कोशिकाओं की दर का मूल्यांकन पर आधारित है । प्रवास और आक्रमण परख के बीच अंतर कर रहे है कि प्रवास परख उपाय ऊतक-संस्कृति प्लास्टिक की सतह और आक्रमण के उपायों कोशिकाओं ECM जेल के पार जा रहा इलाज पर चलती कोशिकाओं ।

स्क्रैच उपकरण निर्दिष्ट प्लेट में लगातार खरोंच घाव बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है और लाइव सेल imager बीच में खरोंच घावों के साथ वास्तविक समय उच्च संकल्प छवियों को लेने के लिए बनाया गया है । दो स्तन कैंसर सेल लाइनों वर्तमान प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया ZR75-1 और एमडीए-एमबी-२३१, चमकदार बी और ट्रिपल नकारात्मक उपप्रकार के रूप में वर्गीकृत क्रमशः9रहे हैं । खरोंच ९६-पिन खरोंच उपकरण द्वारा उत्पंन सामांयतः 700-900 µm के बीच हैं, लेकिन विभिंन सेल लाइनों (चित्रा 2) के बीच भिंन हो सकते हैं ।

माइग्रेशन परख के लिए, तीन मीट्रिक प्रदान की जाती हैं: (1) घाव की चौड़ाई (µm) घाव के बगल में कक्ष पत्रकों के बीच औसत दूरी (चित्रा 3) है । (2) घाव संगम (%) घायल क्षेत्र के भीतर संगम (चित्रा 3) है । आदर्श प्रारंभिक घाव संगम 0% के करीब होना चाहिए । (3) सापेक्ष घाव घनत्व (%) एक पृष्ठभूमि-घटाई एल्गोरिथ्म [% सापेक्ष घाव घनत्व = १०० * (डब्ल्यू(टी)- डब्ल्यू(0))/(सी(टी)- डब्ल्यू(0)), टी = समय टी, डब्ल्यू = घाव क्षेत्र का घनत्व , सी = कोशिका क्षेत्र के घनत्व], कोशिका क्षेत्र के घनत्व के सापेक्ष घाव क्षेत्र के घनत्व को मापने.

जरूरत के आधार पर तीन पात्र मीट्रिक हासिल किए जा सकते हैं । रिश्तेदार घाव घनत्व और घाव संगम खरोंच घाव क्षेत्र पर कब्जा कोशिकाओं की गति मतलब है, और वे लगभग दोनों सेल लाइनों में ओवरलैप । लेकिन दो सेल लाइनों बहुत अलग घाव भरने की क्षमता है, जहां पूरा होने पर (लगभग ५० ज) एमडीए के घाव भरने की प्रक्रिया एमबी-२३१ कोशिकाओं, ZR75-1 कोशिकाओं के बारे में ५०% घाव कवरेज था दिखाया (दो मैट्रिक्स ऊपर) और ४०० से अधिक µm शेष घाव चौड़ाई, ZR75-1 कोशिकाओं (चित्रा 4) की एक कम माइग्रेशन क्षमता का संकेत है.

दो कक्ष प्रकार के माइग्रेट व्यवहार भिंन थे और रिकॉर्ड की गई छवियों के आधार पर तुलना की जा सकती हैं । माइग्रेशन की शुरुआत में प्रवासन के मोर्चे पर एमडीए-एमबी-२३१ कक्षों में Lamellipodia (blebbing दखलंदाजी) मनाया गया, जो cytoskeleton पुनर्व्यवस्था का एक विशिष्ट संकेत था, सेल मुक्त क्षेत्र10 की ओर सेल आंदोलन निर्देशन (चित्रा 5 ). ZR75-1 कक्षों में एक ही समय-बिंदु (चित्रा 5) पर कक्ष माइग्रेशन का कोई चिह्न नहीं दिखाया गया.

मीट्रिक सापेक्ष घाव घनत्व सेल आक्रमण के लिए निर्माता द्वारा सिफारिश की है, के रूप में यह एक 3 डी परख है, और संगम आधारित विश्लेषण लागू नहीं है । भीतर ५० ज, एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं के सापेक्ष घाव घनत्व संतृप्त किया गया था (१००%), ZR75-1 कोशिकाओं के सापेक्ष घाव घनत्व समय के साथ बदल नहीं किया था, एमडीए के अत्यधिक इनवेसिव phenotype-एमबी-२३१ कोशिकाओं और ZR75-1 कोशिकाओं की गैर इनवेसिव का संकेत है ( चित्रा 6) ।

एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं को भी अलग ढंग से व्यवहार किया जबकि ECM जेल (चित्रा 7) के माध्यम से हमला । प्रवास के मोर्चे पर bleb के साथ कोशिकाओं की तुलना में, हमलावर कोशिकाओं अग्रणी दखल के साथ एक लंबी आकृति विज्ञान दिखाया ।

Figure 1
चित्रा 1 : वर्तमान प्रोटोकॉल में प्रवासन और आक्रमण परख के कार्यप्रवाह । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : स्तन कैंसर सेल लाइनों पर खरोंच उपकरण का प्रदर्शन ZR75-1 और एमडीए-एमबी-२३१ (ऊपरी पैनल) मापा प्रारंभिक घाव चौड़ाई और प्रारंभिक घाव संगम (लोअर पैनल) के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : माइग्रेशन परख एमडीए-एमबी-२३१ में मास्क के साथ एचडी चरण कंट्रास्ट छवियों और मिश्रित मोड द्वारा सचित्र । नीला, खरोंच घाव; पीला, खरोंच आसपास के कोशिकाओं घाव; गुलाबी, कोशिकाओं है कि खरोंच के बाद 24 ज पर घाव में चला गया । स्केल बार्स = ३०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4 : तीन एल्गोरिदम की तुलना (घाव की चौड़ाई, सापेक्षिक घाव घनत्व और स्तन कैंसर कोशिका लाइनों के घाव संगम ZR75-1 (बाएं) और एमडीए-एमबी-२३१ (दाएं) । सभी प्रयोगों तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य का प्रतिनिधित्व करते हैं, ± S.D. पैमाने सलाखों = ३०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5 : प्रवासन के सामने ZR75-1 और एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं 4 एच खरोंच के बाद । तीर, प्रवास के मोर्चे पर lamellipodia । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : ठहराव का उपयोग कर आक्रमण की मीट्रिक सापेक्ष घाव घनत्व (%) स्तन कैंसर सेल लाइन ZR75-1 (बाएं) और एमडीए-एमबी-२३१ (दाएं) । सभी प्रयोगों तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं, ± S.D. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : एमडीए के विभिंन सेलुलर विशेषताओं-एमबी-२३१ प्रवास में कोशिकाओं (बाएं) और आक्रमण (दाएं) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8 : एक खरोंच घाव है कि एकीकृत प्रवासन मॉड्यूल द्वारा एक ९६-अच्छी तरह से थाली से विश्लेषण नहीं किया जा सकता का एक उदाहरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

माइग्रेशन और आक्रमण कैंसर कोशिकाओं की गतिशीलता का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं । ९६-पिन खरोंच उपकरण का उपयोग करके, यह एक साथ 2d और 3 डी में घाव हीलिंग परख आचरण करने के लिए संभव है । इसके अलावा स्वचालित स्कैनिंग को सुविधाजनक बनाने, ंयूनतम व्यवधान के साथ एक स्थिर सेल संस्कृति वातावरण प्रदान करने, खरोंच परख ९६-पिन खरोंच उपकरण का उपयोग किए जाने के अनुरूप खरोंच प्रदान करता है, प्रयोगों है कि अधिक मजबूत कर रहे है सक्षम करने और reproducible. ९६-खैर प्लेट स्वरूप या तो सेल लाइनों या अलग दवा उपचार की संख्या में वृद्धि के अतिरिक्त विकल्प देता है । इसके अलावा, कक्ष आकृति विज्ञान परिवर्तन और गतिशील आंदोलन आगे विश्लेषण के लिए दर्ज किया जा सकता है ।

माइग्रेशन/आक्रमण परख आसानी से कुछ पूर्वापेक्षाओं के साथ लागू करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । एक धाराप्रवाह सेल monolayer के अंतर की ओर एक निर्देशित सेल आंदोलन को सुनिश्चित करने के लिए घाव भरने से पहले महत्वपूर्ण है । इसलिए यह अत्यधिक सेल बीज घनत्व का अनुकूलन करने की सिफारिश की है, और 6-18 एच के बीच एक समय सीमा आम तौर पर आदर्श है । सतह और प्रसार दर के लिए संलग्न प्रयोगात्मक कोशिकाओं की क्षमता इस समय सीमा को प्रभावित करेगा । लंबे समय तक तैयार करने के लिए मजबूत सेल-सेल आसंजन का नेतृत्व कर सकते हैं और सेल शीट को हटाने के कारण कुटिल द्विपक्षीय कोशिका के सामने उत्पन्न होते हैं । एक-मैट्रिक्स कोटिंग कम चिपकने वाला सेल लाइनों के साथ उपयोगी हो जाएगा, प्रतीक्षा समय कम करने के लिए । कोशिकाओं को घायल होने से पहले भूखे हो सकते हैं । भुखमरी समय खरोंच के समान है, जो है जब संगम लगभग १००% तक पहुंच जाता है, और भुखमरी मीडिया और अवधि के सेल प्रकार निर्भर हैं । कोशिकाओं को भी transfected जा सकता है, लेकिन बीज बोने का घनत्व है एक लंबे समय के लिए घाव से पहले निर्धारित किया जाना है, अभिकर्मक प्रक्रिया की मशीन समय पर विचार । घायल ९६-पिन खरोंच उपकरण का उपयोग कर कुछ सेकंड के भीतर प्राप्त किया जा सकता है । परिभाषित-पिन आकार एक सटीक प्रवास की गारंटी/ महत्वपूर्ण बात, ऊपर और नीचे वर्गों अच्छी तरह से करने के लिए कुओं में एक पूर्ण खरोंच पूरा गठबंधन होना चाहिए, ताकि रहते सेल छवियों खरोंच घावों के टर्मिनल या तो शामिल नहीं है । खरोंच घाव आसानी से धाराप्रवाह सेल monolayer पर नग्न आंखों के माध्यम से मनाया जा सकता है और जल्दी से एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत जांच की जा सकती है । कुओं की धुलाई तुरंत और धीरे से किया जाना चाहिए बेदखल कोशिकाओं के पुनर्लगाव और द्विपक्षीय कोशिकाओं को हटाने से बचने के लिए । यदि एक धोने के लिए वांछित सेल मुक्त क्षेत्र को साफ करने के लिए पर्याप्त है, वहां एक अतिरिक्त धोने के लिए कोई ज़रूरत नहीं है ।

प्रवास परख के साथ या उपचार के बिना संस्कृति मीडिया को जोड़ने के द्वारा अंतिम रूप दिया जा सकता है और स्कैन करने के लिए तैयार हैं, जबकि कुछ अतिरिक्त कदम के लिए एक आक्रमण परख के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए । सेल प्रवास के विपरीत, हमलावर कोशिकाओं ECM, जो और अधिक बारीकी से बेहतर vivo सेल आंदोलन में प्रतिबिंबित करता है के माध्यम से घुसना । वर्तमान प्रोटोकॉल के प्रमुख ECM जेल का उपयोग करके एक ECM-घिरा वातावरण उत्पन्न करने के लिए है । कोशिकाओं ECM जेल-लेपित कुओं पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और घाव के बाद, ECM जेल कोशिकाओं और खरोंच घाव पर स्तरित है । ECM जेल हैंडलिंग करते समय, यह जमाना से बचने के लिए सब कुछ ठंडा रखने के लिए बेहतर है । असमान वितरित ECM जेल समस्या पैदा कर सकता है जब माइक्रोस्कोप ध्यान केंद्रित । ECM जेल की चिपचिपा प्रकृति के कारण, यह बुलबुले उत्पन्न करने के लिए संभव है, लेकिन बुलबुले आसानी से एक स्प्रे बोतल के माध्यम से aspirating ७०% इथेनॉल से हटाया जा सकता है । ठीक है, लेकिन नहीं अत्यधिक स्प्रे उत्पंन करने के लिए, बस स्प्रे बोतल की टोपी खोल देना और कहीं ओर इशारा करते भूसे के भीतर अतिरिक्त ७०% इथेनॉल बंद स्प्रे । ऊपर एक दूरी और प्लेट को क्षैतिज में छिड़काव करके, ठीक ७०% इथेनॉल स्प्रे बुलबुले को खत्म करने के लिए पर्याप्त है ।

पहले स्कैन के रूप में संभव के रूप में जल्द ही शुरू करना चाहिए घायल, प्रारंभिक सेल मुक्त घाव क्षेत्र पर कब्जा करने के लिए, और इस विश्लेषण के लिए मानदंड स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है । स्कैन अंतराल सेल प्रकार पर निर्भर करते हैं, के रूप में अधिक इनवेसिव सेल लाइनों एक अधिक तेजी से घाव बंद करने की दर है ।

इस प्रवास/आक्रमण आवेदन अपेक्षाकृत सरल है, और निर्मित विश्लेषण मॉड्यूल का उपयोग करके, सेल आंदोलन 3 मैट्रिक्स के साथ काइनेटिक ग्राफ किया जा सकता: घाव चौड़ाई, घाव संगम और रिश्तेदार घाव घनत्व (चित्रा 3) । सभी तीन माइग्रेशन का आंकलन किया जा सकता है । घाव की चौड़ाई µm में औसत दूरी का वर्णन करता है जब द्विपक्षीय सेल शीट अपेक्षाकृत समानांतर चलते हैं, और प्रारंभिक घाव सीमा से स्वतंत्र है । घाव संगम और रिश्तेदार घाव घनत्व, इसके विपरीत, गणना में प्रारंभिक घाव सीमा की आवश्यकता होती है, और घाव क्षेत्र के भीतर संगम और जख्मी क्षेत्र के सापेक्ष कोशिका घनत्व का वर्णन, क्रमशः । आक्रमण परख के लिए, सापेक्ष घाव घनत्व की सिफारिश की है, क्योंकि यह द्विपक्षीय सेल शीट के संदर्भ में घाव क्षेत्र की गणना । पाठक एक है कि सबसे अच्छा उनकी आवश्यकताओं का प्रतिनिधित्व करता है चुन सकते हैं ।

इस खरोंच घाव प्रवास/आक्रमण परख सुविधाजनक हो सकता है, लेकिन यह ९६-पिन खरोंच उपकरण, नामित प्लेटों की आवश्यकता है, और इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत ठेठ परिणामों को पुन: पेश करने के लिए एकीकृत प्रवास/आक्रमण मॉड्यूल के साथ रहते सेल imager, और ये महंगा हो सकता है । इस तरह के एक फ्लैट नीचे ९६ के रूप में लागत प्रभावी प्रतिस्थापन-अच्छी तरह से multiwell प्लेट इस्तेमाल किया जा सकता है और सभ्य खरोंच घाव उत्पन्न कर सकते हैं (नहीं दिखाया गया डेटा). हालांकि, खरोंच उपकरण के प्रदर्शन के रूप में जब नामित प्लेट इस्तेमाल किया गया था के रूप में अच्छा नहीं था, और कुछ घावों स्कैनिंग मोड (चित्रा 8) द्वारा नहीं उठाया जा सकता है, इस प्रकार सही ढंग से प्रारंभिक घाव क्षेत्र को परिभाषित करने में असमर्थ । इसके अतिरिक्त, खरोंच उपकरण, या तो मैंयुअल रूप से विश्लेषण के साथ खरोंच घाव बनाने के लिए, छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम के द्वारा, या अंय अंत बिंदु विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण उपकरणों का उपयोग किया जा सकता है । वे प्रारंभिक घावों का पता लगाने के लिए और अधिक लचीलापन प्रदान करते हैं, और इसलिए निर्दिष्ट प्लेटों तक ही सीमित नहीं हैं । दूसरी ओर, प्रवास/आक्रमण परख वर्तमान प्रोटोकॉल में लाइव सेल इमेजिंग के साथ संयुक्त कम समय लेने वाली और कम त्रुटि प्रवण है । यह प्रयोगात्मक निरंतरता और वृद्धि की क्षमता के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है ।

अंत में, इस प्रवास/आक्रमण परख त्वरित, आसान और मजबूत है । उपयोगकर्ता अपनी जरूरत और बजट के आधार पर हमारे प्रोटोकॉल और दूसरों से चुन सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम हंटर चिकित्सा अनुसंधान संस्थान (HMRI 13-02) के माध्यम से Bloomfield समूह फाउंडेशन द्वारा हमारे धन का समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं । X. Z न्यूकैसल विश्वविद्यालय और HCRA के माध्यम से एक आपा छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है मार्क्स प्रमुख पीएचडी छात्रवृत्ति ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% trypsin-EDTA solution (10x) ThermoFisher Scientific 30028-02 Dilute to 2x in DPBS
Countess II FL Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX1000 Automated cell counter
Detergent 1 (Alconox) Sigma-Aldrich 242985 0.5% working concentration
Detergent 2 (Virkon S) VetProduct DIRECT 1% working concentration
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red ThermoFisher Scientific 21063-045 Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin
ECM Gel (matrigel) Sigma-Aldrich E6909 Growth-factor reduced, phenol red free
Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom Essen 4379
EVE Counting slides BioTools EVS-50
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen Biologicals SFBS-F-500ml
IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories Essen 4444 Including CoolBox, 2x CoolSink
IncuCyte Cell migration kit Essen 4493 Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software
IncuCyte ZOOM Essen Live cell analysis system
Insulin solution human Sigma-Aldrich 19278-5ML
L-glutamine solution (100x) ThermoFisher Scientific 25030-091
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area Greiner Bio-One 658175

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १४४ प्रवासन आक्रमण लाइव सेल इमेजिंग स्तन कैंसर मेटास्टेसिस extracellular मैट्रिक्स (ECM) जेल
स्वचालित लाइव-सेल Imager का उपयोग करके एक साधारण माइग्रेशन/
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Zhang, X., Morten, B. C., Scott, R.… More

Zhang, X., Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager. J. Vis. Exp. (144), e59042, doi:10.3791/59042 (2019).

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