Dette manuskriptet beskriver en enkel metode for å måle stress behaviorally i voksen sebrafisk. Tilnærmingen utnytter den medfødte tendensen som sebrafisk foretrekker den nederste halvdelen av en tank når du er i en stressende tilstand. Vi beskriver også metoder for kobling analysen med farmakologi.
Å reagere hensiktsmessig på stressende stimuli er avgjørende for å overleve kroppen. Omfattende forskning er gjort på et bredt spekter av stress-relaterte sykdommer og psykiatriske lidelser, men videre studier i genetisk og neuronal regulering av stress er fortsatt nødvendig for å utvikle bedre legemiddel selskap. Den sebrafisk gir en kraftig genetisk modell for å undersøke neural grunnlaget av stress, da det finnes en stor samling av mutant og transgene linjer. Videre kan farmakologi lett bli brukt til sebrafisk, som de fleste stoffene kan legges direkte til vann. Vi beskriver her bruk av “romanen tank test” som en metode for å studere medfødt stress svar i sebrafisk, og demonstrere hvordan potensielle angstdempende medikamenter kan bli validert ved hjelp av analysen. Metoden kan enkelt kombineres med sebrafisk linjer harboring genetiske mutasjoner, eller de der transgene tilnærminger for å manipulere presise nevrale kretser brukes. Analysen kan også brukes i andre fiske modeller. Sammen bør den beskrevne protokollen forenkle innføringen av denne enkle analysen til andre laboratorier.
Stress responsen er endret atferdsmessige og fysiologiske tilstander som følge av potensielt skadelige eller aversive stimuli. Stress responser bevares i dyreriket, og er avgjørende for overlevelse av en organisme1. Ti år med forskning har i stor grad utvidet vår kunnskap om noen av de genetiske og neuronal mekanismer underliggende stress tilstander. I dag, områder av hjernen som amygdala og striatum2, og genetiske faktorer som corticotropin slippe hormon (CRH), og glukokortikoid (gr) og mineralocorticoid reseptorer ( Mr) har blitt studert mye3,4,5,6. Til tross for disse kritiske funnene, er mye fortsatt ukjent om genetisk og neuronal regulering av stress. Som sådan, mange stress relaterte lidelser lider av en mangel på legemiddel.
Genetisk amendable modell organismer gir et nyttig verktøy i studiet av genetisk og neuronal kontroll av atferd. Fisk modeller, i særdeleshet, er ekstremt kraftig: de er små organismer med kort generasjon ganger, deres bruk i et laboratorium innstillingen er facile, deres genomer er lett endres, og som en virveldyr, deler de ikke bare genetisk, men også nevroanatomi homologi med sine pattedyr kolleger7,8. Standard analyser for måling av stress kan pares med sebrafisk linjer harboring genetiske mutasjoner, eller de der manipulering av presise neuronal delsett er mulig, og virkningene av enkelt gener eller definerte neurons kan vurderes raskt og effektivt.
Behaviorally, stress svar kan karakteriseres i fisk som perioder med Hyper-aktivitet eller lengre perioder med inaktivitet (beslektet med “frysing”)9, redusert leting10, rask pusting, redusert matinntak11, og en plass-preferanse for bunnen av en tank12. For eksempel, når oppstilt i en ukjent tank, voksen sebrafisk og annet liten fisken modeller viser en initial preferanse for bunnen halvparten av akvariet, ennå, over tid, fisken begynne Utforsker topp og bunnen halvdeler med like ved-likeverdig hyppigheten12. Behandling av voksne med rusmidler kjent for å redusere angst forårsake fisk å utforske umiddelbart den øverste halvdelen10,13. Omvendt, medikamenter som øker angst forårsake fisk å vise sterke preferanse for den nederste halvdelen av tanken12,14,15. Således, nedsatte utforskningen og preferanse for bunnen halvparten av akvariet er enkel og pålitelig indikatorene av trykk.
Som de fleste virveldyr, stress svar i fisk er drevet av aktivering av hypothalamus-hypofysen-Inter-nyre aksen (HPI; analogt til hypothalamus-hypofysen-adrenal [HPA] aksen i pattedyr)14,16. Hypothalamus neurons uttrykker hormonet corticotropin-lanserer Hormone (CRH) signal til hypofysen, som igjen utgivelser adrenokortikotropt lanserer Hormone (ACTH). ACTH deretter signaler til Inter-renal kjertel å produsere og skiller ut kortisol, som har en rekke nedstrøms mål16, en av dem er negative tilbakemeldinger av CRH-produserende hypothalamus neurons3,17, 18,19.
Her beskriver vi en metode for å vurdere atferds tiltak av medfødt stress. For atferden, vi detalj protokoller ved hjelp av romanen tank Diving test12,14. Vi viser, som et eksempel, at en kjent angstdempende narkotika, Buspirone, reduserer atferdsmessige tiltak for stress.
Sebrafisk viser en robust stress respons i en roman tank
Her beskriver vi en enkel atferdsdata tilnærming for å undersøke stressresponser i voksen sebrafisk, og validere tilnærmingen som et enkelt mål på stress ved hjelp av farmakologi.
Romanen tank test er en mye brukt test for å undersøke medfødte stress i sebrafisk og andre arter av fisk12,14,21,35<…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Jupiter Life Science Initiative ved Florida Atlantic University til ERD og ACK. Dette arbeidet ble også støttet av tilskudd R21NS105071 (tildelt ACK og ERD) og R15MH118625 (tildelt ERD) fra National Institutes of Health.
Camera | We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics. | ||
Infrared filter | Edmund Optics | ||
Video Acquisition Program | Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set. | ||
Infrared LED lights | |||
Assay tank | Aquaneering | Part number ZT180 | Size: M3 1.8 liter |
Stand and clamp, or standard tripod for camera | |||
250mL beaker | |||
Tracking software | We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology | ||
Buspirone chloride | Sigma-Aldrich | B7148 | |
Randomized trial generator | We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel |