Summary
マウス膀胱腫瘍は N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) ニトロソアミン発がん性物質 (BBN) で誘導されます。膀胱腫瘍の世代は異質です。したがって、ランダム化実験的な治療の前に腫瘍負荷の正確な評価が必要です。腫瘍の大きさおよび段階を評価する高速で信頼性の高い MRI プロトコルをご紹介します。
Abstract
マウス膀胱腫瘍モデルは、新たな治療選択肢の評価のために重要です。N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) ニトロソアミン (BBN) 発癌物質と膀胱腫瘍は細胞ライン ベース モデル上有利な密接に人間の腫瘍の遺伝子プロファイルの複製、細胞モデル、異種移植片とは異なり彼らを提供するため、免疫療法の研究のための良い機会。ただし、膀胱腫瘍の世代は異質です。したがって、ランダム化実験的な治療の前に腫瘍負荷の正確な評価が必要です。ここで説明は BBN マウス モデルと膀胱癌腫瘍負担評価生体内で高速かつ信頼性の高い磁気共鳴 (MR) シーケンス (true FISP) を使用するためのプロトコルです。このメソッドは、シンプルで信頼性の高いので、超音波とは異なり氏はオペレーターに依存して、単純な買収後画像処理とレビュー。腫瘍、膀胱壁に沿って、関心の領域の解析膀胱の軸のイメージを使用すると、膀胱壁と腫瘍領域の計算を可能にします。この測定は前のヴィヴォ膀胱重量と相関 (rs= 0.37、p = 0.009) と腫瘍の段階 (p = 0.0003)。結論としては、BBN は異種腫瘍免疫療法の評価に最適なを生成し、MRI は迅速かつ確実に実験的治療群にランダム化前に腫瘍量を評価します。
Introduction
膀胱癌は 5 番目に多い癌で全体的に、約 80,000 の新規症例と 2017年1にアメリカ合衆国で 16,000 の死の責任があります。膀胱がん2全身治療の著しい進歩なし約 30 年後最近アンチ PD 1 とアンチ PD L1 チェックポイント阻害剤試験は、高度な患者の刺激的で、時折耐久性反応を示しています。尿路上皮癌3,4,5。患者のおよそ 20% を示すこれらの治療に奏効し、さらなる研究は、膀胱癌患者における免疫療法の効果的な利用を拡大する必要が。
マウス膀胱癌モデルは、新しい治療法6、7の前臨床評価に重要なツールです。さまざまな治療法にマウスをランダム化する際、腫瘍サイズの制御するために腫瘍の負担が評価され、治療グループ間制御する必要があります。以前の研究では、同所性同種細胞ライン ベースの膀胱癌モデル8,9,10,11を評価するのに超音波や生物発光を使用しています。しかし、両方の方法は、いくつかの欠点を提示します。超音波測定は、オペレーターのスキルの影響し、三次元機能と高空間分解能不足します。発光方法は腫瘍細胞の半定量的評価を提供できるだけと膀胱解剖学および形態の可視化を可能にしません。さらに、発光はヘアレス マウスや、白いコートを持つマウスの発光遺伝子を発現する細胞ライン ベース モデルでのみ使用できます。
磁気共鳴画像 (MRI) は、他の一方で、幅広い組織コントラストは正確な可視化を可能にすると腫瘍負荷の定量的評価、高解像度の解剖学的画像の取得にユニークな柔軟性を提供します。生物発光の性質を表現することがなく。MR 画像は適切な解析パイプラインをより簡単に再現可能であり、膀胱の 3次元可視化を保証します。MRI の最大の制限は、検討と高コスト高スループット試金を制限するために必要な時間の長さです。しかし、いくつかの研究は、氏シーケンスが効果的に検出およびセル行ベースの膀胱腫瘍を監視するために使用できる高品質な診断画像を提供できることを示しています。したがって、彼らは、ハイスループット分析9,12の使用可能性があります。
ここでは、確実にかつ効率的にマウスで発がん物質による膀胱腫瘍の特性評価に非侵襲的氏ベース手法について述べる。これを達成するために検出と膀胱の測定のため、高品質と高空間分解能 (~ 100 ミクロン) 提供して短いスキャン セッションを保証する定常摂動氏技術 (true FISP) による高速イメージングを使用します。腫瘍13。さらに、この非侵襲性の MRI 測定の精度を確認するため腫瘍の病理組織学的確認の段階と同様、MRI 派生パラメーターおよび前のヴィヴォ膀胱重量との相関関係をについて説明します。
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Protocol
ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ノースウェスタン大学によって承認されています。
1. BBN と共に腫瘍の誘導
- 男性 C57/BL6 マウス、それぞれ少なくとも 6 週齢を取得します。
注: 雄マウスは、迅速かつ一貫して雌マウス14,15より膀胱癌を開発します。 - 飲料水には、0.05% の線量で N-nitrosobutyl(4-hydroxybutyl) アミン (BBN) を追加します。不透明な容器に保管し、マウス16に飲料水として自由を提供すること。
注: 明確なコンテナーに BBN ソリューションを格納すると、発がん性物質17が低下します。 - 週 2 回 0.05 %bbn 水を変更します。
- 固まり、しっかり膀胱、血尿など膀胱腫瘍に関連付けられている苦痛の兆候を調べることによって、動物を監視します。週 2 回またはローカル IACUC ガイドラインに従ってマウスを検査します。
- 露出1816 ~ 24 週の間に腫瘍を期待してください。
2. MRI セットアップ
- 滅菌生理食塩水の皮下注射を行う (0.1 – 0.2 mL 25-27 G 針と 1 mL 注射器を使用して) MRI 膀胱充填を容易にする前に 10 分。
- 100% O2とイソフルラン (2%-4% に応じて) のガス混合物各マウスを麻酔します。続行する前に引っ込め反射 (つま先ピンチ) をテストすることによって麻酔の適切な面を確認します。動物に生殖不能の眼軟膏を適用します。
- 吸入イソフルラン (0.5%-3%) の配信のためノーズが整って画像ホルダーにマウスを転送します。
- 体温と呼吸生理学的記録のコンピューターに接続されている直腸温度プローブを使用して監視します。
注: 正常な体温 (36-37 ° C) は動物氏ホルダーに組み込まれているお湯の循環回路を使用して維持されます。温度は直腸のセンサーを測定し、専用の生理学的な監視ソフトウェアを使用して生理学的モニター コンピューターに記録。同じシステムを使用して、胸郭と 3 誘導心電図電極を介して下に置かれる空気の枕を測定した呼吸、心電図信号を記録します。呼吸信号も MRI で集録をトリガーと呼吸運動に関連付けられている成果物を減らすのために使用されます。
3. MRI 画像の取得
- 励振用直交体コイルを利用します。
- 興味の地域から信号の最適化された検出を有効にするスキャンされているマウスの下腹部に 4 チャンネルの受信コイルを配置します。
- 三軸セット全体のマウス体内の画像を取得する統合イメージング ソフトウェアによって自動的に調整を開始します。この参照から画像のセットを (この場合は膀胱の領域) に関心の領域を識別します。
- 放射線のフレームの参照を使用して軸、冠状および矢状面に沿った直交スライス画像の 3 つのセットを取得します。
- 次の MR パラメーターで true FISP シーケンス (統合イメージング ソフトウェアの機能の 1 つとして含まれている) をイメージングを活用: TR = 900 ミリ秒、TE = 2 ミリ秒、FA = 70、14 平均。
注: このパラメーターのセットにより、良質診断、T1 ・ T2 の重みを含む急速なイメージングのため < マウスあたり 10 分。 - 空間分解能・ スライス厚は、統合された画像処理プラットフォームのグラフィカル インターフェイスを通じてユーザーによって選択された幾何学的なパラメーターによって決定されます。平面内の分解能には 0.148 mm 厚さ 0.5 mm の全体膀胱全体のスライスのシリーズでこの結果します。
4. MR 画像の解析
- 0.5 mm 厚のスライス、面内分解能全体の膀胱をカバー 0.148 mm のセットを識別します。
- 医用画像解析ソフトウェアにエクスポートするには、分析フォーマットの対応する画像のフォルダーを選択します。
- 生成されたイメージをスクロールし、膀胱は、膀胱壁と内腔の可視化では、中間点でスライスを識別する定量分析のため膀胱の中心に「代表的な軸表示」を選択します。
注: 中央のスライスは最大径で選ばれた 1 つをする必要があります。 - (BLAを) 膀胱の外側のエッジと膀胱の内部ルーメン (BLAで) の周囲の境界を手動で追跡することで利益 (率 ROI) の領域を慎重に描く (図 2の回路図と代表的な図参照)選択した代表的な軸のビュー。
- 膀胱壁のサーフェス領域を計算する外側のエッジからの内部ルーメンを減算します。
壁BLA BLAをBLAで=
注: ない腫瘍コントロール膀胱の表面積は、膀胱腫瘍のそれよりも小さいをされる予定です。
5. 安楽死と膀胱の解剖
- BBN 露出の 20 週間後ローカル IACUC ガイドラインに従って標準操作手順を使用してマウスを安楽死させます。
- 70% エタノールで、切開部をきれいし、つかみ、鉗子と腹壁皮膚を持ち上げます。
- 剣状突起に恥骨から正中切開を行います。
- 鋭く鉗子で把持し、ハサミで切開で腹腔内を切開します。
- 正中線の下腹部に位置する膀胱を識別します。
- 特定し、腹壁、臍と膀胱ドームを接続する正中臍靱帯を切ってください。
- 中指を提供、周辺構造、精嚢、直腸、脂肪などから膀胱を解剖し鉗子で膀胱のドームを把握します。
- 尿管が膀胱に入るを識別し、膀胱の近くにハサミでカットします。
- 膀胱を頭の方に持ち上げ、尿道をハサミでカットし、膀胱を削除します。
- すぐに PBS で洗浄後、膀胱の重量を量る。
6. 膀胱組織の病理
- 36-48 時間室温 (RT) で 10% 中性緩衝ホルマリンの膀胱組織を修正します。
- 組織をパラフィン ブロックに埋め込む、その後の検査のためのスライドをカット、ヘマトキシリンとエオシン顕微鏡検査のためのスライドを染色19,20を前述のよう。
- 低マウス膀胱の顕微鏡検査を実行 (2.5 倍と 10 倍) と (20 x、40 x) 高倍率、肉眼病変、過形成、上皮内癌、乳頭腫、乳頭状腫瘍、浸潤性腫瘍19の検証,21。
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Representative Results
記述されているプロトコル (図 1) を使用して、膀胱腫瘍は C57/B6 雄マウスに誘導されました。16 週間で MRI を行いマウスは、20 週間で安楽死されました。前のヴィヴォ膀胱重量 (BW) それぞれについてマウスを記録しました。ヘマトキシリンとエオシン、スライド染色や腫瘍の段階のすべての組織スライドをレビューしました。
膀胱壁 (BLA壁) の厚さを計算する外部ルーメン (BLAを) の膀胱壁から減算された膀胱壁の内部ルーメン (BLAで) 氏を使用して腫瘍負荷を分析する (図 2)。代表的な true FISP MR 画像、膀胱壁の 3次元再構成、およびコントロール マウス (すなわち、ないの腫瘍) の病理画像は、図 3-LのF、および大きい腫瘍を持つマウスが表示されます図 3A- に表示されます。
MRI 派生パラメーター BLAの壁は前のヴィヴォBW と弱い相関 (rs = 0.37、p = 0.009;図 4)。MRI から派生した BLA壁パラメーターと BW のデータの検討の腫瘍の段階との関連付けを示します (クラスカル-ウォリス テスト MRI p = 0.0003、図 5 a;BW p = 0.0006;図 5 b)、筋層浸潤性膀胱癌と浸潤性膀胱癌の病理を層化との関連だけでなく、(マン-ホイットニーの U 検定テスト MRI p = 0.0002、図 5;BW p < 0.0001、図 5)。図 5 eに BLAの壁や筋層浸潤性膀胱癌は、BW のパフォーマンスを示します。BLA の壁(AUC) 曲線下面積 (AUC = 0.81、95% CI 0.68 093) 統計的に BW の AUC のよう (AUC = 0.89、95% CI 0.80 0.98; p = 0.30)。
図 1: スキーマ、BBN で膀胱腫瘍の誘導および MRI と安楽死のタイミング。BBN は、飲料水では 0.05% の濃度で投与された自由です。マウスは、16 週間で MRI を受けます。マウスは 20 週で安楽死させて、それぞれのぼうこうは免疫組織化学によって検査されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: BLA壁と対応するアウトラインと代表的な画像を取得する手法のスケマティックをグラフィカルに表示します。MRI 画像の強度を使用して、膀胱の外側の壁が識別され、アウトライン (BLAを) 赤で描かれました。このように膀胱内腔 (BLAで)、緑色で説明した、対応する膀胱内腔領域を得た。これらの 2 つの数量の差をもたらした BLA壁パラメーターは、グラフィカルなイメージで光の灰色のディスクに対応します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 代表的な true FISP MR 画像、膀胱壁の 3次元再構成、およびコントロール マウス (すなわち、ないの腫瘍) の病理画像 (A ~ F) と大きな腫瘍 (G-L) を有するマウス。(A)代表 MR 画像腫瘍を持たないマウス。(B)赤で囲まれた膀胱壁領域 (BLA壁) の分割 (BLAを) 外側膀胱壁、膀胱腔内 (BLAで) の間の領域として定義されます。(C) BLA壁膀胱を介してすべてのスライスを定義することによって生成されたコントロール マウスから膀胱壁の 3-D レンダリング。緑の矢印は、3-D レンダリングに変換 2 D 画像で膀胱を示しています。(D)制御マウスから BLA壁のカットアウトの 3-D レンダリング。(E)低消費電力 (2.5 倍) と同じマウス膀胱の(F)高出力 (10 x) イメージ。(G)代表者 MR 画像大きい腫瘍を持つマウス。(H)赤で囲まれた膀胱壁領域 (BLA壁) の分割 (BLAを) 外側膀胱壁、膀胱腔内 (BLAで) の間の領域として定義されます。(I) 3-D レンダリング大きな腫瘍を持つマウスの膀胱壁の。(J) BLA壁膀胱を介してすべてのスライスを定義することによって生成される、大きな腫瘍を持つマウスの膀胱のカットアウトの 3-D レンダリング。緑の矢印は、3-D レンダリングに変換 2 D 画像で膀胱を示しています。(K)低消費電力 (2.5 倍) と同じマウス膀胱の(L)高出力 (10 x) イメージ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: MRI 派生 BLA壁と最終的な膀胱重量のスピアマン相関します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 比較病理病期と MRI 派生パラメーター 47 マウスの BLAの壁。(A)すべての病理学的段階と MRI BLA壁(クラスカル-ウォリス検定) との比較。(B)すべての胃壁と膀胱重量 (クラスカル-ウォリス検定) の比較。(C)非筋層浸潤性膀胱癌 (ステージ ≤T1) と筋層浸潤性膀胱癌 (ステージ ≥T2) MRI BLA壁(マン ・ ホイットニーの U 検定) との比較。(D)非筋層浸潤性膀胱癌 (ステージ ≤T1) と筋層浸潤性膀胱癌 (ステージ ≥T2) 膀胱重量 (マン ・ ホイットニーの U 検定) との比較。(E) MRI 由来の膀胱の領域と筋層浸潤性膀胱癌 (ステージ ≥T2) を決定する最終的な膀胱重量の ROC 曲線。上場の p 値は、2 つの Auc の差です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
腫瘍モデルの正確な画像は、適切な事前の安楽死のステージングと実験的な治療の開始前に動物のランダム化に必要です。ここに示す手順を使用して、(1) BBN 発癌物質を用いた膀胱腫瘍を生成し、(2) 膀胱腫瘍の負担大幅に氏 MR 派生領域測定 (BLA壁) 相関を使用して階層化する方法を紹介します。膀胱重量前のヴィヴォ、病理学的腫瘍の段階と関連付けられる。
高空間分解能 (true FISP) と質の高い診断に短いアクイジション時間で急速なイメージングのアプローチを採用し、ランダム化治療前の腫瘍の開発の中間段階でマウスの高スループット試金を実施できます。当社の報告書は事前報告と一致して氏腫瘍行ベースのイメージング9,12をインプラントし、大きな教科番号薬物を最適化するためのツールとしてその可能性を確認します。
この MRI プロトコルの完全な膀胱腫瘍、膀胱内腔間の相違点を記述し、高品質の画像を取得するマウスをイメージするが重要です。我々 を見つけることで膀胱の十分なイメージングは、イメージングの前に生理食塩水 10 分をそれぞれのマウスに注射します。さらに信頼性の高いトリガー マウス胸郭・取得氏スライス全体の膀胱の適用範囲を可能にする十分な数の下に置かれる空気圧枕で検出された呼吸信号を用いた MRI 獲得の重要なステップが含まれます。
イメージングの開発とマウス膀胱腫瘍の進行のための他のオプションには、超音波8と発光10,11が含まれます。注入された MBT 2 細胞のマイクロ超音波断層像は、15 マウス、うち 13 腫瘍8を持っていることを確認した組織学的に腫瘍を検出しました。立体腫瘍量と有意に相関した超音波ボリュームなかった腫瘍重量と段階調査8。生物発光は、細胞ライン ベースの腫瘍インプラントを正確に監視に使用されていますが、別に 1 つのマウスからの発癌物質由来の腫瘍を移植せずに癌の化学発癌剤誘発を監視には使用できません。これらのモデル細胞ラインのモデルに比べていくつかの利点がありますので、化学発癌剤誘発癌を正確に監視する機能は重要です。セル行ベース モデルは、遺伝的均質と、食餌を避けた既に腫瘍由来および埋め込まれた腫瘍は慢性炎症性微小環境22せず急速に成長します。BBN のモデルは 30 年以上にわたって正常に使用されています、それは膀胱癌の開発と治療23,24,25の理解のための重要なモデルのまま。さらに、BBN モデルを示して変異と遺伝子発現プロファイルと同様に人間の膀胱癌の潜在的な免疫療法剤26,27 の研究を許可するそのままの免疫システムを維持しながら.
複数機関で共有リソースとして専用小動物の Mri の可用性有利と基礎研究と新規薬剤のスクリーニングのための実用的このテクニックになります。ただし、いくつかの制限があります。腫瘍の開発の間に継続的に 1 つの timepoint はマウスをイメージしました。しかし、私達単一 timepoint 値は正確に腫瘍の大きさとステージのグループにマウスを層別化するため表し分類してグループごとに科目を割り当てるのための理想的な非侵襲的パラメーターを提案する私たちの統計の結果に基づき。複数の腫瘍の段階は、BBN、Ta から T4 に至るまでを使用して生成されました。ただし、これらは層化が (図 5-Dの提案)、筋層浸潤性 (T2 以上) と非筋肉侵襲 (T1 以下)、これはひと膀胱癌28標準管理。
もう一つの潜在的な制限は、BLA壁パラメーターがそれぞれ膀胱を介して単一のスライスとそれをカバーできないすべてのスライスを使用して派生したことです。これらの条件は解析パイプラインの必要条件 (すなわち、複数のスライスに複数 roi 結合相関の描画の要件) を減らすために選ばれ、高速で定量アッセイのために十分と判断されました。主題のより複雑な容積測定分析を行うことができる (すなわち、図 3に例示目的のため示されている)、ことより多くの努力と費用に必然的にしないが必要があります。膀胱領域の自動描写の自動画像処理アルゴリズムを使用できます。ただし、これらのメソッドは、膀胱の形状と個体の間でサイズの本質的な変動に苦しむし、重要なテストと臨床研究29で信頼性の高い導入前検証を必要とします。
ボリューム データの定性的な評価は、この 1 つのスライス法はこのタイプの試金のための十分なをお勧めします。しかしより高度な試金がこの追加データ/画像処理手順を必要があります不可能です。獲得の観点からは、いくつか追加のスキャン、買収される可能性ももっと微妙な腫瘍微小環境の変化を明らかにしながら腫瘍の進行を予測する能力をさらに高めることができます。これらの追加のテクニックは、ダイナミック造影 MRI、拡散強調 mri 画像と膀胱壁の包括的な多パラメトリック解析を有効にする他のシーケンス30に含まれます。ただし、コストと効率の考察はこのプロトコルで記述されている 1 つの我々 の分析を制限する私たちを導いた。
結論として、T1 ・ T2 強調高速イメージング氏シーケンス (true FISP) 全体のマウス膀胱を覆うマルチ スライス画像を取得するための方法論について述べる。マウス膀胱癌の発癌物質ベースのモデルで腫瘍の範囲を決定するこれらのイメージを使用できることを示す.MRI データは膀胱組織重量と相関、腫瘍の段階と関連付けられる。これらの結果は、実験的な治療のランダム化前にマウスを層別化するためにはこの高速かつ信頼性の高い MRI のアッセイの使用をサポートします。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
J. j. m. は、退役軍人の健康管理のメリットによって資金を供給 BX0033692-01 を付与します。J. j. m. もロバート H. Lurie 包括的がんセンターの北西大学癌研究のためのジョン p. ハンソン財団によってサポートされています。MRI の買収を提供し、処理のトランスレーショナル イメージングを中心を感謝いたします。資金源は、原稿や文書の提出する決定の書面では役割をなかった。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 664 | Mice |
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine carcinogen (BBN) | TCI American | B0938 | Carcinogen |
| 0.9% normal saline | Hospira, Inc | NDC 0409-488-02 | |
| Isoflurane | Piramal HealthCare | 60307-120-25 | Anesthetic |
| 7Tesla ClinScan MRI | Bruker | NA | Dedicated Small Animal Imaging MRI |
| Syngo | Siemens | NA | MR Integrated Imaging Software |
| Model 1030 Monitoring & Gating System | Small Animal Instruments, Inc. (SAII) | NA | Small animal physiologic monitoring |
| Formalin, Neutral Buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Fixative |
| Eosin Y | Fisher Scientific | NC1093844 | Histologic staining agent |
| Hematoxylin | Fisher Scientific | 23-245651 | Histologic staining agent |
| Jim7 | Xinapse Systems | NA | Medical image analysis software |
| GraphPad Prism v7.04 | Graphpad | NA | Graphing software |
| R v3.4.2 | The R Project for Statistical Computing | NA | Statistical software |
| R package pROC v1.10.0. | The R Project for Statistical Computing | NA | ROC analysis |
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