Summary
Gjeldende protokollen beskriver en integrert metode etterforsket kreft celle migrasjon og invasjon på en enkelt plattform i sanntid, gir en lett reproduserbare og tidseffektive alternativ celle mobilitet og morfologi.
Abstract
Kreft cellen mobilitet er avgjørende for initiering av metastasering. Derfor er undersøkelser av cellen bevegelse og invasiv kapasitet av stor betydning. Migrasjon analyser gir grunnleggende innsikt celle bevegelse på et 2D nivå, mens invasjonen analyser er mer fysiologisk relevant, etterligne i vivo kreft celle dislodgment fra det opprinnelige nettstedet og invaderte gjennom den ekstracellulære matrisen. Gjeldende protokollen gir en enkelt arbeidsflyt for migrasjon og invasjonen analyser. Sammen med integrert automatisert mikroskopiske kameraet for sanntids HD-bilder og innebygde analysis-modulen gir forskere en tid-effektiv, enkel og reproduserbar eksperimentelle alternativet. Denne protokollen inneholder også erstatninger for rekvisita og alternative analysen metoder for brukerne å velge mellom.
Introduction
Celle migrasjon og invasjonen er viktige biologiske prosesser som gjør vanlige funksjoner i kroppen, som såret nedleggelse, invasjonen av morkaken i livmor og melkekjertlene morphogenesis1,2,3. Menneskekroppen har presis og streng kontroll av biologiske; Det finnes imidlertid noen unntak. Ondartede svulster, for eksempel kan unnslippe denne beskyttelsen, utstilling unormal spredning og invadere i nærliggende vev, som kalles metastasering. Metastasering er den viktigste årsaken til kreft dødelighet4.
Brystkreft er mest vanlig diagnosen kreft hos kvinner, og er den nest høyeste årsaken til kreft-relaterte dødsfall blant kvinner i utviklede land verden over5. Brystkreft stammer fra kanaler eller lobules former som består av ett eller flere lag av epitelceller. I normal brystet følge epitelceller hverandre og kjelleren membranen gjennom membran proteiner som E-cadherin og integrins6. Imidlertid invasiv brystkreft celler har mistet sin polaritet og celle-celle adhesjon, klassisk gjennomgå epithelial mesenchymal overgang (EMT) og få muligheten til å flytte. Etter bloduttredelse, disse cellene flytte over den ekstracellulære matrisen (ECM) og angi blodkaret eller lymfesystemet, deretter etterfulgt av intravasation og metastatisk vekst7. Forstå mekanismene som dette oppstår er av stor betydning, siden metastasering er den vanligste årsaken til kreft relatert dødelighet og er nært knyttet til kreft celle migrasjon/invasjon. For å visualisere bevegelsen av kreftceller, er migrasjon og invasjonen analyser ideelle modeller å studere 2D og 3D celle bevegelse, henholdsvis. Migrasjon vurderer direkte bevegelse av cellene mens invasjonen innebærer microenvironment og muligheten til å svekke biologiske barrierer. De to prosessene er ikke uavhengig av hverandre, som overføring er et krav for invasjon.
Flere metoder har blitt utviklet for å studere migrasjon og invasjon. Som vurdert av Kramer et al., overføring analyser for eksempel sårheling, generere gjerdet og mikro-carrier analyser en celle fritt område slik at cellene skal flyttes til vurdering av endring av området. mens transwell og kapillær analyser er basert på antall celler som beveger seg mot en attractant8. For invasjonen analyser, et ECM-miljø har å bli satt opp med ECM gel eller kollagen for eksempel, og 3D bevegelse kan vurderes ved å overvåke invasjonen området, avstand og celle teller (f.eks transwell analysen, platypus analysen)8. En annen type invasjonen analysen er å kombinere invasiv cellene med ikke-invasiv celler og vurdere atferden til invasiv cellene (f.eks spheroid søk). Metodene ovenfor har sine fordeler og ulemper, og en måte som er lett å tilnærming, enkelt å gjenta, og kombinerer migrasjon analysen invasjonen analysen i en lignende arbeidsflyt er fortrinnsrett i eksperimentell design.
Denne protokollen beskriver måling av celle migrasjon og invasjonen med en live-celle imager. Det er en sanntid celle overvåkingssystem installert i en standard celle kultur inkubator. Det tar høydefinisjonsbilder ifølge sett skanning intervaller og mål ved å bruke riktig masker i celler eller fluorescerende mål. Modulen overføring/invasjonen analysen omfatter bruker 96-pinners avlysning, som er egnet for å lage homogen scratch sår på en celle monolayer i en 96-brønns plate. Mekanismen er basert på i vitro sår helbredelse analyser, overvåking 2D celle bevegelse på en plast eller bestrøket overflate. Invasjon eller 3D bevegelse over en ekstra ECM i scratch sår kan også vurderes. En kort arbeidsflyt er illustrert i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: To linjer skal håndteres separat. Følgende bør være brukt på én enkelt celle linje hvis ikke angitt.
1. optimalisere celle tetthet før såret
- Kultur tilhenger celler i MT75 cm2 vev kultur kolber ca 80% samløpet i fenol-rød gratis Dulbecco endret Eagle Medium (DMEM) med 10% fosterets bovin serum (FBS), 200 mM L-glutamin og 2 µg/mL insulin på 37 ° C med 5% CO2 ( standard inkubasjon forhold for de fleste kreftcelle linjer, kultur formuleringer er cellen linje-avhengige).
- Fjerne kultur media ved pipettering av i en avfallsbeholderen. Pipetter 2 mL forvarmes 0,1% trypsin-EDTA kort skylle den cellen monolayer og Pipetter av. Legge til en annen 2 mL 0,1% trypsin-EDTA og plasser kolbe under standard inkubasjon forhold ved 37 ° C i 5 minutter.
- Trykk forsiktig kolbe slik avdeling av cellene og tilsett 10 mL forvarmes kultur medier å stoppe proteolytisk reaksjonen.
- Overføre celle suspensjon i en 15 mL sentrifuge rør og Nedspinning 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Nøye fjerne nedbryting uten agitating celle pellets og resuspend med en annen 10 mL forvarmes kultur medier.
2. teller celle nummer bruker en automatisert celle teller (eller noen teller metoder)
- Fortynne 200 µL resuspended celle hjuloppheng med 800 µL av 1 x Dulbeccos fosfat bufret saltvann (DPBS) i en 1,5 mL sentrifuge rør.
- Knytte en 60 µm celle teller sensor til celle telleren, hold nede veksle og flette spissen i cellen suspensjon. Langsomt slipp veksle til celle suspensjon er er trukket inn i sensoren. Cellen konsentrasjon vises i celler/mL.
- Beregne hvor celle i 10 mL celle suspensjon.
3. celle Plating
- Plate celler i en rekke celle tettheter (40.000-90.000 celler/vel) i tre eksemplarer i en 96-brønns plate.
-
Plasser platen i live-celle imager, og planlegge skanning hver 2 h 24 h.
- I programmet klikker du planlegge søk fra oppgavelisten. Ruten skuff oppsett bestemme plasseringen av platen, klikk Legg til fartøyet og velg plate. I ruten Skanne oppsett , velge eller redigere skanning mønsteret i henhold til eksperimentelle plate oppsettet og angi Scan Type som Standard.
- Høyreklikk tidslinjen , og velg Angi intervaller. Angi Legge skanner hver 2t 24t tidspunktet. Velger du Bruk.
4. Fastsett Optimal cellen Seeding tetthet for migrasjon analysen
- Stop skanning etter 24 timer, gjelder samløpet behandling analyseverktøyet til HD-fase kontrast bildene automatisk samlet og generere en celle spredning kurve mot tiden.
- Bestemme 3-6 representant bilder og plassere dem i en ny Bildesamlingen.
- Finne en riktig maske som Behandler definisjon.
- Starte en analyse jobb.
- Avgjør optimert celle tetthet ifølge samløpet mot tiden (ca 100% samløpet innen 6-18 h avhengig av når overføringen analysen starter).
Merk: Tiden det tar for å vokse cellene til samløpet varierer avhengig av seeding fortynning.
5. dager 1 og 2: forberedelse for migrasjon og invasjonen analyser
-
På dag 1, pels platen for invasjonen analysen.
Merk: ECM gel bør alltid håndteres på is og tips som er plassert i kjøleskapet over natten.- Fortynne ECM gel med iskald kultur medier til 100 µg/mL og legge til 50 µL av utvannet ECM gel/media i utpekte brønner.
- Sted platen på standard inkubasjon forhold over natten.
- På dag 2, forsiktig Sug opp overflødig media. Plate celler med optimalisert celle tettheter 2 96-brønns plater angitt for overføringen analysen (ubestrøket) og invasjonen analysen (belagt) i triplicates følgende seksjoner 1-3 sent på ettermiddagen (i den gjeldende protokollen, optimalisert seeding tettheter for ZR75-1 og MDA-MB-231 var 90.000/godt og 50000/Vel, henholdsvis).
- Plasser plater på standard inkubasjon forhold over natten.
6. dag 3: Såret bunnen
- Spray og tørk avlysning og 2 vask båter med 70% etanol før du plasserer dem i fravær av smittefarlige stoffer skap. Fyll vask båten 1 og 2 med akkurat 45 mL steril (autoklaveres) destillert vann og 70% etanol henholdsvis.
- For sterilisering, plassere avlysning pin-blokken (øverst) på vask båten 1 og 2 til 5 minutter hver.
-
Start med migrasjon analysen platen.
- Flytte platen inneholder celler fra inkubator, og kontroller at ingen bra er tørr å hindre skade på scratch verktøyet. Fjern plate dekselet inn bunnplate innehaver av verktøyet scratch og forsiktig plassere den øverste delen på base delen av guiding plugger. Trykk og hold svart spaken, og i mellomtiden nøye løft pin-blokken. Hull i hver brønn er vanligvis synlige med det blotte øye og under mikroskopet.
- Raskt suge pinnene i vann. Dette er tilstrekkelig til å rengjøre bunnen verktøyet før skrape invasjonen analysen platen hvis platen er identiske. Ellers gjenta de sterilisering med sterilt destillert vann og deretter 70% etanol i 5 min.
- Vask plate 1 eller 2 ganger med forvarmes kultur medier å unngå frittliggende celler eller cellen ark reverteres til brønnen.
- Legg 100 µL av fersk varm media i utpekte brønner med eller uten behandlinger.
-
Flere trinn for invasjonen analysen.
- Plass invasjonen analysen platen på 4 ° C i 5 min equilibrate og nøye Sug opp kaldt media.
- Fortynne ECM gel med iskald kultur medier til 5 mg/mL, legge til 50 µL av utvannet ECM gel i utpekte brønner og plass under standard inkubasjon i 30 min.
- Legg 100 µL av varmet opp media med eller uten testing forbindelser.
- Plasser platen i live-celle imager og la den equilibrate for 5 min. Velg Beholdertype som imagelock plate. Angi Scan Type som Scratch sår, velge redigere Skanne mønster i henhold til eksperimentelle plate oppsettet (1 bilde/godt og bred modus) og planlegge 24t gjenta skanning hver 1-2 h 72 h til sårene blir helbredet.
- For å rengjøre bunnen verktøyet, sette topp pin-blokken i hver av følgende løsninger (45 mL i vaske båter) for 5 min: 0,5% vaskemiddel 1 (se Tabell for materiale), 1% vaskemiddel 2 (se Tabell for materiale), sterile destillert vann og 70% etanol. Plass verktøyet scratch tilbake på sin base plate og lagre i et støvfritt miljø.
7. dataanalyse
- Opphøre skanning utpekte platen etter alle sår har helbredet ved å velge eksperimentelle plate Skuff oppsett og Fjerne fartøy.
- Samle 3-6 representant bilder som dekker en rekke lyd prosenter, inkludert bilder rett etter at såret har blitt gjort, sår nedleggelsen av 10% og 50%.
- Bruke Segmentering justering, Opprydding og filtre for å finne en riktig behandling definisjon, bruke aktuelle Scratch sår maske og Samløpet maske. Bruk Forhåndsvisning gjeldende/alle vise at maskene.
- Starte analyse jobben.
- Data kan være analysert i programvaren eller eksporteres for videre analyse. Tre beregninger av programvaren kan brukes til å evaluere HD-fase bildene: sår bredde (µm), sår samløpet (%) og relativ såret tetthet (%). Sammenligninger vil bli diskutert i følgende avsnitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne overføringen/invasjonen analysen er basert på sår helbredelse analysen, som evalueres frekvensen av cellene flytte inn i en celle fritt område opprettet av verktøyet 96-pinners scratch. Forskjellen mellom de migrasjon og invasjonen analyser er at overføring søk mål cellene flytte på vev-kultur behandlet plast overflaten og invasjonen tiltak cellene flytte over ECM gel.
Scratch verktøyet er utformet for å gjøre konsekvent scratch sår i utpekte platen og live-celle imager er utformet ta sanntid oppløsning med scratch sår i midten. De to bryst kreftcelle linjer som brukes i gjeldende protokollen er ZR75-1 og MDA-MB-231, kategorisert som luminal B og trippel negativ subtyper henholdsvis9. Scratch sår generert av verktøyet 96-pinners scratch er vanligvis mellom 700-900 µm men kan variere mellom forskjellige linjer (figur 2).
For migrasjon analysen, tre beregninger tilbys: (1) såret bredde (µm) er den gjennomsnittlige avstanden mellom cellen ark ved såret (Figur 3). (2) såret samløpet (%) er der i såret området (Figur 3). Ideelle første såret samløpet bør være nær 0%. (3) relative såret tetthet (%) er en bakgrunn-trukket algoritmen [% relativ sår tetthet = 100 * (w(t) - w(0)) / (c(t) - w(0)), t = ved tiden t, m = tettheten av såret regionen c = tettheten av cellen regionen], måle tettheten av regionen såret i forhold til tettheten av regionen cellen.
Tre kvalifiserte beregninger kan oppnås basert på behov. Den relative såret tetthet og såret samløpet innebærer hastigheten på celler med scratch såret området, og de overlapper nesten i begge linjer. Men de to cellelinjer viste svært forskjellige sårheling evner, der ferdig (ca 50 h) såret helbredelsesprosessen MDA-MB-231 celler, ZR75-1 cellene hadde ca 50% sår dekning (de to tallene ovenfor) og over 400 µm gjenværende sår bredde, angir en lavere migrasjon evne ZR75-1 cellene (Figur 4).
Migrere atferd de to celletyper var forskjellige og kan sammenlignes med basert på innspilte bilder. Lamellipodia (blebbing protrusions) ble observert i MDA-MB-231 celler migrasjon foran i begynnelsen av overføringen, som var et vanlig tegn på cytoskjelett omorganisering, regi celle bevegelse mot de celle-fri region10 (figur 5 ). ZR75-1 celler viste ingen tegn til celle migrasjon på samme tid-punktet (figur 5).
Metrisk Relative sår tetthet anbefales produsenten celle invasjon, som det er en 3D analysen, og samløpet-baserte analyser gjelder ikke. Innen 50 h var relative såret tettheten av MDA-MB-231 celler mettet (100%), mens den relative sår tettheten av ZR75-1 celler ikke endre over tid svært invasiv fenotypen MDA-MB-231 celler og ikke-invasiveness av ZR75-1 celler ( Figur 6).
MDA-MB-231 cellene også opptrådt annerledes mens invadere gjennom ECM gel (figur 7). I forhold til celler med bleb overføring foran, viste invadere celler en langstrakt morfologi med ledende utstikkende deler.
Figur 1 : Arbeidsflyt migrasjon og invasjonen analysen i gjeldende protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Ytelsen til verktøyet scratch på brystet kreftcelle linjer ZR75-1 og MDA-MB-231 (øvre panel) med målte første såret bredden og første såret samløpet (nedre panel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Migrasjon analysen illustrert av HD fase kontrast bilder og blandet modus med masker i MDA-MB-231. Blå, grunnen sår; gule, cellene rundt scratch sår; rosa, celler som flyttet til scratch sår på 24 h etter bunnen. Skalere barer = 300 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Sammenligning av tre algoritmer (såret bredde, relativ såret tetthet og såret der brystet kreftcelle linjer ZR75-1 (venstre) og MDA-MB-231 (høyre). Alle eksperimenter representerer gjennomsnittet tre uavhengige eksperimenter, ± SD skala barer = 300 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Migrasjon foran ZR75-1 og MDA-MB-231 celler 4T etter bunnen. Piler, lamellipodia overføring foran. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Kvantifisering av invasjonen bruker metriske relativ sår tetthet (%) av bryst kreft cellen linje ZR75-1 (venstre) og MDA-MB-231 (høyre). Alle eksperimenter representerer gjennomsnittet tre uavhengige eksperimenter, ± SD Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Forskjellige mobilnettet kjennetegner MDA-MB-231 celler migrasjon (venstre) og invasjon (høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 : Et eksempel på en ripe sår som ikke kan analyseres av modulen integrert overføring fra en 96-brønns plate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Migrasjon og invasjonen er viktige parametere å vurdere mobilitet av kreftceller. Ved hjelp av verktøyet 96-pinners scratch, er det mulig å gjennomføre sårheling analyser i 2D og 3D samtidig. Bortsett fra tilrettelegge automatisk skanning, gir et stabilt celle kultur miljø med minimal avbrytelse, scratch analysen utført med 96-pinners scratch verktøyet gir konsekvent scratch sår, aktivere eksperimenter som er mer robuste og reproduserbare. 96-brønns plate formatet gir flere alternativer for å enten øke antall linjer eller ulike behandlinger. I tillegg kan cellen morfologi endringer og dynamisk bevegelse registreres for videre analyse.
Overføring/invasjonen analysen er designet for å være lett aktuelt med noen forutsetninger. En confluent celle monolayer er kritisk før såret for å sikre en rettet celle bevegelse mot gapet. Det er derfor sterkt anbefalt å optimalisere celle seeding tetthet, og et tidsrom mellom 6-18 h er vanligvis ideelle. Muligheten for eksperimentell cellene feste til overflaten og spredning rate påvirker dette tidsrommet. Langvarig inkubasjon tid kan føre til sterk celle-celle adhesjon og generere skjeve bilaterale celle fronter på grunn av fjerning av cellen ark. En biomatrix belegg vil være nyttig med mindre selvklebende cellelinjer, å redusere ventetiden. Cellene kan starved før såret. Sult timing ligner scratch timing, som er når samløpet når nesten 100%, sult media og varighet er celle type avhengige. Cellene kan også være transfected, men seeding tetthet har bestemmes i lengre tid før såret, vurderer inkubasjon tid av hva prosessen. Såret kan oppnås innen noen få sekunder ved hjelp av verktøyet 96-pinners scratch. Definert størrelse pins garanterer en presis overføring/invasjonen startstreken og avstand. Viktigere, må øvre og nedre delene være godt justert å fullføre en full ripe over brønnene, slik at live-celle bildene ikke inkluderer enten terminalen på scratch sår. Scratch sår kan lett observeres gjennom blotte øyne på den confluent cellen monolayer og raskt kan kontrolleres under lysende felt mikroskop. Vask av brønnene skal utføres umiddelbart og forsiktig å unngå reattachment av forskyves celler og fjerning av bilaterale celler. Hvis en vask er tilstrekkelig til å rydde opp til ønsket celle-fri sone, er det ikke behov for en ekstra vask.
Migrasjon analyser kan fullføres ved å legge til kultur medier med eller uten behandlinger og er klar til å skanne, mens noen flere trinn er nødvendig for å tas i betraktning for en invasjon analysen. I motsetning til celle migrasjon trenge invadere celler gjennom ECM, som gjenspeiler nærmere i vivo celle bevegelse bedre. Rektor ved gjeldende protokollen er å generere et ECM-omgitt miljø ved hjelp av ECM gel. Celler er seeded ECM gel-belagt brønner og etter såret, ECM gel er lagvis på cellene og scratch såret. Ved håndtering av ECM gel, er det bedre å holde alt kaldt å unngå gelation. Ujevnt distribuert ECM gel kan forårsake problemer når du fokuserer mikroskopet. På grunn av flytende natur ECM gel, er det mulig å generere bobler, men bobler kan enkelt fjernes ved aspirating 70% etanol gjennom en sprayflaske. Vil generere fine men ikke overdreven spray, bare skru av korken sprayflaske og sjøsprøyt av overflødig 70% etanol i halmen peker andre steder. Ved sprøyting på avstand over og vannrett til platen, er fine 70% etanol spray tilstrekkelig til å eliminere bobler.
Det første søket begynne så snart som mulig etter såret, å fange det første celle-fri sår området, og dette er viktig for å etablere kriteriene for analysen. Skanning intervallene avhenger av hvilken celle som mer invasiv cellelinjer har en rask såret nedleggelse.
Overføring/invasjonen programmet er relativt enkelt, og ved å bruke innebygde analysen modul, celle bevegelse kan fremstilles grafisk kinetically med 3 beregninger: såret bredden, såret samløpet og relativ såret tetthet (Figur 3). Alle tre kan brukes til å vurdere migrasjon. Såret bredde beskriver den gjennomsnittlige avstanden i µm når bilaterale celle arkene flytter relativt parallell, og er uavhengig av den opprinnelige sår grensen. Såret samløpet og relativ såret tetthet, tvert imot, krever innledende såret grensen i beregningen, og Beskriv samløpet såret området og celle tettheten i forhold til unwounded området, henholdsvis. Relativ såret tetthet anbefales for invasjonen analysen, siden den beregner såret området i referanse til bilaterale celle arkene. Lesere kan velge som best representerer deres behov.
Denne scratch såret overføring/invasjonen analysen kan være praktisk, men det krever verktøyet 96-pinners scratch, utpekte tallerkener og live-celle imager med integrert overføring/invasjonen modulen å gjenskape typiske resultatene presentert i denne protokollen, og Dette kan være dyrt. Kostnadseffektiv erstatninger som en flat bunn 96-brønnen multiwell plate kan brukes og kan generere anstendig scratch sår (data ikke vist). Men var ytelsen til verktøyet scratch ikke så godt som når den angitte platen ble brukt, og noen sår kan ikke hentes av skannemodus (Figur 8), dermed ikke riktig definere første såret området. I tillegg kan ripe verktøyet brukes til å opprette scratch sår, analyse enten manuelt ved bilde prosessering programmer eller bruke andre end-point visualisering og analyse verktøy. De gir mer fleksibilitet for å finne de første sår, og derfor er ikke begrenset til utpekte platene. På den annen side, er overføring/invasjonen analysen kombinert med live-celle bildebehandling i gjeldende protokollen mindre tidkrevende og mindre utsatt for feil. Dette kan være spesielt nyttig for eksperimentell konsistens og økt effektivitet.
Avslutningsvis er denne overføring/invasjonen analysen rask, enkel og robust. Brukere kan velge fra våre protokollen og andre basert på deres behov og budsjett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi ønsker å erkjenne vår finansiering støtte av Bloomfield Group Foundation gjennom Hunter Medical Research Institute (HMRI 13-02). X.Z støttes av en APA stipend gjennom University of Newcastle og HCRA Biomarkers flaggskip PhD stipend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
References
- Graham, C. H., Lala, P. K. Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control. Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).
- Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10, 683-690 (2014).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).
- Breast Cancer: Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012. GLOBOCAN. , Available from: http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx (2012).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A.
- Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y.
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast Cancer Research. 13, 215 (2011).
- Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
