Summary
Aquí, presentamos un protocolo para el cultivo de la microbiota intestinal de la Colón in vitro, utilizando una serie de biorreactores que simulan las condiciones fisiológicas del tracto gastro intestinal.
Abstract
La microbiota del intestino humano juega un papel vital en la salud humana y enfermedad. Estudio de la microbiota intestinal usando un modelo en vivo , es difícil debido a su compleja naturaleza y su diversa asociación con componentes de mamíferos. El objetivo de este protocolo es la microbiota intestinal in vitro, que permite el estudio de la dinámica de la microbiota del intestino, sin tener que considerar la contribución del medio mamífero de la cultura. Usando en vitro tecnología de cultivo, se simulan las condiciones fisiológicas del tracto gastro intestinal, incluyendo parámetros tales como pH, temperatura, anaerobiosis y tiempo de tránsito. La superficie intestinal del colon se simula agregando portadores recubiertos de mucina, creando una fase mucosa y agregar otra dimensión. La microbiota intestinal se introduce al inocular con el material fecal humano. A la inoculación con esta mezcla compleja de bacterias, microbios específicos se enriquecen en las diferentes longitudinal (ascendentes, dos puntos transversales y descendentes) y transversal (luminal y mucosa) del modelo in vitro. Es crucial para permitir que el sistema alcance un estado estacionario, en el que la comunidad y los metabolitos producidos permanecen estables. Los resultados experimentales en este manuscrito demuestran cómo la comunidad de microbiota intestinal inoculados se desarrolla en una comunidad estable en el tiempo. Una vez que se alcanza el estado estacionario, el sistema puede utilizarse para analizar las interacciones bacterianas y las funciones de la comunidad o para probar los efectos de los aditivos en la microbiota intestinal, tales como alimentos, componentes de alimentos o productos farmacéuticos.
Introduction
La microbiota intestinal es una comunidad de microorganismos que residen en el tracto gastrointestinal humano (GIT). Esta comunidad alcanza la máxima concentración en el colon, que se estima para sostener 1013-1014 bacterias, de 500-1.000 especies, que viven en simbiosis con el entorno de colon1,2. La composición y funciones de la microbiota intestinal variar espacialmente a lo largo del GIT, formando comunidades específicas de la región, con la mayoría diversidad distal2,3,4,5. Para cada región anatómica, separado de las comunidades microbianas residen en el lumen y en la guarnición mucosa de6. La comunidad de lumen tiene acceso más directo a los nutrientes como sustratos atravesar el compartimiento luminal7. A pesar de esto, algunas bacterias residen preferentemente en la capa de moco, utilizando la mucina producida por las células del colon como una fuente de energía1,5,8. La diferencia en microambientes entre las fases luminales y de la mucosas resulta en divergencia y el desarrollo de comunidades específicas de fase. En conjunto, estas comunidades proporcionan funciones metabólicas, como el metabolismo de nutrientes y la producción de vitaminas y las funciones inmunológicas, como prevención de la colonización de patógenos humanos1,3, 9. la microbiota intestinal también trabaja funcionalmente en conjugación con el colon humano las células3.
Como parte importante de la GIT humana, no es sorprendente que la microbiota intestinal se conoce para contribuir a ambos host salud y enfermedad estado3,9,10,11,12. Un cambio en la población microbiana del intestino se ha asociado con varias enfermedades humanas, incluyendo trastornos del GIT como enfermedad intestinal intestinal (EII) y el síndrome intestinal del intestino (IBS), sino también otras enfermedades como la obesidad, enfermedades circulatorias y autismo 3 , 9 , 10 , 11 , 12. metabolitos producidos a partir de la microbiota intestinal tienen un efecto global, llegando a lugares lejos de la tripa12,13. Por ejemplo, el eje cerebro intestinal se asocia con trastornos mentales como ansiedad y depresión14. Por lo tanto, estudiar la microbiota intestinal es importante para múltiples campos de investigación y es aplicable a muchas enfermedades, incluso los no asociados con el GIT.
Si bien es ampliamente reconocido que el estudio de la microbiota intestinal es importante, es una tarea complicada. Múltiples modelos animales están disponibles, de pequeños animales como el pez cebra, las ratas y ratones, a los más grandes como monos y cerdos15-19. Sin embargo, la aplicación de estos animales en cuanto a la microbiota del intestino humano no es sencilla, ya que estos animales tienen una única comunidad bacteriana que ha evolucionado basada en dieta y medio ambiente, y son anatómicamente distintas de los seres humanos20 , 21. el uso de sujetos humanos elimina la cuestión de la relevancia, pero presenta otro conjunto de desafíos. Estudios en humanos son costosos, lentos y son éticamente obligado11. Por otra parte, factores de confusión influyen en la microbiota intestinal en estudios en humanos, incluyendo edad o etapa de desarrollo, medio ambiente, dieta, medicamentos y factores genéticos2,4,22. También hay restricciones en lo que puede ser probado en seres humanos, y que tipo de muestras puede ser cosechado en lo tiempos4.
Una desventaja crítica del uso de un sistema en vivo para el estudio de la microbiota intestinal es la presencia de mamíferos. La microbiota intestinal y las células humanas interactúan uno con el otro, y en una en vivo , es imposible distinguir los dos. Los metabolitos producidos por la microbiota intestinal se toman en por las células del colon, por lo que las mediciones no pueden calcularse con precisión. Por lo tanto, cualquier estudio mecanístico debe limitarse a punto final medidas11. Otra desventaja importante para estudios in vivo es la incapacidad para recoger muestras de las distintas regiones de la GIT longitudinalmente23. Esto no permite la evaluación de los cambios que pueden ocurrir en los microambientes del colon en tiempo12. Muchos en vivo los estudios, incluyendo estudios en seres humanos, se basan en el análisis de muestras de heces para detectar cambios en la microbiota intestinal del12. Mientras que esto es informativo, no proporciona datos sobre la microbiota intestinal a través del GIT y no distingue entre las comunidades luminal y de la mucosa5,6,7,8.
De la microbiota intestinal, es necesaria la aplicación de un método en vitro para estudiar la dinámica de la comunidad bacteriana, sin la interferencia de los componentes de mamíferos. Utilizando un método en vitro permite el estricto control de condiciones ambientales10pruebas de múltiples parámetros simultáneamente y la capacidad de la muestra longitudinal y, en grandes volúmenes11. Desde un método in vitro utiliza un dispositivo mecánico y no un host, consideraciones no son necesarios para la edad, medio ambiente, dieta y genética. Estos sistemas pueden utilizarse para probar ya sea la comunidad de microbiota intestinal entera, selecciona solamente los organismos, o incluso solos cepas. Lo importante, los resultados in vitro son reproducibles, pero mantener un nivel de diversidad comparable a estudios in vivo11,22.
Dependiendo de la hipótesis en cuestión y los resultados deseados, in vitro estudios pueden realizarse de muchas maneras. Pueden utilizar sistemas del solo-recipiente y métodos simples, como incubar las muestras con homogeneizado fecal24 o realizar culturas único lote en el transcurso de 24-48 h25. También puede lograr usando sistemas del solo-recipiente y métodos más complejos, como el uso de un sistema de chemostat para producir una comunidad microbiana intestinal estable del11. Sin embargo, el uso de un solo reactor puede simplificar la microbiota12 ya que sólo representa una sección del colon, a pesar de que el colon se compone de las regiones ascendentes, transversales y descendentes.
Para estudiar la comunidad de microbiota intestinal que se desarrolla en las diferentes regiones del colon (ascendentes, transversales y descendentes regiones), se puede emplear un sistema complejo, de múltiples etapas. En estos sistemas, se instalan varios buques para imitar las diferentes regiones del colon, por lo que la microbiota intestinal de las regiones ascendentes, transversales y descendentes se cultivan independientemente. Estos vasos están conectados, usando bombas para mover sustratos en secuencia, desde la ascensión a la transversal a las regiones de colon descendente, imitando el flujo de nutrientes a través del GIT.
El objetivo de este estudio era demostrar cómo un sistema de cultivo in vitro de 5 etapas (véase Tabla de materiales) se puede utilizar para el cultivo de la comunidad de microbiota intestinal y para demostrar la dinámica de la comunidad en términos de estabilidad y composición. En este sistema, un recipiente representa el estómago y uno representan el intestino. El colon se divide en tres regiones (ascendente, transverso, descendente), con un vaso que representa cada región26. En esta configuración experimental, dos sistemas completos se ejecutan en paralelo, con la unidad 1 que contiene portadores de mucina que representa la superficie de la mucosa y la unidad 2 que contiene no portadores de mucina. Las comunidades que se desarrolló en las fases luminales y de la mucosas de cada región se compararon entre sí y del inóculo fecal con el tiempo mediante el SCFA análisis y secuenciación de 16S rRNA gene. Los resultados presentados demuestran el tipo de comunidad, tanto en términos de composición y funcionalidad, que puede ser producido a partir de este tipo de sistema in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. materiales y preparativos
Nota: El medio definido se adquiere en forma de polvo (véase Tabla de materiales). La composición del medio definida en g/L es el siguiente: Arabinogalactan (1.2), pectina (2.0), xilano (0,5), glucosa (0.4), extracto de levadura (3.0), peptona especial (1.0), mucina (2.0), L-cisteína-HCl (0,2).
-
Preparar el medio definido
- Llene un frasco de 4 L con 2 L de agua destilada, desionizada doble.
- Añadir 29,2 g de polvo medio definido para el agua y mezcla completa unidad homogeneizada.
- Añadir un agitador magnético y atornillar la tapa.
- Autoclave a 121 ° C durante 30 minutos.
- Después de enfriar, almacenar el medio definido preparado en un refrigerador a 4 ° C con agitación constante (agitador magnético).
-
Preparar jugo pancreático
- Autoclave 2L de agua destilada, desionizada en un recipiente de 5L con una barra agitadora agregó, a 121 ° C durante 30 minutos.
- Después de la esterilización en autoclave, permitir que el agua se enfríe a temperatura ambiente.
- Añadir 12.5 g NaHCO3, 6 g bilis y pancreatina 0,9 g. Colocar en el agitador magnético para mezclar.
Nota: El jugo pancreático debe ser preparado fresco cada 2-3 días y refrigerado con agitación después de lo hecho.
-
Tampón fosfato
- Colocar un frasco de 1 L que contenga una barra agitadora magnética en un agitador magnético. Añadir 0,5 L de agua destilada, desionizada y active la agitación.
- A continuación, agregar 6,8 g KH2PO4y 8,8 g de K2HPO40,1 g sodio tioglicolato. Rematar con agua hasta un volumen final de 1 L.
- Después de que los componentes se han disuelto completamente, ajustar el pH a 7.0 con NaOH.
- Vierta el búfer en un recipiente de 2 L con tapón de rosca tapa y autoclave a 121 ° C durante 30 minutos, asegúrese de que la tapa esté bien libremente y no cerrada.
- Después de retirar del autoclave, deje que la solución se enfríe a la temperatura ambiente. Almacenar el buffer a temperatura ambiente hasta por 2 semanas.
-
Elaborar portadores de agar de mucina
- Autoclave mucina plástico (véase Tabla de materiales), pinzas, malla de plástico (forma tubular) y los lazos zip a 131 ° C durante 30 minutos.
- Autoclave de 300 mL de doble agua destilada, desionizada agua a 131 ° C durante 30 minutos tienda a temperatura ambiente hasta su uso.
- En un gabinete con la cabina de flujo laminar bioseguridad, llenan de placas de Petri estériles los portadores de mucina plástico utilizando pinzas estériles.
Nota: Los portadores de mucina son círculos de plástico huecos que se llenan con agar de mucina. Una vez llenado, la tapa se puede colocar en la parte superior y estas pueden apartar. - Para preparar agar de mucina, añadir 3 g de agar bacteriana y 15 g de mucina porcina a los 300 mL de agua esterilizada.
- En una campana de humos, hervir esta solución, luego retire de la fuente de calor y deje enfriar durante 1 minuto Repita el punto de ebullición y enfriamiento para un total de 3 veces.
- Una vez que el recipiente de vidrio que contiene la solución de agar de mucina está suficientemente frío al tacto, trasladan la bioseguridad con flujo laminar.
- En la seguridad de la biotecnología con la cabina de flujo laminar, verter el agar de mucina líquida sobre los portadores de mucina plástico que se colocaron en la caja Petri. Asegúrese de que todos los portadores están llenos completamente de agar de mucina.
- Coloque la tapa en la caja Petri y deje que se enfríe bajo flujo laminar.
- Para montar los portadores de la mucina, tomar la malla de plástico esterilizada e inserte portadores de mucina que contienen el agar solidificado de la mucina de la placa de Petri utilizando pinzas estériles.
- Utilizar abrazaderas de plástico para cerrar los extremos de la malla. De esta manera las funciones de red para contener los portadores de la mucina lleno de agar de mucina. Almacenar a 4 ° C hasta su uso.
2. configurar, inoculación y el funcionamiento del sistema
- Puesta en marcha de sistema de cultivo
Nota: el simulador Twin del ecosistema microbiano Intestinal humano fue utilizado para este estudio.- Coloque 10 Biorreactores que contienen barras de agitador de agitadores magnéticos y gire en agitación.
Nota: Cada unidad consistirá en biorreactores de 5, así que 2 unidades requerirán 10 Biorreactores. - Conectar 5 Biorreactores entre sí usando tubos de silicio en secuencia a través de la bomba peristáltica (figura 1). Utilice las bombas transversal el contenido líquido de un biorreactor para la próxima.
- Los Biorreactores en la secuencia siguiente de la etiqueta: estómago, intestino delgado, colon ascendente, colon transverso, descendente colon para representar a la orden del tracto gastrointestinal.
Nota: Los Biorreactores pueden todos ser idénticos, o biorreactores de estómago y el intestino pueden ser más pequeño comparados los Biorreactores de colon ya que tienen menos volumen. Configuración de los Biorreactores de esta manera significa que la región de colon ascendente recibe nutrientes desde el intestino delgado, el colon transverso región recibe nutrientes de la región de colon ascendente y la región de colon descendente recibe nutrientes de la región transversal. De esta manera, el sistema es mímico el movimiento secuencial de nutrientes a través del tracto gastrointestinal. - Coloque el medio definido y jugo pancreático en un refrigerador a 4 ° C con agitación constante con agitadores magnéticos. Usando el tubo de silicona, conectar el medio definido para el biorreactor del estómago mediante una bomba peristáltica y conectar el jugo pancreático al intestino mediante una bomba peristáltica.
- Añadir a agente de la solidificación a una bolsa de drenaje de orina. Conecte los dos puntos descendentes a la bolsa de drenaje de orina a través de la bomba peristáltica. Deseche la solidificada como residuos biológicos durante el experimento.
- Usando el tubo de silicona, conectar la camisa de agua de cada recipiente en orden y Conecte cada extremo en el baño circulante de agua. Llene la bañera de agua circulante con agua destilada (esta cantidad varía dependiendo del tipo de baño utilizado en circulación) y a 37 ° C.
- Usando tubos de silicio, conecte el ácido y la base a la tapa de cada vaso por medio de bombas peristálticas. Las concentraciones recomendadas son de 0.5 M de HCl y 0.5 M NaOH.
- Inserte las sondas de pH para cada vaso a través del puerto designado en la tapa. Este puerto está diseñado para sostener la sonda de pH y el tornillo en la tapa (figura 1). Ajuste el pH de cada región como sigue: estómago, pH = 2; Intestino delgado, pH = 6.7-6.9; Colon ascendente, pH = 5.6-5.9; Colon transverso, pH = 6.15-6.4; Colon descendente, pH = 6,6 6,9.
Nota: Durante la fase inicial, la comunidad se distingue en base a la diferencia en valores de pH de la región. Sin embargo, una vez que comienzan los ciclos de alimentación, las comunidades más maduro basado en las diferencias en el aporte de nutrientes. - Conecte una línea de nitrógeno usando el tubo de silicona para la tapa de cada vaso utilizando el puerto designado. La línea de nitrógeno debe fluir en la siguiente secuencia: estómago, intestino delgado, colon ascendente, colon transverso, descendente colon. Asegúrese de que cada unidad tiene su propio color para evitar la contaminación cruzada.
Nota: El nitrógeno se usa para quitar oxígeno desde el sistema y mantiene la anaerobiosis durante el experimento. - Inserte un tubo de metal de la muestra a través de la tapa de cada biorreactor utilizando el puerto designado. El tubo metálico se extiende hacia abajo en el biorreactor y se utiliza para recoger las muestras de líquido.
- Añadir un pequeño trozo de tubo de silicona en el extremo superior del tubo de muestra y una cerradura de Luer para permitir el uso de una jeringa durante el muestreo.
- Coloque 10 Biorreactores que contienen barras de agitador de agitadores magnéticos y gire en agitación.
- Inoculación del sistema
- Llenar las regiones de Colón con el medio definido con los siguientes volúmenes: 500 mL en el colon ascendente, 800 mL en el colon transverso y 600 mL en el colon descendente.
- Añadir portadores de mucina agar a las regiones de Colón, en una cantidad proporcional al volumen del reactor. Para este experimento, se utilizaron 60 portadores por reactor.
- Quite cualquier exceso medio definido con una jeringa y el tubo de muestra ya que agregar los portadores eleva el nivel de líquido en el biorreactor.
- Encienda las sondas de pH para ajustar el pH en cada reactor, utilizando el ordenador.
- Activar la descarga de nitrógeno durante 20 minutos.
Nota: El homogeneizado fecal utilizado para la inoculación se compra como 10% heces homogeneizadas en solución de glicerol 10% (véase Tabla de materiales). La muestra fecal se selecciona al azar de un grupo de donantes con los siguientes criterios: un americano consume una dieta occidental típica (no vegan o vegetariano), entre 21-45 años de edad, antibióticos gratis durante al menos 1 año, con un índice de masa corporal promedio (18.5-24.9) . Para este protocolo, se utiliza sólo un único donante. Sin embargo, esto puede modificarse debido a diseño experimental. - Antes de la inoculación, descongelar el homogeneizado fecal siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Inocular cada reactor de colon mediante la adición del fecal homogeneizado en una cantidad igual al 5% del volumen del reactor a través del puerto de la muestra, utilizando una jeringa de 60 mL (25 mL en el colon ascendente, 40 mL para el colon transverso, 30 mL para el colon descendente).
- Crecer los cultivos en biorreactores durante la noche con control de pH.
- Después del crecimiento durante la noche, recoger muestras del líquido luminal de cada región del colon como se detalla a continuación en la sección 3. Después de finalizado el muestreo, encienda el programa de computadora para comenzar la alimentación.
- Ciclos de alimentación diaria
Nota: los ciclos de alimentación diarios son equipo automatizado.- Tres veces al día, 140 mL del medio de definida la bomba en el biorreactor del estómago y permite para incubar durante 1 h.
- Después de 1 h de incubación, la bomba el contenido del estómago al intestino. Al mismo tiempo, la bomba 60 mL de jugo pancreático al intestino.
- En el intestino, gire el ajuste del pH a pH 6.7-6.9 y permitir que la mezcla de incubar por 90 minutos. Durante la incubación, activar la descarga de nitrógeno para cada sistema por un total de 10 minutos cada uno.
- Después de la incubación de 90 minutos, encender las bombas desde el intestino al colon ascendente, el colon ascendente, colon transverso, el colon transverso y el colon descendente, el colon descendente a la basura al mismo tiempo.
- Línea de tiempo experimental
Nota: la sistema in vitro que se utiliza aquí es operado de manera continua por aproximadamente 8 semanas en longitud. A continuación es una línea de tiempo experimental recomendado, sin embargo, esto puede ser modificado según las exigencias y el objetivo del experimento.- Establecer sistema de pasos aparecen en el paso 2.1.
- Muestras del crecimiento durante la noche siguiendo el protocolo a continuación de la cosecha. Comienzan los ciclos diarios, alimentación tres veces al día siguiendo el protocolo anterior.
- Ejecutar el experimento para un total de 2 semanas para permitir que las bacterias se estabilice.
Nota: Funcionamiento del sistema significa que el pH se mantiene, los ciclos diarios de alimentación siguen tres veces al día, y los portadores de la mucosa se cambian 2 - 3 veces cada semana. - Después de la estabilización, ejecutar el experimento durante dos semanas el período de control.
- Después del período de control, utilice el sistema para probar diferentes componentes o variables, conocidas como el período de tratamiento.
- Después del período de tratamiento, dejar de añadir los componentes o variables y volver a las condiciones normales. Esto se considera el periodo de lavado y se utiliza para determinar si o no los cambios en la comunidad son permanentes.
3. recolección de muestras del sistema de
Nota: Durante el experimento, las muestras pueden recolectarse de la fase luminal o mucosa de cualquier región en cualquier momento, siguiendo el debajo de las directrices.
-
Recolección de muestras de luminales
- Las muestras de líquido luminales a través del puerto de muestra que se extiende hasta la mitad del líquido de cultivo de la cosecha. Comenzar por limpiar el Luer-Lock en el puerto de la muestra con etanol al 70% o el cojín del alcohol pequeño y deje que se seque.
- Asegurar que se elimine todo el aire de una jeringa de 30 mL y conéctelo al puerto de la muestra. Dibujar hacia arriba y hacia abajo 3 - 5 veces para asegurar una mezcla adecuada de los componentes de la embarcación. Después, dibuja un total de 30 mL de la cultura.
- Alícuota de las muestras luminales como necesitan en tubos falcon estériles y tienda en el hielo. Después de muestreo se completa transferencia de éstos a un congelador de-80 ° C.
- Para el análisis SCFA, 15 mL de la muestra luminal rota a 4 ° C, 5.000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante es filtrada mediante un filtro de 0.2 μM de PES de la jeringa. Guarde el sobrenadante filtrado a-80 ° C.
- Para el análisis de la DNA, spin 1 mL de fluido luminal a 4 ° C, 5.000 x g durante 10 min., deseche el sobrenadante y almacenar el pellet a-80 ° C.
- Como una copia de seguridad, almacenar 10 mL de fluido luminal a-80 ° C para la mayoría de los experimentos.
-
Recolección de muestras de mucosa
Nota: cambiar portadores mucosa cada 2-3 días.- Retirar y llevar a cabo los portadores de mucina preparado en el refrigerador.
- Abra de la descarga de nitrógeno y la tapa del reactor rápidamente. Quitar 50% de los portadores de la mucina y añadir nuevos.
- Sellar la tapa rápidamente y mantener el nitrógeno al ras en otro 20 minutos.
- Para la extracción de ADN, alícuotas de 0,25-0,5 g de agar en un tubo de 2 mL y se almacenó a-80 ° C hasta que se necesite.
4. análisis, secuencia y extracción de ADN
Nota: Se extrajo ADN utilizando el método de extracción de ADN de CTAB con homogenización físico en una campana de humo29. Después de la extracción, se utiliza un espectrofotómetro para cuantificar la cantidad de ADN en cada muestra.
-
Preparación de buffer CTAB
- Disolver 4,2 g de K2HPO4 y 4,09 g NaCl en 200 mL de agua desionizada, destilada, entonces el autoclave a 121 ° C durante 30 minutos.
- Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente.
- Añadir 10 g de bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) y el calor a 60 ° C con agitación.
- Después de que el CTAB es disuelto, retirar la solución de calefacción y enfriamiento a temperatura ambiente.
-
Preparar la solución de PEG-6000
- Disolver 300 g de polietilenglicol 6.000 y 93,5 g NaCl en 1 L de agua desionizada, agua destilada.
- Después de todas las partículas se disuelven, autoclave la solución a 121 ° C durante 30 minutos.
- Después de la esterilización en autoclave, enfriar la solución a temperatura ambiente antes de usar.
-
Realizar la extracción de ADN
- Añadir 500 μL de buffer CTAB y 500 μL de fenol-cloroformo-Isoamyl alcohol al tubo de muestra de 2 mL y vortex para homogeneizar.
- Transferir el contenido completo del tubo de muestra en un 0,1 mm físico de homogeneización del tubo (véase Tabla de materiales).
- Homogeneizar los tubos durante 20 s en la posición más alta, dos veces, con una pausa de s 20 entre, utilizando un homogeneizador de la físico (véase Tabla de materiales).
- Centrifugar los tubos homogeneizados a 3.000 x g durante 5 minutos.
- Transferir 300 μL del sobrenadante a un tubo limpio, de 1,7 mL y agregar 500 μL de CTAB tampón al tubo original.
- Homogeneizar este tubo nuevo métodos en pasos 4.3.2-4.3.3 y centrifugar a 3.000 x g durante 5 minutos.
- Después de la centrifugación, traslado otro 300 μL del sobrenadante a tubo nuevo que ahora contiene 600 μL.
- Agregar un total de alcohol de cloroformo-isoamílico de 600 μL en el tubo que contiene 600 μL del sobrenadante.
- Invierta los tubos para mezclar y luego centrifugar brevemente. Transferir 500 μL de la fase superior a un tubo limpio de 1,7 mL. Sólo asegúrese de tomar la fase superior.
- A continuación, añadir 1000 μL de solución de Peg-6000, invertir los tubos para mezclar y luego incubar a temperatura ambiente durante 2 h.
- Después de la incubación, centrifugar los tubos a 18.200 x g, 4 º C, durante 10 minutos.
- Deseche el sobrenadante y limpiar el pellet con etanol al 70% frío hielo.
- Centrifugar los tubos otra vez a 18.200 x g, 4 º C, 10 minutos eliminar el sobrenadante y permitir que el sedimento se seque en el gabinete de bioseguridad con flujo laminar.
- Después de la pelotilla es seca, añadir 75 μL de Rnasa libre, libre de ADNasa, agua estéril a cada tubo.
- Cuantificar el ADN resuspendido por un espectrofotómetro y luego enviarlo hacia fuera para la secuenciación del 16S rRNA gene.
5. corta la cadena del ácido graso (SCFA) detección y análisis
- Descongelar las muestras congeladas a 40° C por 30 min y extracto de ácidos grasos de cadena corta con éter dietílico en una relación 2:1 (v: v).
- Transferencia de la fase orgánica a un GC/MS (véase Tabla de materiales) equipada con una columna, de 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 μm, (véase Tabla de materiales) donde se inyecta 10 μl.
- Fijar la temperatura del puerto de inyección y la temperatura de la columna inicial a 260 ° C y 125 ° C respectivamente. Mantener la temperatura inicial de 1 minuto y luego aumentar a 250 ° C, más 11,5 min con una velocidad de flujo de columna de 1 mL/min.
Nota: La temperatura MS de la fuente de iones es 220° C y 250° C para la interfaz. - Cuantificar la cantidad de cada organizó usando curvas estándar y el ácido 2-methylhexanoic como estándar interno.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El protocolo de arriba describe configuración, inoculación y funcionamiento de un sistema in vitro de 5 etapas para el estudio de la microbiota intestinal del colon. Para generar los datos presentados a continuación, después de la extracción de DNA, secuenciación de ADN 16S rRNA marcador gene de la región de V1V2 se realizó mediante el alto rendimiento de secuenciación (por ejemplo,, MiSeq Illumina plataforma) por el centro del microbioma en el Hospital de niños de Philadelphia27. QIIME (penetración cuantitativa en ecología microbiana) versión 1.928 se utilizó para procesar los datos de secuenciación y análisis estadístico se realizó en el entorno de R para computación estadística29. Las asignaciones taxonómicas fueron generadas usando el Greengenes 16 referencia base de datos30,31. Valores de abundancia relativa de OTU se calcularon dividiendo que el OTU Lee recuento por el número total de lecturas en la muestra. Niveles SCFA se cuantificaron utilizando el protocolo descrito.
El en vitro las comunidades alcanzar un equilibrio de estado estacionario
La capacidad para el estudio de la microbiota intestinal y cadena corta (SCFA) del ácido graso producción en vitro con un sistema de múltiples etapas requiere que las comunidades microbianas alcanzan un estado estacionario. Esto ocurre después de la inoculación cuando los taxa se han establecido en sus nichos, y la composición de la comunidad y sus metabolitos no son fluctuantes. En un estado estacionario, la comunidad y sus productos siguen siendo los mismos con el tiempo. Para estudios de la microbiota del intestino in vitro, la estabilidad es un requisito clave; sin estabilidad, es imposible determinar si están ocurriendo cambios observados debido a las condiciones experimentales, o si son debido a la variación. Según lo que se ha propuesto en la literatura, una comunidad puede considerarse estable cuando hay similitud de 80% entre tiempo puntos32.
Utilizando los resultados de secuenciación del gen de 16S rRNA marcador, diagramas de análisis de coordenadas principales (PCoA) basados en distancias UniFrac ponderados y no ponderados se generaron para las comunidades que desarrollan en cada región del sistema con el tiempo (figura 2). No ponderado análisis compara las comunidades en cuanto a la presencia/ausencia de especies. El análisis ponderado compara basado no sólo en la presencia/ausencia de especies pero también considera que su abundancia. Para la unidad 1, Esto incluyó las fases luminales y de la mucosas y para la unidad 2 sólo la fase luminal. Partiendo de este análisis, se observó que la comunidad cambió sensiblemente entre los días 1 y 7. Sin embargo, desde la inoculación de post día 11 hasta el final del experimento, las muestras ocupan una región pequeña del espacio de PCoA. Esto era cierto para las puntuaciones de la muestra muestra distancia basados en OTU presencia-ausencia (figura 2A) o en la abundancia de la OTU (figura 2B). Así, se observó que, después de 11 días, la abundancia y los tipos de bacterias estables desde el punto de una muestra a otra. Este patrón se observó para las fases luminales y de la mucosas de todas las regiones de tres puntos de la unidad 1 y la fase luminal de la unidad 2. Estos resultados ilustran que las fases luminales y de la mucosas alcanzan estabilidad y que esto ocurrió al mismo tiempo.
Estabilidad del sistema también fue probada mediante el análisis de la producción de ácidos grasos de cadena corta (SCFAs) con el tiempo. Los tres más prominentes SCFAs (ácido propiónico, ácido butanoico y ácido acético)38 fueron medidos en cada muestra a lo largo del experimento utilizando cromatografía de gases GC/MS. Estas mediciones revelaron que ácido acético, ácido propiónico y ácido butanoico fluctuaban desde el inicio del experimento hasta la inoculación de post del día 15 (Figura 3A-C). Después del día 15, las cantidades de estos SCFAs genera en cada región de Colón que se mantuvo constante, con mínimos cambios que ocurren hasta el final del experimento (Figura 3A-C). La diferencia entre puntos de tiempo fue un promedio de 6,8% para el ácido propiónico, 7.2% de ácido acético y 8.02% para ácido butanoico. Esto sugiere que similar a la composición de la comunidad, las propiedades metabólicas de la comunidad entraron en un estado estacionario, como se indica por la producción de cantidades estables de SCFAs con el tiempo. Unidad 1 y unidad 2 producen cantidades similares de SCFAs, sin diferencias significativas entre ambos (p > 0.05). Esto indica que la producción de SCFAs no fue afectada por la presencia o ausencia de la comunidad mucosa. Cabe señalar que el punto de estabilidad determinado en este experimento es similar al reportado previamente, en que se observó estabilización de la comunidad en un sistema in vitro de la etapa 5 se produjo aproximadamente 2 semanas post inoculación33, 34,35.
Las comunidades desarrollaron en la en vitro sistema son similares a los del inóculo
La segunda requiere elemento para un experimento de microbiota intestinal in vitro es que la comunidad se convirtió en el modelo conserva la diversidad microbiana del inóculo fecal. Puesto que el sistema utilizado en este experimento ofrece para tres regiones distintas de colon no se puede esperar que cualquier un región ser exactamente igual que el inóculo fecal. Sin embargo, se espera que los miembros de cada comunidad se derivan del inóculo fecal y todos juntos mantienen un nivel similar de la diversidad como el inóculo.
Basado en los resultados de la secuenciación del gen de 16S rRNA marcador, la comunidad estable promedio de la fase luminal y de la mucosa de cada región de colon fue determinado (días 15-28 post inoculación) y frente a la comunidad del inóculo fecal (Figura 4A). Estos resultados demuestran que las comunidades que se convirtieron en las regiones de puntos individuales del sistema in vitro fueron similares a los del inóculo fecal en composición. Las dos órdenes más prominentes en el reactor, Clostridiales y Bacteroidales, emparejado los observados en el inóculo. Sin embargo, varias órdenes bacterianas baja abundancia en las regiones de Colón eran diferentes del inóculo, con las diferencias más importantes entre orden Burkholderiales y Synergistales (Figura 4A).
La diversidad alfa para sistema in vitro se comparó con el inóculo, como otra medida de la estructura de la comunidad después de la estabilización. El índice de Shannon calculado para cada región con el tiempo, alcanzó un nivel similar de la diversidad como inóculo para todas las regiones, excepto las muestras luminales de la región ascendente (Figura 4B). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el sistema de cultivo in vitro es capaz de producir una comunidad comparable del inóculo fecal, tanto en términos de composición y diversidad (figura 4A-B).
Con un en vitro el sistema permite el desarrollo de la región y las comunidades específicas de fase
Las regiones de tres puntos en este sistema se mantienen en valores de pH diferentes y reciban diferentes fuentes de nutrientes. (Esto fue mencionado en la sección de protocolo). En base a esto, se espera que las comunidades de estas regiones distinguen 33. Las comunidades estables de luminal (días 15-28) en la unidad 1 y unidad 2 se determina a nivel de familia y trazadas según la abundancia relativa (figura 5). La divergencia entre las regiones de tres puntos en cuanto a la abundancia de los taxones específicos, demuestra que cada región desarrolla una comunidad única. Esto también es apoyada por los resultados de la figura 2 y figura 4. En la figura 2, las comunidades maduras que desarrollan en cada región se agrupan en diferentes lugares de la tabla de PCoA. En la Figura 4A, las comunidades de cada región de colon difieren en los porcentajes de los miembros del orden dominante.
Para este experimento, unidad 1 contó con portadores de la mucosa, mientras que unidad 2 no portadores de mucina. Basados en este diseño experimental, podría examinarse la contribución de la superficie de la mucosa. Para fines comparativos, las (días 15-28) luminales y de la mucosas comunidades estables para la unidad 1, a nivel de familia, se trazaron juntos según abundancia relativa (figura 6). Está claro que la composición de las comunidades luminales y de la mucosas para todos tres colones difiere en la abundancia de algunos taxa, el ser más prominente Lachnospiraceae y por Bacteroidaceae. Estos resultados también demuestran que las comunidades mucosa en las tres regiones son diferentes unos de otros. Por ejemplo, Clostridiaceae se enriquece en las comunidades mucosa de las regiones descendentes y transversales, y Veillonellaceae es mayor en la fase mucosa de colon ascendente, pero no en el transverso o descendente a las regiones del colon. Tomados en conjunto, los resultados presentados en estas figuras muestran que existe una clara diferencia entre las comunidades en cada fase y cada región para algunos taxa, que ilustran que la composición entre las regiones es similar y que hay una diferencia en abundancia.
Aunque el análisis de secuencia de la DNA revela el desarrollo de una comunidad específica de la región, no hay ninguna diferencia aparente en la producción de SCFAs entre regiones. La proporción promedio de ácido acético: propiónico: ácido butanoico para la comunidad estable (día 15-28) se calculó para cada región (Figura 7A). Mientras que los cocientes de la organizó diferentes seguía siendo bastante similares, hay un aumento en las cantidades totales de SCFAs producidos entre las regiones ascendentes, transversales y descendentes, con los niveles más altos de la región descendente (figura 7B). Esto era cierto para la unidad 1 y unidad 2.
Figura 1: ilustración del diseño experimental 5 etapas, en vitro de. El sistema completo consta de los siguientes componentes: una circulación de agua corriente de nitrógeno, un sistema de biorreactores de vidrio, baño, un conjunto de barras del agitador magnético y agitadores magnéticos, sondas de pH, una consola controlado por ordenador que contiene 40 bombas peristálticas, un monitor de la computadora y un refrigerador. El sistema principal se compone de un conjunto de biorreactores mímico el estómago, intestino delgado y las regiones de colon ascendente, transversal y descendente. Dos unidades completas se configuran para ejecutarse en paralelo, proporcionando un experimental y un grupo control. Esto significa que se requiere para este experimento 10 Biorreactores, sondas de pH 10 y 10 agitadores magnéticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: la comunidad in vitro se estabiliza por la inoculación de día 11 post. PCoA análisis basado en la distancia (A) Unweighted Unifrac ponderado (B) para la fase luminal y de la mucosa de cada región en el tiempo unidad 1 y la fase luminal de la unidad 2. La trama está Facetada en los componentes después de calcular los ejes de PCoA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: estabilizar la producción de SCFAs por el sistema in vitro por la inoculación de día 15 post. Mediciones de ácido acético, ácido propiónico y ácido butanoico en el tiempo de la ascendente (A) (B) de colon transverso y (C) descendente colon. El experimento se realizó por triplicado. Los resultados representan un promedio de tres mediciones independientes, con barras de error que representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: comparación de las comunidades estables del sistema in vitro para el inóculo fecal. (A) el establo comunidades (D15-28), en el nivel de la orden fueron promedio y formato de gráficos para la fase mucosa y luminal de cada región de colon y para el inóculo fecal. (B) del Shannon la diversidad para la fase mucosa y luminal de cada región de colon en comparación con el inóculo fecal (línea punteada negra). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: la fase luminal y de la mucosa en cada región de colon promover el crecimiento de distintas comunidades. La abundancia relativa promedio, a nivel de familia, para las comunidades estables (D15-28) para la fase luminal y de la mucosa y el inóculo, se calculó y trazan juntos para cada región de Colón. Barras de error representan la desviación estándar entre los puntos de tiempo. AC1 = ascendente colon unidad 1; TC1 = transversal colon unidad 1; DC1 = descendente colon unidad 1; AC2 = ascendente colon unidad 2; TC2 = transversal colon unidad 2; DC2 = descendente colon unidad 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: cada región de colon del sistema in vitro desarrolla una comunidad única. La abundancia relativa promedio, a nivel de familia, para las comunidades estables (D15-28) en cada región del colon y del inóculo fecal, fueron calculados y trazar juntos. El experimento se realizó por triplicado. Los resultados representan un promedio de tres mediciones independientes, con barras de error que representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: la proporción de ácido acético: propiónico: ácido butanoico es similar para cada región de colon. (A) las cantidades de ácido acético, ácido propiónico y ácido butanoico para las comunidades estables (D15-28) de cada región de colon fueron calculadas y convertidas en una relación. (B) las proporciones se trazaron como porcentajes para cada región de Colón. Barras de error representan la desviación estándar entre los puntos de tiempo. AC1 = ascendente colon unidad 1; TC1 = transversal colon unidad 1; DC1 = descendente colon unidad 1; AC2 = ascendente colon unidad 2; TC2 = transversal colon unidad 2; DC2 = descendente colon unidad 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sistemas de cultivo in vitro se han desarrollado para estudiar la microbiota de la tripa del intestino grueso. Utilizan aparatos diseñados para simular las condiciones fisiológicas del tracto gastro intestinal, promoviendo el crecimiento de una comunidad microbiana intestinal madura para cada región del colon33. Aunque el concepto es lógico y comprensible, el funcionamiento real de sistemas de cultivo in vitro para el estudio de la microbiota intestinal requiere una precisión y una comprensión de lo que es necesaria y que producen resultados fiables.
Los elementos necesarios para un experimento de microbiota intestinal in vitro son que la comunidad debe alcanzar estabilidad después de la inoculación y que debe mantener la diversidad microbiana del inóculo fecal. Si el experimento se ejecuta correctamente, estos dos elementos se consiguen fácilmente y como era de esperar. Pasos críticos en el protocolo que van a afectar la estabilidad del sistema y la diversidad son los siguientes: la preparación del medio definido y jugo pancreático debe ser precisa y entrega de estos sustratos debe ser coherente. Condiciones anaerobias se deben mantener durante el experimento. El pH de cada región intestinal debe mantenerse exactamente en el tiempo. Cambios en estos tres parámetros durante el experimento pueden resultar en fluctuaciones de la población y la producción de metabolito variable.
Utilizando este sistema in vitro de varias etapas tiene varias ventajas. En particular, simulan las diferentes regiones del colon. También puede ser diseñados para simular la digestión in vitro de los alimentos en el GIT superior, incluyendo los componentes enzimáticos de la saliva y la adición de la pancreatina y la bilis. Una fase mucosa puede ser incorporada en cada reactor de colon, añadiendo aún más complejidad8. Esto resulta en el desarrollo de la región y las comunidades microbianas específicas de fase que pueden ser individualmente analizadas y comparadas. Este tipo de sistemas puede ser fácilmente manipulado, dependiendo de diseño experimental a través de la reconfiguración física, alteraciones de los parámetros fisiológicos como pH, temperatura o tiempo de tránsito, o inoculación con fecal específico muestras26 . Lo importante, investigación ha mostrado que las comunidades desarrolladas en estos sistemas in vitro representan la tripa comunidad microbiana11,26,34.
Mientras el uso de sistemas in vitro de varias etapas se puede utilizar para el estudio mecánico de la microbiota intestinal, tienen limitaciones. En primer lugar, mientras que las condiciones fisiológicas son programables, son fijos utilizando valores medios específicos, lo que representa a la persona promedio. Esto es una simplificación ya que hay considerables interindividuales variatiability12,23. En segundo lugar, aunque la falta de componentes mamíferos es una de las razones para utilizar un sistema in vitro, también debe ser considerado una limitación. La falta de ciertos componentes de mamíferos, como el sistema inmune, puede resultar en diferencias entre el modelo in vitro y el microambiente en vivo correspondiente12,23. Sin embargo, estas limitaciones no desmerece el valor y la visión que puede obtenerse del uso de sistemas in vitro para el estudio mecánico de la microbiota intestinal. Por último, las culturas se cultivan en biorreactores de vidrio con la no absorción de agua o de metabolitos. Esta es una diferencia importante, y el efecto puede verse en la medición de los SCFAs donde están aumentando las cantidades totales de SCFAs de ascendente a transversal descendente regiones del colon (figura 7). Esto es contrario de lo que se observa en vivo, donde las mayores concentraciones de SCFAs encuentran proximalmente, en la región ascendente, y las más bajas concentraciones distal36. Sin embargo, cuando la producción neta de SCFAs se considera para cada región, entonces se puede determinar que la producción de SCFA la mayoría ocurre en el colon ascendente. También debe ser mencionado aquí que la carga bacteriana no se midió en este experimento. Diferencias en la carga bacteriana entre las regiones en este sistema pueden tener un efecto sobre las cantidades totales de SCFAs producidos.
En conclusión, es bien sabido que la microbiota intestinal juega un papel en la salud y la enfermedad, y se considera como un mediador entre dieta y salud metabólica37,38. Aquí, se discutió la aplicación de un sistema in vitro para el estudio de la microbiota intestinal, y se presentaron los resultados de un experimento que demuestra el desarrollo de una comunidad estable. Un sistema in vitro tiene muchas ventajas y promueve el desarrollo de una comunidad compleja y dinámica, que se ilustra en el experimento descrito. Este tipo de sistema se utiliza mejor para el estudio de las interacciones y los cambios dentro de la comunidad de microbiota intestinal en respuesta a factores externos, tales como componentes de alimentos y medicamentos. Los resultados de estos estudios in vitro pueden luego complementarse con estudios in vivo, para obtener una profunda comprensión de la función y contribución de la microbiota intestinal para la salud y la enfermedad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores tienen intereses financieros que compiten. Mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o aprobación por el Departamento de agricultura de Estados Unidos. USDA es un proveedor de igualdad de oportunidades y el empleador.
Acknowledgments
La Sra. Audrey Thomas-Gahring es reconocida por sus GC/MS trabajo. También nos gustaría agradecer a Massimo Marzorati por editar el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TWINSHIME | Prodigest | NA | |
| Defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch) | Prodigest | NA | |
| Masterflex tubing | cole Parmer | NA | |
| Urine Drainage bag | Bard | NA | |
| Labsorb | Sigma-Aldrich | NA | |
| Fecal sample | Openbiome | NA | |
| Syringes | Becton Dickson | NA | |
| Defined medium | Prodigest | NA | |
| Oxgall Bile | Becton Dickson | NA | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Glass ware | Ace Glass | NA | |
| Porcine mucin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | NA | |
| Sterilization pouches | VWR | NA | |
| BeadBug | Benchmark Scientific | NA | |
| Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1 mm Bead beater tube | Benchmark Scientific | NA | |
| RNAse free, DNAse free, sterile water | Roche | NA | |
| Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS | Shimadzu | NA | |
| Stabilwax-DA column, 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 µm | Restek | NA | |
| plastic mucin carriers | Prodigest | NA |
References
- Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).
- Xu, J., Gordon, J.
- Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D.
- Macfarlane, G., Macfarlane, S. Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).
- McDonald, J., et al. Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).
- Van den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model. NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016 (2016).
- Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept. FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).
- Van den Abbeele, P., et al. Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli. Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).
- Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. Gut microbiome-host interactions in health and disease. Genome Medicine. 3 (3), 14 (2011).
- Wissenbach, D., et al. Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems. International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).
- McDonald, J., et al. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).
- Venema, K., van den Abbeele, P.
- Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology. Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).
- Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides. Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).
- Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota. Zebrafish. 00 (00), (2017).
- Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats. Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).
- Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Hale, V., et al. Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species. Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).
- Lu, D., et al. Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth. Microbiome. 6 (1), 4 (2018).
- Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling. Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).
- Muegge, B., et al. Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans. Science. 332 (6032), 970-974 (2011).
- Santiago-Rodriguez, T., et al. Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces. Microbiome. 9 (3), 58 (2015).
- Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).
- Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract. Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).
- Cueva, C., et al. In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites. FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).
- Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem. Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).
- Wang, M., et al. Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus. Molecules. 22 (8), (2017).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Edgar, R. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Cole, J., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).
- McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).
- Liu, L. S., et al. Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator. PLoS ONE. 13 (7), e0197692 (2018).
- Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M. Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME ®). The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health. Verhoeckx, K., et al. , Springer Link. (2015).
- Van den Abbeele, P., et al. Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model. The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).
- Possemiers, S., Verthé, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem. FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).
- Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. The role of short-chain fatty acids in health and disease. Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).
- Yang, J., Kweon, M. The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases. BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).
- Sonnenburg, J., Bäckhed, F. Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism. Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).
