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Behavior

Zebrafish में जंमजात तनाव का अध्ययन करने के लिए व्यवहार दृष्टिकोण

doi: 10.3791/59092 Published: May 1, 2019

Summary

यह पांडुलिपि वयस्क zebrafish में व्यवहार व्यवहार के दबाव को मापने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करता है । दृष्टिकोण जंमजात प्रवृत्ति का लाभ लेता है कि zebrafish एक टैंक के नीचे आधा पसंद करते है जब एक तनावपूर्ण स्थिति में । हम भी औषध विज्ञान के साथ परख युग्मन के लिए तरीकों का वर्णन ।

Abstract

तनावपूर्ण उत्तेजनों के लिए उचित जवाब एक जीव के अस्तित्व के लिए आवश्यक है । व्यापक अनुसंधान तनाव से संबंधित रोगों और मनोरोग विकारों की एक विस्तृत स्पेक्ट्रम पर किया गया है, अभी तक तनाव के आनुवंशिक और न्यूरोनल विनियमन में आगे के अध्ययन के लिए बेहतर चिकित्सा विज्ञान विकसित करने की आवश्यकता है । Zebrafish एक शक्तिशाली आनुवंशिक मॉडल के लिए तनाव की तंत्रिका मद की जांच प्रदान करता है, के रूप में वहां उत्परिवर्ती और ट्रांसजेनिक लाइनों का एक बड़ा संग्रह मौजूद है । इसके अलावा, औषध विज्ञान zebrafish के लिए आसानी से लागू किया जा सकता है, के रूप में ज्यादातर दवाओं पानी के लिए सीधे जोड़ा जा सकता है । हम यहां zebrafish में जंमजात तनाव प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक विधि के रूप में ' उपंयास टैंक टेस्ट ' के उपयोग का वर्णन है, और कैसे संभावित anxiolytic दवाओं परख का उपयोग कर मांय किया जा सकता है प्रदर्शन । विधि आसानी से zebrafish आनुवंशिक उत्परिवर्तनों शरण लाइनों के साथ युग्मित किया जा सकता है, या उन में जो सटीक तंत्रिका सर्किट हेरफेर के लिए ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया जाता है । परख भी अंय मछली मॉडल में इस्तेमाल किया जा सकता है । एक साथ, वर्णित प्रोटोकॉल अंय प्रयोगशालाओं के लिए इस सरल परख के गोद लेने की सुविधा चाहिए ।

Introduction

तनाव प्रतिक्रियाओं व्यवहार और शारीरिक संभावित हानिकारक या aversive उत्तेजनों के परिणामस्वरूप राज्यों बदल रहे हैं । तनाव प्रतिक्रियाओं पशु किंगडम भर में संरक्षित कर रहे हैं, और एक जीव1के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण हैं । अनुसंधान के दशक बहुत आनुवंशिक और न्यूरोनल तनाव राज्यों अंतर्निहित तंत्र में से कुछ के बारे में हमारे ज्ञान का विस्तार किया है । आज, मस्तिष्क के क्षेत्रों जैसे प्रमस्तिष्कखंड और striatum2, और corticotropin रिहा हार्मोन (crh) जैसे आनुवंशिक कारकों, और glucocorticoid (जीआर) और खनिज ocorticoid रिसेप्टर्स ( श्री) बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है3,4,5,6. इन महत्वपूर्ण निष्कर्षों के बावजूद, बहुत तनाव के आनुवंशिक और न्यूरोनल विनियमन के बारे में अज्ञात है । इस प्रकार, तनाव से संबंधित कई विकारों चिकित्सा विज्ञान की कमी से पीड़ित हैं ।

आनुवंशिक रूप से संशोंधित मॉडल जीवों के व्यवहार के आनुवंशिक और न्यूरोनल नियंत्रण के अध्ययन में एक उपयोगी उपकरण प्रदान करते हैं । मछली मॉडल, विशेष रूप से, बहुत शक्तिशाली हैं: वे छोटी पीढ़ी के समय के साथ छोटे जीव हैं, एक प्रयोगशाला की स्थापना में उनके उपयोग facile है, उनके जीनोम आसानी से संशोधित कर रहे हैं, और, एक कशेरुकी के रूप में, वे न केवल आनुवंशिक, लेकिन यह भी neuroसंरचनात्मक साझा उनके स्तनधारी7,8समकक्षों के साथ समजातता । मानक assays हैं, तनाव को मापने के लिए zebrafish आनुवंशिक उत्परिवर्तनों शरण लाइनों के साथ जोड़ा जा सकता है, या उन जिसमें सटीक न्यूरोनल सबसेट के हेरफेर संभव है, और एकल जीन या परिभाषित ंयूरॉंस के प्रभाव को तेजी से और कुशलता से मूल्यांकन किया जा सकता है ।

व्यवहारमौखिक रूप से, तनाव प्रतिक्रियाओं हाइपर के समय के रूप में मछली में विशेषता गतिविधि या निष्क्रियता के लंबे समय तक हो सकता है (' ठंड ' के समान)9, कम अंवेषण10, तेजी से श्वास, कम भोजन की खपत11, और एक प्लेस-एक टैंक12के नीचे के लिए वरीयता । उदाहरण के लिए, जब एक अपरिचित टैंक में रखा, वयस्क zebrafish और अंय छोटे मछली मॉडल टैंक के नीचे आधे के लिए एक प्रारंभिक वरीयता दिखाने के लिए, अभी तक, समय के साथ, मछली के पास बराबर आवृत्ति12के साथ शीर्ष और नीचे आधा तलाश शुरू करते हैं । चिंता को कम करने के लिए जाना जाता दवाओं के साथ वयस्कों के उपचार के कारण मछली तुरंत शीर्ष आधा10,13का पता लगाने के लिए । इसके विपरीत, दवाओं है कि चिंता बढ़ाने के लिए मछली के कारण टैंक के नीचे आधे के लिए मजबूत वरीयता दिखाने के लिए12,14,15। इस प्रकार, कम खोज और टैंक के निचले आधे के लिए वरीयता तनाव के सरल और विश्वसनीय संकेतक हैं ।

अधिकांश कशेरुकी की तरह, मछली में तनाव प्रतिक्रियाओं hypothalamic-पिट्यूटरी के सक्रियण द्वारा संचालित कर रहे हैं-अंतर्वृक्क अक्ष (hpi, स्तनधारियों में hypothalamic-पीयूषिका-अधिवृक्क [hpi] अक्ष के अनुरूप)14,16. Hypothalamic ंयूरॉंस व्यक्त हार्मोन corticotropin रिलीजिंग हार्मोन (CRH) संकेत करने के लिए पिट्यूटरी, जो बारी में adrenocorticotropic रिलीजिंग हार्मोन (ACTH) । तो acth अंतर-वृक्क ग्रंथि के उत्पादन के लिए संकेत और कोर्टिसोल, जो डाउनस्ट्रीम लक्ष्य16की एक संख्या है छिपाना, उनमें से एक crhउत्पादन हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स के नकारात्मक प्रतिक्रिया जा रहा है3,17, 18,19.

यहाँ, हम सहज तनाव के व्यवहार के उपायों का आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णन. व्यवहार के लिए, हम विस्तार प्रोटोकॉल उपंयास टैंक डाइविंग परीक्षण12,14का उपयोग कर । हम तो एक उदाहरण के रूप में, प्रदर्शन, कि एक ज्ञात anxiolytic दवा, buspirone, तनाव के व्यवहार के उपायों को कम कर देता है.

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Protocol

प्रोटोकॉल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति फ्लोरिडा अटलांटिक विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. तैयारी

  1. व्यवहार अध्ययन करने के लिए एक अलग कमरा निर्दिष्ट करें, या कमरे के एक अनुभाग को बंद करें ताकि वह अलग-थलग रहे ।
    नोट: कमरे और अबाधित होना चाहिए कम यातायात मछली के सामांय व्यवहार में खलल न डालें से बचने के लिए ।
  2. व्यवहार कक्ष में निंनलिखित सामग्री और उपकरण ले जाएं: (i) एक कैमरा और लेंस, (ii) एक अवरक्त फिल्टर जो लेंस के लिए संलग्न किया जा सकता है, (iii) एक कैमरा स्टैंड, (iv) कैमरा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ एक कंप्यूटर, (v) एक फर्म और स्थिर तालिका परख करने के लिए पर, (vi) इंफ्रारेड लाइट्स (IR लाइट्स; ८५० एनएम या ९४० एनएम), (vii) एक सफेद एक्रिलिक विसारक, जो रिकॉर्डिंग टैंक की लंबाई (viii) १.८ एल trapezoidal प्लास्टिक परख टैंक (' उपंयास टैंक ' के रूप में संदर्भित करने के लिए) से अधिक लंबा है, एक यहां इस्तेमाल किया 12 x 18 इंच है) , और (ix) मछली प्रणाली के पानी की एक बाल्टी ।
    नोट: उपंयास टैंक के लिए, हमारे लैब वाणिज्यिक उपलब्ध प्लास्टिक वाहिकाओं, जो आकार में trapezoidal है का उपयोग करता है । टैंक के आयाम मोटे तौर पर कर रहे हैं 6 में एक्स 9 में (विस्तृत आयाम चित्र 1में प्रदान की जाती हैं). विसारक बोर्ड का उपयोग हम उपंयास टैंक से थोड़ा बड़ा है (में एक्स 18 में 12) । उपन्यास टैंक प्रयोगों अलग आकार वाले टैंकों के साथ प्रदर्शन किया गया है, जैसे उन है जो आयताकार या विभिन्न trapezoidal आयाम के साथ उन लोगों के रूप में20,21. आमतौर पर, मछली व्यवहार उनके आयामों की परवाह किए बिना सभी टैंकों में समान है: सभी कंटेनरों के लिए, मछली शुरू में नीचे आधा पसंद करते हैं, अभी तक समय के साथ अधिक से अधिक आवृत्ति के साथ शीर्ष आधा तलाश शुरू करते हैं ।
  3. कैमरा लेंस के लिए अवरक्त फिल्टर देते हैं । अवरक्त प्रकाश स्ट्रिप्स की तरंग दैर्ध्य आम तौर पर ८५० एनएम से ९४० एनएम के लिए सीमा । फिल्टर एक लंबे समय से गुजारें फिल्टर है कि तरंग दैर्ध्य के प्रकाश से कम ७२० एनएम के माध्यम से कैमरे के लिए प्रसारण से प्रतिबंधित है ।
  4. कैमरा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के लिए उपयुक्त मापदंडों का चयन करें । सबसे रिकॉर्डिंग के लिए, कैमरा अधिग्रहण सेट करने के लिए 30 फ्रेम प्रति सेकंड की दर, और 10 मिनट के लिए रिकॉर्डिंग की अवधि.
    नोट: ये पैरामीटर, experiment के आधार पर भिन्न हो सकते हैं । उदाहरण के लिए, एक उपंयास टैंक22,23में आदत का अध्ययन करने के लिए, अब रिकॉर्डिंग की आवश्यकता हो सकती है ।

2. सेटअप

नोट: इस खंड में कदम उपंयास टैंक परख की स्थापना का वर्णन । अंतिम उत्पाद का आरेख चित्र 1में दिया गया है ।

  1. उपन्यास की टंकी को मेज के बीचों-बीच रखें ।
  2. स्थिति टैंक के पीछे अवरक्त रोशनी और टैंक और एलईडी प्रकाश स्रोत के बीच में सफेद एक्रिलिक शीट या विसारक स्क्रीन जगह है ।
    1. विसारक प्लेस इतना है कि यह अधिकतम एल ई डी से आ रही प्रकाश फैलता है, और प्रकाश की तीव्रता उपंयास टैंक रोशन करने के लिए पर्याप्त है । करीब बोर्ड प्रकाश स्रोत के लिए है, चमकदार रोशनी हो जाएगा, अभी तक कम यह फैलाना होगा । इसके विपरीत, विसारक बोर्ड प्रकाश स्रोत से दूर रखने प्रकाश की तीव्रता कम हो जाएगा, लेकिन प्रकाश बेहतर प्रसार ।
  3. मछली प्रणाली के पानी के साथ उपंयास टैंक के लगभग तीन तिमाहियों भरें ।
    नोट: सिस्टम पानी के नल का पानी की रिवर्स असमस का उपयोग कर उत्पंन होता है, खुराक ऐसी है कि चालकता ९०० ± १०० μs के बराबर होती है, कि पीएच तटस्थ (७.२) है, और है कि तापमान 27 ± 1 डिग्री सेल्सियस है ।
  4. कैमरा स्टैंड पर कैमरा अटैच करें और कैमरे को कंप्यूटर से कनेक्ट करें । वीडियो अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलो और कैमरे को समायोजित करने के लिए टैंक के सामने का सामना और पूरे उपंयास टैंक को सुनिश्चित करने और देखा जा सकता है कि वीडियो में कोई अस्पष्ट क्षेत्रों रहे हैं । टैंक और अवरक्त रोशनी इस तरह है कि वहां पर्याप्त है और यहां तक कि जब कैमरे के माध्यम से मनाया टैंक भर में रोशनी समायोजित करें ।
    नोट: प्रयोग करने के लिए आगे बढ़ने से पहले, यह अक्सर एक परीक्षण चलाने के लिए उपयोगी हो सकता है, जिसमें एक मछली के वीडियो पर कब्जा कर लिया है और ट्रैकिंग किया जाता है । यह सुनिश्चित करेगा कि सेटअप व्यवहार के प्रयोग के लिए पर्याप्त है ।

3. उपंयास टैंक टेस्ट सेटअप

  1. एक २५० मिलीलीटर बीकर पूर्व तैयार मछली प्रणाली के पानी से भरा है, और कम से दो जोत टैंक ।
  2. परीक्षण की सुबह, एक जोत टैंक में मछली की सुविधा से प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति (नियंत्रण और प्रयोगात्मक वयस्कों) के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए कम से 10 परीक्षण वयस्क zebrafish स्थानांतरण, व्यवहार कमरे में उन्हें हस्तांतरण, और उन्हें कम से एक के लिए acclimate करने की अनुमति घंटा.
    नोट: एक शक्ति विश्लेषण प्रयोग से पहले किया जाना चाहिए, अभी तक हमारे हाथ में, एक n = 10 आमतौर पर सांख्यिकीय महत्व का पता लगाने के लिए पर्याप्त है । इसके अतिरिक्त, होल्डिंग टैंक में प्रति लीटर पानी में पांच से अधिक व्यक्ति नहीं होने चाहिए । एक घंटे के acclimation पर्याप्त है के रूप में zebrafish वयस्कों के एक नए टैंक22के 30 मिनट के भीतर आदत के रूप में दिखाया गया है । इसके अलावा, व्यवहार लय circadian प्रक्रियाओं से प्रभावित हैं, और इस प्रकार प्रयोगात्मक प्रतिकृति अलग दिन पर किया जाना चाहिए एक ही घंटे के भीतर किया जाना चाहिए । हम आमतौर पर 11:00 am और 6:00 pm के घंटों के बीच सभी प्रयोगों को निष्पादित करते हैं.
  3. टैंकों को इस प्रकार लेबल करें कि पशुओं की स्थिति या जीनोटाइप प्रयोगकर्ता के लिए अंधा हो ।
    नोट: प्रयोग आसानी से एक पत्र या संख्या प्रणाली (यानी, एक टैंक लेबल है ' एक ', दूसरे ' बी ', आदि) का उपयोग टैंक लेबलिंग द्वारा experimenter को अंधा किया जा सकता है । एक पार्टी के प्रयोगों में शामिल नहीं इस तरह के एक प्रणाली के साथ टैंक लेबल, और मास्क के बाद जब तक experimenter से विश्लेषण पूरा हो गया है ।
  4. एक नेट का प्रयोग, धीरे से पहले चरण ३.१ से भरा बीकर में एक एकल वयस्क जगह है । वयस्क मछली 10 मिनट के लिए बीकर में acclimate करने के लिए अनुमति दें ।
    नोट: वयस्क के लिंग रिकॉर्ड, के रूप में यह महत्वपूर्ण पोस्ट विश्लेषण के लिए सेक्स के विशिष्ट मतभेदों को देखने के लिए हो सकता है ।
  5. बीकर में acclimation के बाद, उपंयास टैंक में मछली परिचय (1 अनुभाग में स्थापित) धीरे से बाहर पानी और बीकर से वयस्क डालने के द्वारा ।
  6. उपन्यास टैंक में वयस्क शुरू करने के बाद, कैमरा रिकॉर्डिंग शुरू, और मछली के लिए अतिरिक्त संकट को रोकने के लिए सेटअप से दूर ले जाएँ ।
  7. रिकॉर्डिंग समाप्त होने के बाद, उपंयास टैंक और एक नई होल्डिंग टैंक में जगह से व्यक्ति को हटा दें ।
    नोट: एक अलग होल्डिंग टैंक से एक कदम ३.२ में एक ही व्यक्तियों पर दोहराया परीक्षण को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  8. सभी जानवरों का परीक्षण किया गया है जब तक कि प्रत्येक वयस्क के लिए ३.७ करने के लिए ३.४ चरणों को दोहराएं ।
    नोट: स्थितियों या genotypes चकाचौंध के अलावा, परीक्षण randomize । एक यादृच्छिक संख्या जनरेटर या एक परीक्षण के बीच randomize करने के लिए अनुमति देता है कि किसी भी उपकरण का उपयोग करें. यह प्रयोग करने से पहले किया जाना चाहिए ताकि प्रत्येक परीक्षण के प्रयोग शुरू होने से पहले निर्धारित है ।
  9. सभी परीक्षणों के अंत में मछली वापस मछली की सुविधा के लिए वापसी ।

4. दवा के साथ pretreatment

नोट: निम्नलिखित चरणों का उद्देश्य दवाओं के उपयोग से पहले और बाद में एक व्यक्ति के व्यवहार की तुलना करने के लिए है. यह तुलना पहले कदम ३.४ में ३.६ के रूप में एक उपंयास टैंक परीक्षण प्रदर्शन, नशीली दवाओं के उपचार के बाद, और फिर एक दूसरे उपंयास टैंक टेस्ट (चित्रा 3) के द्वारा प्राप्त की है ।

  1. सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सहित दवा का एक स्टॉक समाधान तैयार करें ।
    नोट: यदि दवा पहले साहित्य में इस्तेमाल किया गया है, एक उपयुक्त काम खुराक खोजने के लिए और इस का उपयोग करें । उदाहरण के लिए, प्रतिनिधि परिणामों में buspirone के लिए, हम एक 100x स्टॉक समाधान करते है और उपयोग ०.०५ मिलीग्राम/एमएल अंतिम एकाग्रता के रूप में, के रूप में13,20साहित्य में वर्णित है । यदि सुझाया खुराक अज्ञात है, एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र कई सांद्रता का परीक्षण करके किया जाना चाहिए. नशीली दवाओं के धारावाहिक dilutions के साथ और अधिक beakers की स्थापना की । दवा पानी में घुल नहीं है, तो एक विलायक के रूप में डाइमेथिल सल्फॉनाइड (dmso) का उपयोग करें ।
  2. प्रणाली पानी के साथ २५० मिलीलीटर beakers में एकाग्रता काम करने के लिए दवाओं को पतला । उदाहरण के लिए, यदि एक 100x समाधान किया गया था, 1:100 सिस्टम पानी में पतला । एक नियंत्रण के रूप में केवल प्रणाली पानी के साथ एक बीकर सेट करें ।
    नोट: यदि DMSO चरण ३.१ में एक विलायक के रूप में इस्तेमाल किया गया था, नियंत्रण बीकर में DMSO की एक समान मात्रा का उपयोग करें ।
  3. एक और शोधकर्ता की मदद से, मुखौटा दवा और नियंत्रण beakers की पहचान सुनिश्चित करने के लिए कि परीक्षक के बाद तक उपचार की स्थिति के लिए अंधा है विश्लेषण ।
    नोट: एक नंबर या पत्र प्रणाली का इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. एक आधार रेखा व्यवहार दबाव प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए ३.६ करने के लिए ३.१ चरणों का पालन करके एक उपंयास टैंक परीक्षण करें ।
  5. बेसलाइन रिकॉर्डिंग के बाद, एक शुद्ध का उपयोग करने के लिए तुरंत उपंयास टैंक से वयस्क मछली को हटाने और यह बीकर में जगह दवा या वाहन के साथ dosed, के रूप में कदम ४.२ में वर्णित है । वयस्क को बीकर में 10 मिनट के लिए रहने की अनुमति दें ।
    नोटः यह सुनिश्चित करें कि दवाओं के क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए नेट बीकर्स में पानी को स्पर्श न करे । इस्तेमाल दवा के आधार पर उचित खुराक और प्रशासन समय सुनिश्चित करें. एक 10 मिनट के उपचार के समय सभी दवाओं के लिए काम नहीं हो सकता है ।
  6. उपचार के बाद, एक जाल का उपयोग करने के लिए कदम ४.५ में बीकर से वयस्क हटाने और यह एक और बीकर में जगह ताजा प्रणाली पानी से भर ही । द्वितीय उपन्यास टैंक परीक्षण के दौरान आगे की खुराक को कम करने के लिए यह वातकाल है । वयस्क एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए बाहर धोने बीकर में रहने के लिए अनुमति दें ।
    नोट: अलग जाल दवा के साथ किसी भी अवांछित पार उपचार को रोकने के लिए प्रत्येक दवा की स्थिति के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. धोने की अवधि को छोड़ दिया जा सकता है अगर experimenter इच्छाओं ।
  7. पिछले चरण में बीकर से उस वयस्क को हटाने के उपंयास टैंक डाइविंग टेस्ट एक दूसरी बार प्रदर्शन, यह एक नया उपंयास टैंक में जगह है, और ३.६ के लिए ३.५ चरणों का पालन करें ।
  8. दूसरे उपन्यास टैंक टेस्ट के बाद व्यक्ति को अलग होल्डिंग टैंक में निकाल दें । दूर दूसरे उपंयास टैंक में प्रणाली पानी डालो और यह अगले परीक्षण के लिए ताजा प्रणाली पानी के साथ भरें । यह चरण किसी भी दवा के क्रॉस-संदूषण से बचाता है ।
    नोट: दवाओं के आधे जीवन पर निर्भर करता है, नई दवाओं युक्त beakers हर 3 घंटे बनाया जाना चाहिए । बुपिएक के लिए, हर 3 घंटे में ताजा समाधान करें । इसके अलावा, चरण ३.८ में नोट के बाद, परीक्षण नियंत्रण और नशीली दवाओं के उपचार के बीच यादृच्छिक किया जाना चाहिए ।
  9. सभी परीक्षणों के अंत में, वापस मछली की सुविधा में व्यक्तियों वापसी ।
    नोट: इस्तेमाल दवा के प्रकार पर निर्भर करता है, व्यक्तियों पर इन उपचार के प्रभाव लंबे समय तक चलने जा सकता है । इसलिए इन व्यक्तियों का प्रयोग अन्य प्रयोग में न करें ।

5. वीडियो विश्लेषण

  1. सभी परीक्षणों के बाद, विकल्प के सॉफ्टवेयर पर नज़र रखने में वीडियो फ़ाइलों को लोड ।
    नोट: हम आमतौर पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हैं, फिर भी कई स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर संकुल का उपयोग किया जा सकता है । ट्रैकिंग प्राप्त करने के लिए कदम सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया पैकेज के अनुसार अलग हो सकता है ।
  2. वीडियो से एक अभी भी फ्रेम का उपयोग करना, चारों ओर काल्पनिक सीमाओं को परिभाषित (मैं) पूरे उपंयास टैंक arena है कि पानी से भर जाता है, और चारों ओर सीमाओं (द्वितीय) शीर्ष तीसरे, (iii) मध्य तीसरे, और (iv) टैंक के नीचे तीसरे । इन का उपयोग करने के लिए समय है कि मछली उपंयास टैंक के प्रत्येक भाग में खर्च की स्थापना ।
  3. चरण ५.२ में परिभाषित प्रत्येक एरिना के लिए एक्स-वाई विस्थापन प्रति फ्रेम की गणना करें ।
  4. ऊपर, मध्य, और टैंक के नीचे क्षेत्रों को परिभाषित करें । प्रत्येक क्षेत्र का आकार समान होना चाहिए । इन क्षेत्रों के निर्धारण के लिए एक संक्षिप्त विधि y-दिशा में टैंक की लंबाई की गणना करने के लिए है, और यह 3 से विभाजित करते हैं ।
    नोट: सामांय प्रोटोकॉल के लिए भिंनताएं मौजूद हैं । उदाहरण के लिए, कुछ लैब्स halves तिहाई के बजायआधे का उपयोग करें ।
  5. प्रत्येक क्षेत्र, दूरी, और वेग में बिताए समय का निर्धारण ।
    नोट: अधिकांश ट्रैकिंग पैकेज स्वचालित रूप से उपयोगकर्ता के लिए इन की गणना करेगा । हालांकि, यदि ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर नहीं होता है, तो इंहें x-y विस्थापन मानों से आसानी से परिकलित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, दूरी सूत्र का उपयोग करके निर्धारित की जा सकती है:
    Equation 1
    और वेग सूत्र के बाद निर्धारित किया जा सकता है:
    Equation 2
  6. सभी परीक्षणों के लिए ट्रैक और माप प्राप्त करने के लिए ५.४ करने के लिए ५.२ चरणों को दोहराएं ।
    नोट: इस सामांय प्रोटोकॉल के लिए भिंनताएं

6. सामांयता के लिए परीक्षण

  1. सांख्यिकीय अंतर की गणना करने के लिए आगे बढ़ने से पहले आँकड़े प्रदर्शन. यह देखने के लिए जांचें कि क्या डेटा सामान्य रूप से Shapiro-Wilk परीक्षण का उपयोग करके वितरित किया जाता है.
  2. यदि डेटा सामान्य रूप से वितरित किया जाता है कि शून्य परिकल्पना अस्वीकार कर दिया है (यानी, डेटा एक गाउसीय वितरण का पालन नहीं करता है), गैर-पैरामीट्रिक परीक्षणों का उपयोग कर सभी परीक्षण प्रदर्शन. इसके विपरीत, यदि डेटा एक सामांय वितरण का पालन करने के लिए पाया जाता है, पैरामीट्रिक परीक्षणों का उपयोग करने के लिए आगे बढ़ें ।
    नोट: हम आँकड़े प्रदर्शन करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करें; हालांकि आर प्रोग्रामिंग लैंग्वेज का भी इस्तेमाल किया जा सकता है । एक Shapiro-Wilk विश्लेषण किया जा सकता है आर shapiro का उपयोग कर. test समारोह ।

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Representative Results

Zebrafish में तनाव की जांच
जंगली प्रकार zebrafish में समय के साथ तनाव व्यवहार की जांच करने के लिए, हम उपंयास टैंक परीक्षण में अब तनाव24 से वयस्क मछली का परीक्षण किया । एबी वयस्कों के ऊपर वर्णित के रूप में प्रोटोकॉल के अधीन थे । संक्षेप में, व्यवहार कक्ष में एक टैंक में मछली को 1-h acclimation अवधि दी गई थी । एक व्यक्ति 10 मिनट के लिए एक बीकर में रखा गया था, और फिर एक अपरिचित टैंक (उपंयास टैंक) ताजा प्रणाली के पानी से भर में धीरे रखा । चलन गतिविधि 10 मिनट के लिए रिकॉर्ड किया गया था, और ट्रैकिंग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग ऑफ़लाइन किया गया था । पहले और अंतिम मिनट के बीच चलन गतिविधि की तुलना में नाटकीय अंतर दिखाई दिया (चित्र 2क, ख) । जब पहली बार टैंक में शुरू की, मछली नीचे में समय के बहुमत खर्च (चित्रा 2), अभी तक समय के साथ, वयस्कों के शीर्ष में बिताए समय की राशि में एक क्रमिक वृद्धि हुई थी (चित्रा 2बी, सी) । अंतिम मिनट की तुलना में पहले मिनट में शीर्ष पर खर्च की गई कुल अवधि में महत्वपूर्ण अंतर (६.२९ ± ८.२१ एस बनाम २३.२३ ± ९.०२ एस; युग्मित टी-टेस्ट, पी < ०.०५) (चित्रा 2सी) का पता चला । इसके विपरीत, कुल दूरी पहले और आखिरी मिनट के बीच कूच कोई महत्वपूर्ण अंतर पता चला (४४०.४ ± ११०.३ सेमी बनाम ४०५.५ ± ४९.७१ सेमी; युग्मित t-test, p = ०.३७५) (चित्रा 2डी) । क्योंकि जंमजात वरीयता पहले और आखिरी मिनट के बीच अलग था, और नहीं दूरी कूच, हमारा मानना है कि व्यवहार में परिवर्तन एक तनाव की प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है, और नहीं केवल चलन गतिविधि में परिवर्तन । इन परिणामों को प्रदर्शित करता है कि zebrafish एक आसानी से मापने योग्य जंमजात तनाव प्रतिक्रिया प्रदर्शन । इस दृष्टिकोण भी एक नींव जानवरों के विभिंन समूहों के बीच तनाव अंतर की तुलना करने के लिए स्थापित करता है, और उन दोनों के बीच तनाव में अंतर का आकलन ।

Zebrafish में तनाव व्यवहार पर anxiolytic दवाओं के प्रभाव
Zebrafish जांच दवाओं के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली है, के बाद से दवा के आवेदन केवल पानी25,26,27से जोड़ने के द्वारा गैर इनवेसिव तरीके में लागू किया जा सकता है । Zebrafish में है कि नीचे निवास को मांय एक सहज तनाव की प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है, हम वयस्क zebrafish के समूहों में व्यवहार की तुलना में पहले और एक anxiolytic दवा के लिए जोखिम के बाद परीक्षण किया; एक नियंत्रण के रूप में, हम इसी तरह वयस्कों के एक अलग संभाला, अभी तक दवा के बजाय केवल वाहन (सिस्टम पानी) लागू किया । हम 5ht1a रिसेप्टर एगोनिस्ट buspirone, जो एक नियंत्रित पदार्थ नहीं है और मानव सामांयीकृत चिंता विकार28से पीड़ित रोगियों के लिए निर्धारित किया जाता है । Buspirone को विभिंन मछली और स्तनधारी मॉडलों में व्यवहार तनाव प्रतिक्रियाओं में कमी पैदा करने के लिए मांय किया गया है10,13,21,29,30, 31,३२,३३,३४ । के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित है, zebrafish पहले उपंयास टैंक परीक्षण में दर्ज किया गया, फिर से प्राप्त की और 10 मिनट के लिए दवा या वाहन के एक बीकर में रखा गया । मछली तो एक ' धोने के बाहर ' अवधि, जहां वे 10 मिनट के लिए एक नया बीकर में रखा गया था दिया गया , और फिर उपंयास टैंक टेस्ट में पुनः दर्ज (चित्रा 3) ।

गमन पथ के विश्लेषण से पहले और बाद में अकेले वाहन को उजागर वयस्कों के समूहों के लिए उपचार के बाद थोड़ा अंतर पता चला (चित्रा 3बी) । इसके विपरीत, buspirone के संपर्क में वयस्कों दवा जोखिम से पहले एक ही मछली के गतिकारक रास्तों की तुलना में शीर्ष में समय की एक बड़ी राशि खर्च (चित्रा 3बी, सी). समय की अवधि का परिमाणीकरण ऊपर में खर्च पूर्व और बाद नियंत्रण जानवरों में उपचार के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर पता चला (१८३.९ ± ९०.४६ एस पहले बनाम ११३.८ ± ८१.८८ एस के बाद; ०.४२५४), अभी तक buspirone को उजागर पशुओं के शीर्ष में काफी अधिक समय बिताया पूर्व उपचार के सापेक्ष, और नियंत्रण के बाद व्यक्तियों (Buspirone: २०१.४ ± ४९.९५ एस से पहले बनाम ५५२.२ ± ४२.९७ s के बाद, एक तरह से है Sidak एकाधिक तुलना परीक्षण, पी < ०.०००१; नियंत्रण बनाम Buspirone पोस्ट-उपचार: p < ०.०००१.) (चित्र 3) । यह जांच करने के लिए कि मतभेदों को सामांय में कम चलन के कारण थे, हम कुल दूरी की यात्रा मापा । इन आंकड़ों के समूहों में से किसी के लिए कोई महत्वपूर्ण अंतर से पता चला (४१३४ ± ६०१.९ सेमी पहले बनाम ३४७१ ± ७६६ सेमी के बाद नियंत्रण के लिए; Kruskal-वाका टेस्ट, पी > ०.०५; ३९०४ ± ३०१.३ सेमी पहले बनाम ३६४४ ± ५६६.३ सेमी के बाद buspirone के लिए; क्रासकल-वाल् की परीक्षण, च् > ०.०५) (चित्र 3) । एक साथ लिया, इन आंकड़ों को प्रदर्शित करता है कि वयस्क zebrafish में नीचे निवास सहज तनाव का एक उपाय है, और आगे वयस्क zebrafish में औषधीय प्रयोगों के लिए एक नींव की स्थापना ।

Figure 1
चित्रा 1 . उपंयास टैंक सेटअप के आरेख । () १.८ एल trapezoidal उपंयास टैंक के आयाम के रूप में टैंक की रिकॉर्डिंग पक्ष से देखा । () सेटअप के आरेख जिसमें इन्फ्रारेड लाइट्स, कैमरा और मानवीय हस्तक्षेप को न्यूनतम करने के लिए उपयोग में आने वाली बाधाएं शामिल हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 . जंगली प्रकार zebrafish में सहज तनाव प्रतिक्रियाओं की जांच । (एक) प्रतिनिधि पहले मिनट (बाएं) और अंतिम मिनट (दाएं) में एक 10 मिनट की रिकॉर्डिंग के उपंयास टैंक टेस्ट में एक व्यक्ति वयस्क के तैरने के रास्तों । टैंक के शीर्ष, मध्य और निचले क्षेत्रों को परिभाषित करने वाली काल्पनिक रेखाएं डॉटेड रेखाओं के साथ दर्शाई जाती हैं । () 10 मिनट की रिकार्डिंग के प्रत्येक मिनट के लिए शीर्ष क्षेत्र में कुल समय खर्च का परिमाणीकरण । (ग & घ) शीर्ष क्षेत्र में खर्च की गई कुल अवधि की तुलना () और कुल दूरी कूच (डी) सभी परीक्षणों के पहले और अंतिम मिनट में । युग्मित t-परीक्षणों का उपयोग विश्लेषण के लिए किया गया था क्योंकि डेटा ने सामान्य के लिए Shapiro-Wilk परीक्षण को पास कर दिया था. n = 5; *: p = ०.०२८ । त्रुटि पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि इंगित करती हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 . तनाव व्यवहार पर anxiolytic दवाओं के प्रभाव की जांच. () प्रायोगिक प्रवाह की योजनाबद्ध । () प्रतिनिधि तैरने पथ पूर्व और एक नियंत्रण व्यक्ति से एक व्यक्ति के उपचार के बाद प्रणाली पानी के साथ ही इलाज किया, और एक अंय व्यक्ति के उपंयास टैंक परीक्षण में buspirone के साथ इलाज किया । डॉटेड लाइनें टैंक के शीर्ष, मध्य, और नीचे के क्षेत्रों के पृथक्करण को परिभाषित करती हैं । ग्रे पटरियों नियंत्रण व्यक्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं, और नीले पटरियों buspirone-इलाज व्यक्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं. (ग & घ) शीर्ष क्षेत्र में खर्च की गई कुल अवधि की तुलना () और कुल दूरी कूच (डी) के बीच नियंत्रण (Ctrl) और buspirone-इलाज (busp) परीक्षण. पहले Shapiro-Wilk परीक्षण का उपयोग कर सामांयता के लिए एक परीक्षण किया गया था । जहां सामांय के लिए परीक्षण में विफल रहा है, Kruskal-वाल् स परीक्षण के बाद Dunn एकाधिक तुलना परीक्षण किया गया था (); और अगर डेटा सामांयता पारित, एक तरह से है Sidak एकाधिक तुलना परीक्षण के बाद ANOVA विश्लेषण (घ) के लिए इस्तेमाल किया गया था । प्रत्येक शर्त के लिए n = 5; : p = ०.००१ । त्रुटि पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि इंगित करती हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

Zebrafish एक उपंयास टैंक में एक मजबूत तनाव प्रतिक्रिया एक्ज़िबिट
यहां, हम वयस्क zebrafish में तनाव प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए एक सरल व्यवहार दृष्टिकोण का वर्णन है, और तनाव का एक सरल उपाय के रूप में इस दृष्टिकोण को मांय औषध विज्ञान का उपयोग ।

उपंयास टैंक टेस्ट zebrafish और मछली12,14,21,३५,३६, और zebrafish की अंय प्रजातियों में जंमजात तनाव की जांच के लिए एक व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है परीक्षण के लिए एक शक्तिशाली होना दिखाया गया है चिंता से संबंधित दवाओं के औषधीय प्रभाव की जांच करने के लिए मॉडल । इंसानों की तरह, इन अध्ययनों से साबित हुआ है कि इस तरह के buspirone, निकोटीन, fluoxetine, और scopolamine के रूप में ड्रग्स zebrafish में anxiolytic प्रभाव है12,13,14,३७। इसके अलावा, आमतौर पर मनुष्यों में चिंता का इलाज करने के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं कि scopolamine के रूप में दवाओं अतिरिक्त anxiolytic प्रभाव३७हो सकता है । दवा zebrafish में इन anxiolytic प्रभाव का प्रदर्शन स्क्रीन साइड इफेक्ट और उनके औषधीय तंत्र के अध्ययन की सुविधा कर सकते हैं । इसके अलावा, zebrafish मनुष्यों के लिए एक तुलनीय तनाव प्रतिक्रिया मार्ग है, इसलिए एक दबावकारक दवा उपचार के बाद कोर्टिसोल की रिहाई के परिमाण के साथ परख बांधना व्यवहार प्रतिक्रियाएं14मांय किया जा सकता है । अंत में, हम कहना है कि इस परख zebrafish के लिए विशिष्ट नहीं है इच्छा है, और यह भी मैक्सिकन अंधा cavefish,21 astyanax mexicanusके रूप में अंय मछली प्रजातियों के लिए बढ़ा दिया गया है । यह संभावना है कि परख चिचिल्ड३८को बढ़ाया जा सकता है, मच्छरों३९, killifish४०, और अंय piscine सिस्टम ।

उपंयास टैंक परीक्षण का एक महत्वपूर्ण लाभ अपनी पारिस्थितिकी प्रासंगिकता है; परख के रूप में टैंक के नीचे आधा के लिए जंमजात वरीयता उपायों, प्रतिक्रिया की संभावना है कि एक जंगली में घटित होता है । उपंयास टैंक टेस्ट के अलावा, अंय व्यवहार assays है कि अंय मॉडल जीवों में इस्तेमाल किया गया है और आगे व्यवहार तनाव प्रतिक्रिया, एक खुले मैदान परीक्षण या एक प्रकाश४२४१/ ये assays है एक जानवर के लिए की प्रवृत्ति पर आधारित है अखाड़ा (thigmotaxis) के पक्षों का पालन करें, और अंधेरे में अंवेषण के लिए वरीयता (scototaxis) के बाद एक तनावपूर्ण क्यू४२,४३को उजागर किया जा रहा है । इसके अलावा, बिजली के झटके के लिए या तो जंमजात या वातानुकूलित डर प्रतिक्रियाएं9,४४,४५, उपाय किया गया है, हालांकि इस दृष्टिकोण की पारिस्थितिकी प्रासंगिकता अस्पष्ट है ।

जब एक अपने अध्ययन के लिए एक परख विचार कर रहा है, यह महत्वपूर्ण है के लिए उपभेदों या प्रजातियों के भीतर खाते जंमजात पूर्वाग्रह में ले लो । बनाए रखने और व्यवहार में पर्यावरणीय उतार चढ़ाव को कम करने के अलावा assays हैं, परीक्षण के अनुरूप वयस्कों के आनुवंशिक पृष्ठभूमि रखने महत्वपूर्ण होगा क्योंकि अनुसंधान के भीतर और एक ही जीनोटाइप ४१ के व्यक्तियों के बीच परिवर्तनशीलता दिखाया गया है ,४६. लाभ, नुकसान, एक आम व्यवहार परख की वैधता की एक व्यापक समीक्षा चिंता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया, और आम wildtype लाइनों के भीतर व्यवहार में भी विविधताओं४१पाया जा सकता है ।

Zebrafish तनाव की जांच के लिए एक मॉडल के रूप में
Zebrafish आनुवंशिक और न्यूरोनल रास्ते कि मिलाना सटीक व्यवहार४७,४८, और हाल ही में विकसित मस्तिष्क atlases की जांच करने के लिए एक लोकप्रिय मॉडल होते जा रहे है मानचित्रण परिशुद्धता के साथ व्यवहार को विनियमित ंयूरॉंस के लिए अनुमति४९ ,५०,५१,५२,५३। दृष्टिकोण हम यहां का वर्णन सहज चिंता को मापने के लिए zebrafish में शक्तिशाली आनुवंशिक और तंत्रिका सर्किट उपकरणों का दोहन करने में सक्षम है । दो निकट दृष्टिकोण उत्परिवर्ती लाइनों और ट्रांसजेनिक ड्राइवर लाइनों के बड़े संग्रह पर निर्भर करते हैं । उदाहरण के लिए, उत्परिवर्ती रेखाएं, जांचकर्ताओं को उस भूमिका की जांच करने में सुविधा प्रदान करेगी, जो सटीक जीन में मादाकारी प्रतिबल में होती है । इसके अतिरिक्त, ट्रांसजेनिक Gal4/यूएएस और QF/quas प्रणाली को बड़े पैमाने पर zebrafish५४,५५के लिए लागू किया गया है, और जब यूएएस या quas effector लाइनों को पार कर, सटीक न्यूरोनल सर्किट के समारोह में हेरफेर किया जा सकता है और व्यवहार मूल्यांकन. इन तरीकों एक आनुवंशिक उत्परिवर्ती लाइनों के लिए पूरक प्रदान करते हैं, और कैसे सटीक तंत्रिका सर्किट तनाव में योगदान की जांच की अनुमति ।

तंत्रिका गतिविधि की जांच के लिए उपंयास तकनीक पूरी तरह से इस परख के साथ एकीकृत किया जा सकता है । सी-fos की क्वांटिफिकेशन mrna या प्रोटीन व्यापक रूप से न्यूरोनल गतिविधि५६की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है । यह जीन एक तत्काल प्रारंभिक जीन है, जिसका प्रतिलेखन न्यूरोनल गतिविधि द्वारा सक्रिय है । इसी प्रकार की पद्धति पर आधारित नए दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं । उदाहरण के लिए, extracellular सिग्नल विनियमित काइनेज (erk) हाल ही में zebrafish५०में न्यूरोनल गतिविधि की जांच के लिए विकसित किया गया था । ERK प्रोटीन केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लगभग सभी कोशिकाओं में मौजूद है । न्यूरोनल सक्रियण पर, ERK पेप्टाइड फॉस्फोरीलेटेड हो जाते हैं । इसके अलावा, दोनों संयुक्त राष्ट्र के लिए विश्वसनीय एंटीफास्फोलेटेड ERK (कुल ERK, tERK) और फ़ॉस्फोलेटेड ERK (pERK) विकसित किया गया है और zebrafish में अच्छी तरह से काम करते हैं । इस प्रकार, terk और perk के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ सह-लेबलिंग के द्वारा, न्यूरोनल गतिविधि मज़बूती से मापा जा सकता है । इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, वयस्कों है कि काफी उपंयास टैंक परीक्षण में अधिक नीचे निवास प्रदर्शन रिकॉर्डिंग के बाद हटाया जा सकता है, या तो सी के लिए दाग-fos या tERK/

साथ में, इन दृष्टिकोणों से जेबफिश में तनाव के अंतर्निहित आनुवंशिक और न्यूरोनल तंत्रों के विच्छेदन के लिए एक सुगम दृष्टिकोण की सुविधा होनी चाहिए । इसके अलावा, zebrafish और स्तनधारियों में आनुवंशिक और न्यूरोनल रास्ते के उच्च संरक्षण के कारण, हम इन तरीकों को संरक्षित तनाव व्यवहार अंतर्निहित तंत्र प्रकट की उंमीद है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा या वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम के धन से फ्लोरिडा अटलांटिक विश्वविद्यालय में बृहस्पति जीवन विज्ञान पहल से ERD और ACK को समर्थन किया गया । यह काम भी अनुदान R21NS105071 द्वारा समर्थित था (ACK और ERD को संमानित किया) और R15MH118625 (ERD को संमानित) स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Camera We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.
Infrared filter Edmund Optics
Video Acquisition Program Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.
Infrared LED lights
Assay tank Aquaneering Part number ZT180 Size: M3 1.8 liter
Stand and clamp, or standard tripod for camera
250mL beaker
Tracking software We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology
Buspirone chloride Sigma-Aldrich B7148
Randomized trial generator We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel

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References

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Zebrafish में जंमजात तनाव का अध्ययन करने के लिए व्यवहार दृष्टिकोण
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Chin, J. S. R., Albert, L. T., Loomis, C. L., Keene, A. C., Duboué, E. R. Behavioral Approaches to Studying Innate Stress in Zebrafish. J. Vis. Exp. (147), e59092, doi:10.3791/59092 (2019).More

Chin, J. S. R., Albert, L. T., Loomis, C. L., Keene, A. C., Duboué, E. R. Behavioral Approaches to Studying Innate Stress in Zebrafish. J. Vis. Exp. (147), e59092, doi:10.3791/59092 (2019).

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