Summary
גידולים בשלפוחית השתן מאתר הם המושרה עם גורם מסרטן nitrosamine N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) (BBN). שלפוחית השתן גידול דור הוא. הטרוגניות; לכן, הערכה מדויקת של נטל הגידול יש צורך לפני אקראיות לטיפול ניסיוני. כאן אנו מציגים פרוטוקול MRI מהיר, אמין כדי להעריך את גודל הגידול ועל הבמה.
Abstract
מודלים גידול שלפוחית השתן מאתר הם קריטיים עבור הערכת אפשרויות טיפוליות חדשות. גידולים בשלפוחית השתן המושרה עם מסרטן nitrosamine (BBN) N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) הם יתרון על מודלים מבוססי-קו תא כי הם לשכפל מקרוב את הפרופילים גנומית של גידולים אנושיים, ו, בניגוד מודלים של התא, xenografts, הם מספקים הזדמנות טובה עבור המחקר של immunotherapies. עם זאת, דור גידול שלפוחית השתן היא הטרוגנית; לכן, הערכה מדויקת של נטל הגידול יש צורך לפני אקראיות לטיפול ניסיוני. המתוארים כאן הוא דגם העכבר BBN פרוטוקול כדי להעריך את שלפוחית השתן סרטן גידול הנטל ויוו באמצעות רצף תהודה מגנטית מהירה ואמינה (MR) (נכון FISP). שיטה זו היא פשוטה ואמינה כי, שלא כמו אולטרסאונד, מר אינו תלוי-המפעיל והיא מאפשרת עיבוד תמונה שלאחר רכישה ישירה של סקירה. באמצעות תמונות ההדמיה של שלפוחית השתן, ניתוח של אזורים מעניינים לאורך קיר השלפוחית, הגידול מאפשרים החישוב של קיר השלפוחית ואזור הגידול. מדידה זו עולה בקנה אחד עם ex-vivo שלפוחית השתן משקל (rs= 0.37, p = 0.009), שלב הגידול (p = 0.0003). לסיכום, BBN גידולים הטרוגנית הינם אידיאליים עבור הערכה של immunotherapies ולאחר MRI יכול במהירות ולהעריך באופן אמין נטל הגידול לפני אקראיות לנשק טיפול ניסיוני.
Introduction
סרטן שלפוחית השתן הוא הסרטן השכיח ביותר החמישי. באופן כללי, אחראי כ 80,000 מקרים חדשים 16,000 מקרי מוות בארה ב 20171. לאחר 30 שנה ללא התקדמות משמעותית בטיפול מערכתי של סרטן שלפוחית השתן2, האחרונות מחסום אנטי-PD-1 ו- anti-PD-L1 מעכב ניסויים הראו תגובות מרגשות ועמיד מדי פעם בחולים עם מתקדם urothelial קרצינומה של3,4,5. עם זאת, רק כ-20% מהחולים להציג מענה אובייקטיבי טיפולים אלה, עוד יותר נדרשים מחקרים כדי להרחיב את השימוש היעיל חיסוני בחולים עם סרטן שלפוחית השתן.
מודלים סרטן שלפוחית השתן מאתר הם כלים קריטיים בהערכה פרה של טיפולים חדשניים6,7. על מנת לשלוט על גודל הגידול בעת סידור אקראי של עכברים לטיפולים שונים, נטל הגידול חייב להיות מוערך ומבוקר בין קבוצות הטיפול. מחקרים קודמים השתמשו אולטראסאונד או ביולומינסנציה להעריך orthotopic תא מבוססי-קו שלפוחית השתן סרטן מודלים8,9,10,11. עם זאת, בשתי הטכניקות להציג מספר חסרונות. מדידות אולטרסאונד שיכול להיות מושפע מיומנויות של המפעיל, חוסר רזולוציה מרחבית גבוהה ותכונות תלת מימדי. ביולומינסנציה שיטות רק יכול לספק הערכה כמותית למחצה של תאי הגידול, אינם מאפשרים ויזואליזציה של שלפוחית השתן אנטומיה, מורפולוגיה. יתר על כן, ניתן להשתמש ביולומינסנציה רק עם תא מבוססי-קו דגמים, המבטאים גנים מייצרים אור עכברים שיער או עכברים עם חלוק לבן.
דימות תהודה מגנטית (MRI), מצד שני, מציע גמישות ייחודית על רכישת תמונות אנטומיות ברזולוציה גבוהה, המציגות מגוון רחב של ניגודיות רקמות המאפשרת הדמיה מדויקת והערכה כמותית של נטל הגידול ללא צורך להביע את מאפייני ביולומנאסן. מר תמונות בקלות רבה יותר לשחזור עם הצינורות ניתוח המתאים, מובטח ויזואליזציה תלת-ממדי של שלפוחית השתן. המגבלות הגדולות של MRI הן משך הזמן הדרוש בדיקה, עלויות גבוהות המגבילות מבחני תפוקה גבוהה. עם זאת, מספר מחקרים הראו כי מר רצפים יכול לספק תמונות אבחון באיכות גבוהה יכול לשמש ביעילות לאתר ולפקח על גידולים בשלפוחית השתן מבוססי-קו תא; לפיכך, הם עשויים לשמש תפוקה גבוהה-ניתוח-9,-12.
כאן, אנו מתארים שיטה לא פולשנית המבוססת על מר לאפיין בצורה אמינה ויעילה גידולים המושרה מסרטן שלפוחית השתן בעכברים. כדי לעשות זאת, אנו משתמשים הדמיה מהיר עם מצב יציב נקיפה מר טכניקה (נכון FISP), אשר מבטיח הפעלות סריקה קצרה תוך מתן באיכות גבוהה, רזולוציה מרחבית גבוהה (~ 100 מיקרון) זיהוי, מדידה של שלפוחית השתן גידולים13. יתר על כן, כדי לאשר את הדיוק של זה וזמינותו MRI לא פולשנית, נתאר את המתאם בין פרמטרים נגזר MRI ו- ex-vivo שלפוחית השתן משקל, כמו גם שלב הגידול אישר באופן פתולוגי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת נורת'ווסטרן.
1. אינדוקציה של גידולים עם BBN
- להשיג את זכר C57/BL6 עכברים, כל אחד לפחות בן 6 שבועות.
הערה: עכברים זכרים לפתח סרטן שלפוחית השתן יותר במהירות ובאופן עקבי מאשר עכברים הנשי14,15. - הוסף N-nitrosobutyl(4-hydroxybutyl) אמין (BBN) במינון של 0.05% למים. לשמור אותם בכלי אטום לאוויר, מספקים זה ad libitum כמו שתיית מים עכברים16.
הערה: אחסון הפתרון BBN במיכל נקי תגרע מסרטן ה-17. - להחליף את המים BBN 0.05% פעמיים בשבוע.
- נטר את החיות באמצעות בדיקת סימנים של מצוקה הקשורים גידולים בשלפוחית השתן כולל המטוריה, המשרד שלפוחית השתן וגושים. לבדוק את העכברים פעמיים בשבוע או לפי הנחיות IACUC מקומיים.
- מצפה גידולים לפתח בין 16 ל 24 שבועות של חשיפה18.
2. MRI ההתקנה
- לבצע זריקה תת עורית של מלח סטרילית (0.1-0.2 מ"ל באמצעות מזרק ומחט 1 מ"ל 25 – 27 גרם) 10 דקות לפני MRI כדי להקל על מילוי השלפוחית.
- עזים ומתנגד לכל עכבר עם תערובת גז של 100% או2 ואיזופלוריין (2%-4% לפי הצורך). ודא מטוס נאותה של הרדמה על-ידי בדיקת רפלקס הנסיגה (הבוהן צביטה) לפני שתמשיך. משחת עיניים סטרילי חלות על החיה.
- להעביר את העכבר בעל הדמיה לבוש עם nosecone עבור מסירת בשאיפה איזופלוריין (0.5%-3%).
- לפקח על טמפרטורת הגוף, הנשימה באמצעות בדיקה טמפרטורה רקטלית מחובר למחשב הקלטה פיזיולוגיים.
הערה: טמפרטורת גוף נורמלית (36-37 מעלות צלזיוס) נשמר באמצעות המעגל מים חמים recirculating בנוי לתוך המחזיק מר חיים. הטמפרטורה נמדדת באמצעות חיישן רקטלי, נרשם במחשב פיקוח פיזיולוגיים באמצעות תוכנת מעקב פיזיולוגי ייעודי. באותה המערכת משמש כדי להקליט את האותות נשימה ומערכת רל נמדד באמצעות כרית פנאומטית תחת כלוב הצלעות, באמצעות אלקטרודות רל 3-עופרת. האות הנשימה משמש גם מפעילה רכישת MRI והפחתת חפצים הקשורים להנשמה תנועה.
3. ייבוא תמונות אר. איי
- לנצל את סליל הגוף quadrature עבור עירור.
- במקום סליל מקלט 4 ערוצים על הבטן התחתונה של העכבר מתבצעת סריקה כדי לאפשר זיהוי אופטימיזציה של אותות מן האזור עניין.
- ליזום שינויים אוטומטיים באמצעות התוכנה הדמיה משולבת לרכוש מערכת tri-צירית תמונות של העכבר כל הגוף. הפניה זו סט של תמונות, לזהות את האזור של הריבית (במקרה זה, אזור שלפוחית השתן).
- לרכוש שלושה סטים של תמונות אורתוגונלית פרוסים לאורך המטוסים צירית, הילתית ואת הווריד באמצעות מסגרות התייחסות רדיולוגית.
- לנצל את FISP האמיתית הדמיה ברצף (כלול כאחת התכונות בתוכנת הדמיה משולב) עם מר בפרמטרים הבאים: TR = 900 מילי-שניות, טה = 2 מילי-שניות, הפא = 70, ממוצעים 14.
הערה: קבוצה זו של פרמטרים מאפשר הדמיה מהירה עם איכות אבחון גבוהה, לרבות שקלול T1/T2 ב- < 10 דקות לכל העכבר. - עובי הפרוסה של רזולוציה מרחבית נקבעים לפי פרמטרים גיאומטריים שנבחרו על-ידי המשתמש באמצעות ממשק גרפי של פלטפורמת הדמיה משולב. התוצאה היא סדרה של פרוסות על פני כל שלפוחית השתן של 0.5 מ מ עובי עם פתרון בתוך המטוס של 0.148 מ מ.
4. מר וניתוח תמונות
- לזהות את קבוצת פרוסות בעובי 0.5 מ מ והרזולוציה בתוך המטוס של 0.148 מ מ המכסה כל שלפוחית השתן.
- לייצא תוכנת ניתוח תמונה רפואית על-ידי בחירת התיקיה עם תמונות המתאים בתבנית נתח.
- בחר "מבט צירי נציג" במרכזו של שלפוחית השתן עבור ניתוח כמותי על-ידי גלילה באמצעות הדימויים שנוצר וזיהוי פרוסה אל נקודת האמצע של שלפוחית השתן, המאפשר ויזואליזציה של שלפוחית השתן לקיר, לומן.
הערה: הפרוסה מרכז צריך להיות הנבחרת בקוטר הגדול. - בזהירות ניסחו את האזור של הריבית (ROI) ע י איתור באופן ידני את גבולות סביב הקצה החיצוני של שלפוחית השתן (BLAהחוצה) וליד לומן הפנימי (BLAב) של שלפוחית השתן (ראה דמויות סכמטית והייצוגיות באיור2) בתצוגה ' ' נבחר הנציגה צירית.
- להחסיר לומן הפנימי מהקצה החיצוני כדי לחשב את פני השטח של הקיר שלפוחית השתן.
בלהקיר = בלההחוצה - בלהב
הערה: פני השטח של שלפוחית השתן שליטה עם שום גידול צפוי להיות פחות מזה עם גידול בשלפוחית השתן.
5. המתת חסד, דיסקציה של שלפוחית השתן
- לאחר 20 שבועות של חשיפה BBN, המתת חסד העכברים באמצעות נהלי לפי הנחיות IACUC מקומיים.
- לנקות את האזור. של החתך עם 70% אתנול, ואז אחוז והרם את העור דופן הבטן עם מלקחיים.
- עושים חתך קו האמצע של symphysis הערווה אל הסרעפת.
- בחדות פצעים וחתכים חלל הצפק על ידי האוחז עם מלקחיים אם עם מספריים.
- לזהות שלפוחית השתן, אשר ממוקם בבטן התחתונה קו האמצע.
- לזהות, לחתוך רצועה הטבור החציוני חיבור הכיפה של שלפוחית השתן הטבור דופן הבטן.
- לתפוס את הכיפה של שלפוחית השתן עם מלקחיים כדי לספק countertraction ומנתחים שלפוחית השתן מן המקיפים מבנים, לרבות vesicles הזרע, פי הטבעת, שומן.
- לזהות את ureters הזנת שלפוחית השתן, לגזור עם מספריים קרוב שלפוחית השתן.
- הרמת שלפוחית השתן cephalad, לחתוך את השופכה עם מספריים ולהסיר את שלפוחית השתן.
- מיד שוקלים שלפוחית השתן לאחר שטיפה זה עם PBS.
6. בבדיקה היסטולוגית של רקמה בשלפוחית השתן
- לתקן את הרקמות שלפוחית השתן בפורמלין במאגר נייטרלי 10% עבור 36-48 שעות בטמפרטורת החדר (RT).
- להטביע את הרקמה בבלוקים פרפין, לחתוך את השקופיות לבדיקה עוקבות, מכתים את השקופיות ועם hematoxylin אאוזין לבדיקה מיקרוסקופית כפי שתואר לעיל19,20.
- לבצע בדיקה מיקרוסקופית של שלפוחית השתן העכבר-נמוך (2.5 x ו- 10 x), הגדלה גבוהה (20 x ו- 40 x), בחינה מאקרוסקופית נגעים, היפרפלזיה, קרצינומה בחיי עיר, papillomas, גידולים papillary של neoplasms פולשנית19 , 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
גידולים בשלפוחית השתן באמצעות פרוטוקול המתואר (איור 1), היו המושרה בעכברים זכרים C57/B6. MRI בוצעה ב 16 שבועות, עכברים היו מורדמים ב 20 שבועות. Ex-vivo שלפוחית השתן משקולות (BW) עבור כל עכבר נרשמו. שקופיות, היו מוכתמים hematoxylin ואאוזין ולאחר כל השקופיות היסטולוגיה נבחנו על שלב הגידול.
כדי לנתח את נטל הגידול באמצעות מר, שלפוחית השתן הקיר הפנימי לומן (BLAב) היה המופחת שלפוחית השתן הקיר החיצוני לומן (BLAהחוצה) כדי לחשב את עובי הקיר שלפוחית השתן (BLAקיר) (איור 2). נציגת תמונות מר FISP נכון, שחזורים תלת-ממדי של קיר השלפוחית ותמונות פיפטות של עכבר שליטה (כלומר, אין גידול) מוצגים באיור 3 א-F, ועכבר עם גידול גדול מוצג באיור 3G-L.
הפרמטר MRI-derived בלהקיר להרכב בחולשה שמחוץ BW (rs = 0.37, p = 0.009; איור 4). בדיקת MRI-derived בלהקיר פרמטר ונתונים BW מדגים אסוציאציה עם שלב הגידול (Kruskal-איי ווליס בדיקת MRI p = 0.0003, איור 5A; BW p = 0.0006; איור 5B), כמו גם שיוך כאשר stratifying הפתולוגיה סרטן שלפוחית השתן שריר-פולשני ו סרטן פולשני שריר שלפוחית השתן (מאן-ויטני U בדיקת MRI p = 0.0002, איור 5C; BW p < 0.0001, איור 5D). הביצועים של בלהקיר , BW כדי לקבוע סרטן פולשני שריר שלפוחית השתן מוצג באיור 5E. השטח מתחת העקומה (AUC) בלהקיר (חאן אל = 0.81, 95% CI 0.68-093) דומה מבחינה סטטיסטית חאן אל BW (חאן אל = 0.89, 95% CI 0.80-0.98; p = 0.30).
איור 1: סכימה עבור אינדוקציה גידול שלפוחית השתן עם BBN והתזמון של MRI ו המתת חסד- BBN הוא מנוהל ad libitum -ריכוז של 0.05% במי השתייה. עכברים עוברים MRI בן 16 שבועות. עכברים מורדמים-20 שבועות, שלפוחיות של כל נבדק עם אימונוהיסטוכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: תיאור גרפי סכמטי של שיטה להשיג בלהקיר ותמונה מר נציג עם קווי מתאר המתאים. שימוש בעוצמה של MRI תמונות, הקיר החיצוני של שלפוחית השתן זוהה, חלוקה לרמות צויר בצבע אדום (BLAהחוצה). לומן שלפוחית השתן hyperintense היה המתוארים בירוק (BLAב), האזור המקביל של לומן שלפוחית השתן הושג. חיסור מכמויות שני אלו הניבו הפרמטרקיר בלה, המתאים הדיסק אפור בהיר בתמונה גרפית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: להחליפן בתמונות FISP מר אמיתי, שלפוחית השתן קיר שחזורים תלת-ממד ותמונות פיפטות של עכבר שליטה (כלומר, אין גידול) (A-F) עכבר עם גידול גדול (G-L). (א) מר נציג תמונה של עכבר עם שום גידול. (B) חלוקת שטח הקיר שלפוחית השתן (BLAקיר), במסגרת אדומה, הגדיר האזור בין שלפוחית השתן לומן (BLAב) לבין הקיר החיצוני שלפוחית השתן (BLAהחוצה). (ג) עיבוד תלת-ממדי לקיר שלפוחית השתן של עכבר שליטה, שנוצר על-ידי הגדרת בלהקיר בכל פרוסה דרך שלפוחית השתן. החצים הירוקים ממחישים את השלפוחית על תמונה דו-ממדית לתרגם את עיבוד תלת-ממדי. (ד) עיבוד תלת-ממדי לגזור את בלהקיר של שליטה בעכבר. צריכת חשמל נמוכה (E) (2.5 x) ותמונות (נ) מתח גבוה (10 x) של העכבר באותו שלפוחית השתן. (G) מר נציג תמונה של עכבר עם גידול גדול. (H) חלוקת שטח הקיר שלפוחית השתן (BLAקיר), במסגרת אדומה, הגדיר האזור בין שלפוחית השתן לומן (BLAב) לבין הקיר החיצוני שלפוחית השתן (BLAהחוצה). (I) עיבוד תלת-ממדי של הקיר שלפוחית השתן של עכבר עם גידול גדול. (J) עיבוד תלת-ממדי של קאט-אאוט של שלפוחית השתן של עכבר עם גידול גדול, שנוצר על-ידי הגדרת בלהקיר בכל פרוסה דרך שלפוחית השתן. החצים הירוקים ממחישים את השלפוחית על תמונה דו-ממדית לתרגם את עיבוד תלת-ממדי. צריכת חשמל נמוכה (K) (2.5 x) ותמונות (L) מתח גבוה (10 x) של העכבר באותו שלפוחית השתן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: מתאם ספירמן בין בלה MRI-derivedקיר , שלפוחית השתן הסופי משקל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: השוואות של הבמה פיפטות ו MRI-derived פרמטר בלהקיר בעכברים 47. (א) השוואה של כל שלבי פיפטות ו MRI בלהקיר (מבחן Kruskal-איי ווליס). השוואה (B) של שלבים כל פיפטות ומשקל שלפוחית השתן (מבחן Kruskal-איי ווליס). (ג) השוואה של סרטן שלפוחית השתן שריר-פולשני (שלב ≤T1), סרטן שלפוחית השתן פולשנית שריר (שלב ≥T2) עם MRI בלהקיר (מבחן מאן-ויטני U). (ד) השוואה של סרטן שלפוחית השתן שריר-פולשני (שלב ≤T1), סרטן שלפוחית השתן פולשנית שריר (שלב ≥T2) עם משקל שלפוחית השתן (מבחן מאן-ויטני U). (ה) עקומת ROC של אזור שלפוחית השתן נגזר MRI, שלפוחית השתן הסופי משקל בקביעת סרטן פולשני שריר שלפוחית השתן (שלב ≥T2). ערך p המפורטים ההבדל בין שני AUCs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדמיה מדויקת של מודלים הגידול הוא הכרחי עבור המתאים היערכות מראש המתת חסד, אקראיות בעלי חיים לפני אתחול של טיפול ניסיוני. באמצעות ההליך המובאת כאן, נדגים מתודולוגיה ליצירה (1) גידולים בשלפוחית השתן באמצעות גורם מסרטן את BBN (2) stratify נטל גידול בשלפוחית השתן באמצעות מר מר-derived אזור בקורלציה מדידה (BLAקיר) באופן משמעותי עם ex-vivo שלפוחית השתן משקל והיא קשורה עם שלב הגידול פיפטות.
על ידי אימוץ בגישה הדמיה מהירה עם רכישת קצר פעמים ב רזולוציה מרחבית גבוהה (נכון FISP) ואיכות אבחון גבוהה, אנחנו יכולים לנהל מבחני תפוקה גבוהה של עכברים ביניים שלבי התפתחות גידולים, לפני הטיפול אקראיות. הדו ח שלנו עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים של מר הדמיה של הגידול מבוססי-קו תא שתלים9,12 ומאשרת את הפוטנציאל שלה ככלי כדי למטב את נושא גדול מספר מחקרים סמים.
פרוטוקול זה MRI, זה קריטי תמונה את העכבר עם שלפוחית שתן מלאה כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה ואת ניסחו את ההבדלים בין הגידול ושלפוחית לומן. אנו מוצאים כי הזרקת כל עכבר עם מלח 10 דקות לפני הדמיה מאפשר הדמיה נאותה של שלפוחית השתן. עוד שלבים קריטיים כוללים מפעילה אמין רכישת MRI באמצעות האות הנשימה מזוהה עם כרית פנאומטית למקם תחת כלוב הצלעות עכבר ורכישת מספר פרוסות מר המאפשרת כיסוי של כל שלפוחית השתן.
אפשרויות אחרות עבור הדמיה פיתוח והתקדמות של גידולים בשלפוחית השתן מאתר כוללות אולטרסאונד8 ו ביולומינסנציה10,11. מיקרו-אולטראסאונד הדמיה של מושתל מבת-2 תאים זיהה גידולים בעכברים 15, 13 מהם אומתו בהיסטולוגיה יש גידולים8. אולטרסאונד נפח בקורלציה באופן משמעותי עם נפח סטריאוסקופי של הגידול, אך הגידול משקל, שלב לא היו ובדוקים8. ביולומינסנציה שימש לפקח במדויק שתלים מבוססי-קו גידול התא, אבל זה לא יכול לשמש כדי לפקח מסרטן-induced סרטן ללא משתילים מסרטן-derived גידולים של עכבר אחד למשנהו. היכולת לעקוב במדויק אחר סרטן מסרטן-induced חיוני, כמו מודלים אלה יש כמה יתרונות על פני תא קו הדגמים. מודלים מבוססי-קו תא הומוגניים גנטית ולא נגזרת גידולים יש כבר התחמק immunosurveillance, גידולים מושתל לגדול במהירות מבלי microenvironment דלקתיות כרוניות22. המודל BBN שימש בהצלחה במשך למעלה מ-30 שנה, והוא נותר למודל קריטי להבנת התפתחות סרטן שלפוחית השתן, טיפול23,24,25. יתר על כן, המודל BBN מדגים mutational, ביטוי גנים פרופילים דומה האדם סרטן שלפוחית השתן, תוך שמירה על המערכת החיסונית שלם כדי לאפשר לימוד פוטנציאליים סוכנים immunotherapeutic26,27 .
הזמינות של בעל חיים קטן ייעודי בדיקות Mri כמו משאבים משותפים במוסדות מרובים הופכת טכניקות זה יתרון מעשי עבור מחקר בסיסי והקרנת טיפולים חדשניים. עם זאת, ישנן כמה מגבלות. עכברים היו צילמו רק בשעה אחת timepoint, לא באופן רציף במהלך ההתפתחות של גידולים. עם זאת, על סמך התוצאות הסטטיסטיות שלנו, אנו מציעים כי הערך timepoint יחיד הוא מסוגל באופן מדויק stratify עכברים לקבוצות לפי גודל הגידול שלב, הוא מייצג פרמטר אידיאלי, לא פולשנית למיון ולהקצאה נושאים לקבוצות שונות. הגידול בשלבים רבים נוצרו באמצעות BBN, ועד ת א T4. עם זאת, אלה עשויים להיות מרובדת (כפי שהוצע ב איור 5C-D) כמו שריר פולשנית (T2 או גדול) ושרירים הלא-פולשנית (T1 או פחות), כמו זה תקן ניהול סרטן שלפוחית השתן האנושי28.
מגבלה פוטנציאלי נוסף הוא הפרמטרקיר בלה הופק באמצעות פרוסה אחת דרך כל שלפוחית השתן ופרוסות לא הכל זמין מכסה את זה. קריטריונים אלה נבחרו כדי להפחית את דרישות צינור ניתוח (קרי, הדרישה של ציור ROIs מרובים על פני פרוסות מרובות), נחשבו מספיק עבור assay מהיר, כמותית. ניתוח volumetric מורכבים יותר יכול להתבצע על הנושאים (קרי, מוצג למטרות המחשה באיור3) אבל באופן בלתי נמנע יצריך יותר מאמץ ועלויות. עיבוד אלגוריתמים תמונה אוטומטי יכול לשמש תיחום אוטומטית של אזור שלפוחית השתן; עם זאת, שיטות אלה סובלים השתנות מהותי של שלפוחית השתן צורה וגודל בין עכברים בודדים ודורשים אימות לפני אימוץ אמין מחקר קליני29והבדיקות משמעותית.
הערכה איכותית של נפחי הנתונים מראים כי שיטה זו פרוסה אחת מספיקה עבור סוג זה של וזמינותו. עם זאת, ייתכן כי מבחני מתקדמים יותר עשויים לדרוש שלב עיבוד נתונים נוספים/תמונה. רכישת מנקודת המבט, ישנם מספר סריקות נוספות כי יכול להיות רכשה, אשר עלול להגביר עוד יותר את היכולת לחזות את התקדמות של גידולים תוך חושפני גם שינויים microenvironment הגידול עדין יותר. אלה שיטות נוספות כוללות ניגודיות דינמי משופרת MRI, דיפוזיה משוקלל MRI ו אחרים רצפים30 המאפשרים אפיון מקיף, רב פרמטרית לקיר שלפוחית השתן. עם זאת, שיקול של עלות ויעילות הובילו אותנו להגבלת שלנו assay לזו המתוארת ב פרוטוקול זה.
לסיכום, אנו מתארים את המתודולוגיה עבור T1/T2-משוקלל מהירה הדמיה מר רצפים (FISP נכון) כדי לרכוש תמונות פרוסה רב מכסה את השלפוחית והעכבר כולו. נדגים כי ניתן להשתמש בתמונות אלה כדי לקבוע את היקף הגידול במודל של מבוססי מסרטן של סרטן שלפוחית השתן מאתר. נתוני MRI עולה בקנה אחד עם משקולות רקמה בשלפוחית השתן והיא קשורה עם שלב הגידול. תוצאות אלה תומכים בשימוש זה וזמינותו MRI מהיר ואמין כדי stratify עכברים לפני טיפול ניסיוני אקראיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ג'יי ג'יי מ ממומן על ידי ותיקי בריאות המינהל בזכות להעניק BX0033692-01. ג'יי ג'יי מ נתמך גם על ידי קרן הנסון ג'ון פ לחקר הסרטן באוניברסיטת רוברט ה' לוריא מקיף סרטן מרכז באוניברסיטת נורת'ווסטרן. אנו מודים למרכז הדמיה Translational מתן רכישת MRI ועיבוד. מקורות מימון היה אין תפקיד בכתב של כתב היד או ההחלטה להגיש לפרסום.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 664 | Mice |
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine carcinogen (BBN) | TCI American | B0938 | Carcinogen |
| 0.9% normal saline | Hospira, Inc | NDC 0409-488-02 | |
| Isoflurane | Piramal HealthCare | 60307-120-25 | Anesthetic |
| 7Tesla ClinScan MRI | Bruker | NA | Dedicated Small Animal Imaging MRI |
| Syngo | Siemens | NA | MR Integrated Imaging Software |
| Model 1030 Monitoring & Gating System | Small Animal Instruments, Inc. (SAII) | NA | Small animal physiologic monitoring |
| Formalin, Neutral Buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Fixative |
| Eosin Y | Fisher Scientific | NC1093844 | Histologic staining agent |
| Hematoxylin | Fisher Scientific | 23-245651 | Histologic staining agent |
| Jim7 | Xinapse Systems | NA | Medical image analysis software |
| GraphPad Prism v7.04 | Graphpad | NA | Graphing software |
| R v3.4.2 | The R Project for Statistical Computing | NA | Statistical software |
| R package pROC v1.10.0. | The R Project for Statistical Computing | NA | ROC analysis |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
- Abdollah, F., et al. Incidence, survival and mortality rates of stage-specific bladder cancer in United States: a trend analysis. Cancer Epidemiology. 37 (3), 219-225 (2013).
- Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. The Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
- Sharma, P., et al. Nivolumab monotherapy in recurrent metastatic urothelial carcinoma (CheckMate 032): a multicentre, open-label, two-stage, multi-arm, phase 1/2 trial. The Lancet Oncology. 17 (11), 1590-1598 (2016).
- Bellmunt, J., et al. Pembrolizumab as Second-Line Therapy for Advanced Urothelial Carcinoma. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1015-1026 (2017).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU International. 104 (9), 1286-1291 (2009).
- Zhang, N., Li, D., Shao, J., Wang, X. Animal models for bladder cancer: The model establishment and evaluation (Review). Oncology Letters. 9 (4), 1515-1519 (2015).
- Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75 (4), 799-804 (2010).
- Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. The Journal of Urology. 145 (6), 1297-1301 (1991).
- Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU International. 101 (1), 120-124 (2008).
- Vandeveer, A. J., et al. Systemic Immunotherapy of Non-Muscle Invasive Mouse Bladder Cancer with Avelumab, an Anti-PD-L1 Immune Checkpoint Inhibitor. Cancer Immunology Research. 4 (5), 452-462 (2016).
- Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. Journal of Urology. 170, 1375-1378 (2003).
- Chung, H. W., et al. T2-weighted fast MR imaging with true FISP versus HASTE: comparative efficacy in the evaluation of normal fetal brain maturation. American Journal of Roentgenology. 175 (5), 1375-1380 (2000).
- Miyamoto, H., et al. Promotion of bladder cancer development and progression by androgen receptor signals. Journal of the National Cancer Institute. 99 (7), 558-568 (2007).
- Bertram, J. S., Craig, A. W. Specific induction of bladder cancer in mice by butyl-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine and the effects of hormonal modifications on the sex difference in response. European Journal of Cancer. 8 (6), 587-594 (1972).
- Nagao, M., et al. Mutagenicity of N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine, a bladder carcinogen, and related compounds. Cancer Research. 37, 399-407 (1977).
- Hirose, M., Fukushima, S., Hananouchi, M., Shirai, T., Ogiso, T. Different susceptibilities of the urinary bladder epithelium of animal species to three nitroso compounds. Gan. Gann; The Japanese Journal of Cancer Research. 67 (2), 175-189 (1976).
- Shin, K., et al. Cellular origin of bladder neoplasia and tissue dynamics of its progression to invasive carcinoma. Nature Cell Biology. 16 (5), 469-478 (2014).
- Epstein, J. I. Chapter 17: Immunohistology of the Bladder, Kidney, and Testis. Diagnostic Immunohistochemistry. , Fifth Edition, 624-661 (2019).
- Cohen, S. M., Ohnishi, T., Clark, N. M., He, J., Arnold, L. L. Investigations of rodent urinary bladder carcinogens: collection, processing, and evaluation of urine and bladders. Toxicologic Pathology. 35 (3), 337-347 (2007).
- Wood, D. P. Jr Tumors of the bladder. Campbell-Walsh Urology. 11 (92), 2184-2204 (2016).
- Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nature Reviews Cancer. , (2016).
- Kaneko, S., Li, X. X chromosome protects against bladder cancer in females via a KDM6A-dependent epigenetic mechanism. Science Advances. 4 (6), eaar5598 (2018).
- Smilowitz, H. M., et al. Biodistribution of gold nanoparticles in BBN-induced muscle-invasive bladder cancer in mice. International Journal of Nanomedicine. 12, 7937-7946 (2017).
- Dai, Y. C., et al. The interaction of arsenic and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine on urothelial carcinogenesis in mice. PLoS One. 12 (10), e0186214 (2017).
- Williams, P. D., Lee, J. K., Theodorescu, D. Molecular Credentialing of Rodent Bladder Carcinogenesis Models. Neoplasia. 10 (8), (2008).
- Fantini, D., et al. A Carcinogen-induced mouse model recapitulates the molecular alterations of human muscle invasive bladder cancer. Oncogene. 37 (14), 1911-1925 (2018).
- Network, N. C. C. NCCN Guidelines in Clinical Oncology - Bladder Cancer 5.2018. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/bladder.pdf (2018).
- Costa, M. J., Delingette, H., Novellas, S., Ayache, N. Automatic segmentation of bladder and prostate using coupled 3-D deformable models. Medical Image Computing and Computer-Assisted Intervention. 10 (Pt 1), 252-260 (2007).
- Rosenkrantz, A. B., et al. Utility of quantitative MRI metrics for assessment of stage and grade of urothelial carcinoma of the bladder: preliminary results. American Journal of Roentgenology. 201 (6), 1254-1259 (2013).
