Summary
Aquí, presentamos un protocolo para inducir y puntuar enfermedades en un modelo xenogénico de enfermedad de injerto contra huésped (xenoGVHD). xenoGVHD proporciona un modelo in vivo para estudiar la inmunosupresión de células T humanas. Además, describimos cómo detectar células T humanas en tejidos con PCR digital como herramienta para cuantificar la inmunosupresión.
Abstract
La enfermedad aguda de injerto contra huésped (EICH) es una limitación significativa para los pacientes que reciben trasplante de células madre hematopoyéticas como terapia para deficiencias hematológicas y neoplasias malignas. La EICH aguda ocurre cuando los células T del donante reconocen los tejidos huésped como un antígeno extraño y montan una respuesta inmune al huésped. Los tratamientos actuales implican medicamentos inmunosupresores tóxicos que hacen que los pacientes sean susceptibles a la infección y la recurrencia. Por lo tanto, hay investigaciones en curso para proporcionar una terapia aguda de la EICH que puede apuntar eficazmente a las células T del donante y reducir los efectos secundarios. Gran parte de este trabajo preclínico utiliza el modelo murino génico GVHD (xenoGVHD) que permite la prueba de terapias inmunosupresoras en células humanas en lugar de células murinas en un sistema in vivo. Este protocolo describe cómo inducir xenoGVHD y cómo cegar y estandarizar la puntuación clínica para garantizar resultados consistentes. Además, este protocolo describe cómo utilizar la PCR digital para detectar células T humanas en tejidos de ratón, que posteriormente se pueden utilizar para cuantificar la eficacia de las terapias probadas. El modelo xenoGVHD no sólo proporciona un modelo para probar las terapias de la EICH, sino cualquier terapia que pueda suprimir las células T humanas, que luego podrían aplicarse a muchas enfermedades inflamatorias.
Introduction
El trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (HSCT) se ha convertido en tratamiento de rutina para pacientes que sufren de neoplasias malignas hematológicas como leucemia con mal pronóstico. Una complicación significativa del THCt es la enfermedad aguda de injerto contra huésped (EICH). Un estudio de 2012 informó que la EICH aguda se desarrolló en el 39% de los pacientes con HSCT que recibieron trasplantes de donantes hermanos y el 59% de los pacientes que recibieron trasplantes de donantes no relacionados1. La EICH aguda ocurre cuando las células T derivadas del donante atacan los órganos del receptor. La única terapia exitosa para la EICH esel tratamiento con fármacos altamente inmunosupresores 2, que son altamente tóxicos y aumentan el riesgo de infección y recurrencia tumoral. Así, a pesar de las mejoras que se han realizado en la supervivencia aguda de la EICH en los últimos años3,4,5, todavía existe una necesidad crítica de terapias mejoradas de la EICH con toxicidad mínima que promuevan la remisión a largo plazo.
El objetivo general de los siguientes métodos es inducir y puntuar la EICH xenogénica (xenoGVHD). El modelo xenoGVHD fue desarrollado como una herramienta para inducir la EICH aguda con células humanas enlugar de células murinas que permiten una traducción más directa de la investigación preclínica de la EICH a los ensayos clínicos 6. Este modelo consiste en inyectar por vía intravenosa células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) en ratones NOD-SCID IL-2R-null (NSG) que se irradian subletalmente. Las células T humanas inyectadas son activadas por células que presentan antígeno humano (ACC) que presentan antígeno murno y las células T activadas migran a tejidos distantes resultando en inflamación sistémica y, en última instancia, muerte6,7, 8 , 9 , 10. La patología y progresión de la enfermedad en el modelo xenoGVHD imitan de cerca la EICH aguda humana. Específicamente, las células T humanas patógenas son reactivas a las principales proteínas del complejo de histocompatibilidad murina (MHC), que es similar a la aleactividad de las células T en la EICH6humana,9. La principal ventaja del modelo xenoGVHD sobre el modelo MHC-desajuste del ratón, el otro modelo GVHD ampliamente utilizado, es que permite la prueba de terapias en células humanas en lugar de células murinas. Esto permite probar productos que se pueden traducir directamente a la clínica sin ninguna modificación porque están hechos para apuntar a las células humanas. Recientemente, este modelo se ha utilizado para probar un anticuerpo humano anti-IL-211,células T reguladoras timmicas humanas (Tregs)12 y células madre mesenquimales humanas13 como tratamientos potenciales para la EICH aguda. En un contexto más amplio, este modelo se puede utilizar como un ensayo de supresión in vivo para cualquier droga o tipo de célula que pueda suprimir la actividad de las células T humanas. Por ejemplo,14 utilizaron el modelo xenoGVHD para estudiar el efecto del bloqueo de la integrina -V-8 en la actividad supresora de Treg in vivo. Por lo tanto, el modelo xenoGVHD puede proporcionar información sobre el mecanismo de cualquier terapia dirigida a los células T en un entorno in vivo.
Un método adicional descrito en este protocolo es cómo detectar células T humanas en tejidos de ratón utilizando reacción en cadena de polimerasa digital (dPCR). El objetivo de este método es ofrecer una herramienta para cuantificar la migración y proliferación de células T en los tejidos diana, que miden la eficacia de las terapias inmunosupresoras que se están probando en este modelo. dPCR es un método relativamente novedoso para la cuantificación de ácidos nucleicos15. Brevemente, la mezcla de reacción PCR se divide en particiones que contienen pequeños números de la secuencia de destino o ningún objetivo en absoluto. La secuencia de destino se amplifica y se detecta mediante colorantes intercaladores de ADN o sondas fluorescentes específicas del objetivo. dPCR cuantifica el número de copias de la secuencia de destino en función de la fracción de particiones positivas y las estadísticas de Poisson15,16. La detección de células T con dPCR requiere mucho menos tejido en comparación con otros métodos alternativos, como la citometría de flujo y la histología, y se puede realizar en tejido congelado o fijo. dPCR no requiere una curva estándar para determinar los números de copia, ni se requieren réplicas técnicas. Esto reduce la cantidad de ADN de reactivo y plantilla necesario para dPCR en comparación con el PCR cuantitativo tradicional (qPCR)16. La partición de la reacción pcR en subreacciones en dPCR concentra eficazmente los objetivos17. Por lo tanto, dPCR es principalmente una herramienta para la detección de objetivos raros en una gran cantidad de ADN no objetivo. Por ejemplo, el dPCR se utiliza para detectar la contaminación bacteriana en la leche18,identificar mutaciones raras en el gen del receptor de estrógeno19y detectar adn tumoral circulante en la sangre de los pacientes20. En este protocolo, dPCR sirve como una herramienta eficiente para detectar y cuantificar células T humanas en tejidos de ratones con xenoGVHD.
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Protocol
Todos los experimentos con ratones se realizaron de conformidad y con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Kansas Medical Center. Todas las muestras de sangre humana sana fueron obtenidas bajo consentimiento informado y con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico de la Universidad de Kansas.
1. Irradiación de ratones NSG
- Un día antes de la inyección de PBMC, irradiar ratones NSG de 8 a 12 semanas (se pueden utilizar ambos sexos). En un gabinete de bioseguridad estéril, coloque ratones en una jaula de pastel esterilizado o microisolator. Irradiar ratones en una fuente Cs137 o un pequeño irradiador animal (por ejemplo, RS 2000) con una dosis total de 150 cGy con rotación lenta para asegurar una irradiación uniforme.
- Coloque ratones en jaulas limpias en un gabinete de bioseguridad estéril.
2. Preparación de PBMC humano para inyección
- Recoger suficiente sangre humana sana para aislar 1.1 x 107 PBMC por ratón. Diluir la sangre heparinizada en un volumen igual de 2% de suero bovino fetal (FBS) en solución salina tamponada de fosfato (PBS).
NOTA: Con este protocolo, el rendimiento de PMBC es generalmente 0.5–1 x 107 por 10 mL de sangre entera. Cada ratón recibirá 107 PBMC en 100 s de PBS. El extra de 1 x 106 en 10 l por ratón garantiza que cada ratón reciba la dosis completa de PBMC, en caso de que haya algún problema con el llenado de jeringas. - Añadir 15 ml de densidad de separación de linfocitos medio gradiente (por ejemplo, Ficoll) a un tubo cónico de 50 ml y luego superponer cuidadosamente hasta 25 ml de sangre diluida en la parte superior del gradiente de densidad. Centrifugar el tubo que contiene el gradiente de densidad y la sangre diluida a 400 x g durante 40 min a temperatura ambiente sin freno.
- Cosecha la interfaz PBMC en 10 mL de PBS en un tubo cónico de 50 ml. Centrifugar las células a 400 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante.
- Afloje el pellet moviendo el tubo y resuspenda en 10 ml de PBS para lavar el PBMC. Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min.
- (Opcional) Deseche los glóbulos rojos sobrenadant es y la lyse en el pellet celular agregando un volumen de tampón de lisis de amonio-cloruro-potasio (ACK) que sea igual al volumen del pellet. Resuspenda suavemente el pellet y gire el tubo durante 30–60 s. Llene el tubo con medios RPMI libres de suero y centrifugar el tubo a 400 x g durante 5 min.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 5 ml de PBS. Cuente las células usando la exclusión azul de trypan con un hemocitómetro y un microscopio.
- Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células a 1 x 108 células/ml en PBS.
3. Inyección retro-orbital de PBMC humano en ratones21
- Coloque una cámara de anestesia en una campana de flujo laminar para mantener la esterilidad. Precargue la cámara de anestesia con 5% de isoflurano y 1 L/min de caudal de oxígeno durante 5 min.
- Reduzca el isoflurano al 2% y coloque ratones de la misma jaula en la cámara de anestesia. Una vez que los ratones pierden la enderezación, anestesian a los ratones durante 5 minutos en la cámara. Durante este tiempo, rellene previamente la jeringa con 100 l (1 x 107 células) de suspensión celular.
- Coloque el ratón sobre una almohadilla de calentamiento con la nariz en un cono nasal para mantener la anestesia. Compruebe la pérdida de conciencia pellizcando una almohadilla para los pies y comprobando si hay falta de reflejo.
- Sujeta el ratón con el pulgar y el dedo medio. Inserte la aguja de 28 G 1/2 en la aguja con el bisel hacia abajo lateralmente hasta el canthus medial, a través de la membrana conjuntival hasta que se alcance la parte posterior del ojo. Retraiga ligeramente la aguja e inyecte lentamente 100 ml de células (1 x 107 células).
- Retraiga completamente la aguja y deseche correctamente la jeringa y la aguja. Cierre el párpado y aplique una presión leve en el lugar de la inyección con una esponja de gasa.
- Examine el lugar de inyección en busca de hinchazón u otro trauma visible. Permita que el ratón recupere la conciencia en una jaula estéril forrada con toallas de papel para evitar la aspiración de ropa de cama antes de mudarse a la jaula de casa. Después de que se haya detenido cualquier sangrado, aplique una sola gota de proparacaína en el ojo para la analgesia.
NOTA: La inyección de vena de cola es un método alternativo de inyección intravenosa de PBMC para este protocolo descrito por Macholz y otros22.
4. Puntuación clínica de la EICH aguda en ratones (Figura 1)23
- Mida la puntuación de la EICH cada dos días hasta que los ratones alcancen una puntuación de un 2 y luego todos los días hasta el día del sacrificio.
- Coloque la jaula en una campana de flujo laminar, retire la comida y el agua y vuelva a colocar la tapa. Puntuar la actividad mediante la observación de ratones durante 5 minutos y asignar puntuaciones de la siguiente manera: 0 - ratón comienza a caminar en un par de minutos y sigue caminando alrededor de la jaula, 1 - ratón toma un par de minutos para levantarse y camina lentamente alrededor de la jaula, 2 o ratón no se levanta en 5 minutos y sólo camina cuando se toca.
- Pesar cada ratón en un vaso de vidrio y dar una puntuación de pérdida de peso: 0 á <10% de cambio, 1 x 10–25% de cambio y 2 s >25% de cambio.
- Mientras el ratón todavía está en el vaso de precipitados, inspeccione la postura: 0 o normal, 1 o encorvado en reposo, 2o encorvado afecta el movimiento; texturade piel: 0o normal, 1o ruffling leve a moderado, 2o ruffling severo, y la integridad de la piel: 0o normal, 1o de escala de patas/cola, 2 áreas obvias de piel denuded (mira las orejas, la cola y las patas para escalar).
- Con cinco categorías y una puntuación de 0-2 para cada categoría, un ratón puede alcanzar una puntuación máxima de 10. Cuando un ratón alcanza una puntuación de 7 o más o alcanza los 42 días después de la inyección, eutanasia ratón a través de la eutanasia CO2 u otro método aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales local.
NOTA: Para garantizar la precisión de los resultados, la puntuación es realizada por un investigador que está cegado a los grupos de tratamiento24. Además, aunque >20% de la pérdida de peso corporal es el punto final humano recomendado para muchos protocolos IACUC, con la justificación adicional se puede obtener la aprobación IACUC de este protocolo.
5. Recolección de tejidos para ADN genómico de ratones eutanasiados y ADN genómico aislante
- Diseccionar ratones usando herramientas quirúrgicas estériles. Corte un pequeño trozo de tejido de aproximadamente 3 mm x 0,5 mm de tamaño de un órgano de interés, por ejemplo, pulmón, hígado o bazo. Pesar la muestra de tejido y colocar la pieza de tejido en un tubo estéril de 1,5 ml. Si recoge múltiples tejidos, lave las herramientas con etanol entre el corte de cada órgano.
- Congele los tejidos sumergiendo los tubos que contienen el tejido en nitrógeno líquido hasta que deje de burbujear y almacenarlos en -80 oC durante la noche. Descongelar las muestras de tejido y lijarlas de acuerdo con un kit de aislamiento de ADN genómico (ADN)
- Aísle el ADN genómico de acuerdo con las instrucciones del fabricante como se describe en el kit. Asegúrese de tener en cuenta la cantidad de tejido que se procesó por microlitro de ADN inteligente eludado (mg/L).
NOTA: Los tejidos congelados se pueden almacenar a -80 oC para su procesamiento en un momento posterior.
6. Cuantificación de células T humanas utilizando PCR digital (Figura2)
- Preparar las reacciones de PCR digitales de acuerdo con el protocolo para los dedos de unión de ADN para la máquina PCR digital que se está utilizando. Utilice las siguientes imprimaciones específicas para el ADN genómico humano de épsilon CD3 (secuencia de referencia NCBI: NG_007383.1); Primer delantero: AGGCTGCCTTAACTCCCAAG, Primer Inverso: GCCCTACCAGCTGTGGAAAC. Estos imprimadores producirán una sola banda de 105 bp.
NOTA: Añadir 0,5 l de una enzima de restricción, como HindIII, a cada reacción para digerir el ADN genómico. Asegúrese de probar diferentes diluciones de ADNr para optimizar la separación de gotas positivas y negativas. Además, un subconjunto de células T infiltrantes puede ser células T reguladoras no patógenas. Estas células se pueden cuantificar usando imprimadores adicionales para marcadores de células T reguladores. - Llevar a cabo la reacción de PCR digital en las siguientes condiciones: Tapa a 105 oC, 95 oC durante 10 min (1 ciclo); 95 oC para 30 s, rampa de 2 oC/s y 55 oC durante 1 min, rampa 2 oC/s (40 ciclos); 72 oC durante 10 min, 12 oC de retención.
NOTA: Es posible que estos parámetros deba ajustarse en función del equipo PCR digital. - Adquiera datos de PCR digitales con software de análisis. Reporte los datos como números de copias por mg de tejido utilizando la siguiente ecuación: (número de copias/L) x (L de ADNG en reacción) x (factor de dilución)/(mg de tejido/L de ADNr total)
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Representative Results
Los ratones NSG de 8-12 semanas de edad de ambos sexos que recibieron PBMC humano comenzaron a mostrar signos clínicos de EICH alrededor del día 10 después de la inyección en comparación con los ratones de control negativo que recibieron PBS solamente (Figura1A). Los ratones XenoGVHD tuvieron una mediana de supervivencia de 23,5 días (Figura1B). Con pcR digital, se podrían detectar células T humanas positivas de CD3 epsilon en las muestras pulmonares e hepáticas de ratones que recibieron PBMC humano. Se utilizaron muestras de tejido de ratones inyectados con PBS como controles (Figura 2).
Figura 1: Progresión de la enfermedad de la EICH. Los ratones NSG masculinos y femeninos de 8-12 semanas de edad de edad fueron inyectados retroorbitalmente con 1 x 107 PBMC humano (n x 6) o PBS (n x 4) como un control negativo. Los datos mostrados son los resultados combinados de tres experimentos independientes. (A) la puntuación de la EICH se midió cada dos días hasta que los ratones alcanzaron una puntuación de un 2 y luego todos los días hasta el día de sacrificio. Los datos reportados en cada momento para la puntuación de la EICH son la puntuación media de los ratones vivos combinada con las últimas puntuaciones de los ratones fallecidos en cada grupo. * p < 0.05 según lo determinado por la prueba Mann Whitney U. (B) Curva Kaplan-Meier de supervivencia. La muerte se marcó cuando la puntuación de la EICH fue de 7. * p < 0.05 según lo determinado por la prueba de rango de registro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Detección de células T humanas mediante PCR digital. Se recogieron muestras de pulmón e hígado de ratones que fueron inyectados retro-orbitalmente con PBS (n.o 3) o 1 x 107 PBMC humano (n x 3) cuando los ratones alcanzaron una puntuación de la EICH de 7 o 42 días después de la inyección. Se recopilaron datos de 3 experimentos independientes. gDNA fue aislado y PCR digital se utilizó para determinar las copias de cd3 epsilon humano por miligramo de tejido. (A) Gráfica PCR digital representativa de muestras pulmonares y hepáticas de un ratón inyectado con PBS o PBMC. (B) Cuantificación de copias de epsilon CD3 humano por millgrama de tejido de ratones inyectados con PBS o PBMC. * p a 0,05 según lo determinado por la prueba Mann Whitney U. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La progresión de la enfermedad es generalmente consistente en el modelo xenoGVHD, incluso con la inyección de PBMC de diferentes donantes, por lo que se pueden combinar múltiples experimentos. Los pasos clave necesarios para mantener esta consistencia son la técnica de inyección i.v. adecuada, cegadora y puntuación consistente. Un estudio realizado por Nervi et al.25 demostró que en comparación con la inyección intravenosa de vena de cola, las inyecciones retro-orbitales de PBMC dieron lugar a un injerto más consistente y una EICH más grave. 26 también demostraron que las inyecciones retro-orbitales resultaron en un injerto de células madre hematopoyéticas más consistente en ratones en comparación con la inyección de vena de cola. Sin embargo, si es necesario, las inyecciones de venas de cola se pueden utilizar como método alternativo en el xenoGVHD modelo27,28,29.
El problema de la variabilidad de los resultados asociados con las inyecciones de venas de cola se puede reducir aumentando el número de sujetos. Además, es importante que la persona que punda los ratones esté cegada al tratamiento con el ratón para evitar sesgos en la puntuación de criterios más subjetivos como la actividad o la textura del pelaje. La importancia de la puntuación gofadora GVHD también se ha demostrado en la clínica24. La persona que inyecta los ratones no debe ser la misma persona que puntúe los ratones. Si esto no es posible, los tubos de control y tratamiento pueden ser aleatorizados y etiquetados con nuevos ID por otra persona (es decir, el control es A, el tratamiento es B) por lo que las inyecciones pueden ser cegadas. La puntuación del ratón debe realizarse a la misma hora todos los días y en los mismos días posteriores a la inyección entre diferentes experimentos.
Un obstáculo potencial en este modelo es la falta de desarrollo de la EICH. Esto podría deberse a la reducción de la viabilidad de PBMC, que se puede abordar comprobando la viabilidad de PBMC contando las celdas con azul trypan. Si se encuentra problemas con la viabilidad celular, las células se pueden poner en PBS complementado con 2% FBS para mejorar la supervivencia. Además, se pueden inyectar menos ratones a la vez para reducir el tiempo que las células se sentan a temperatura ambiente. La eficacia de la inyección retroorbital puede ser el problema. Los ratones que se inyectan con PBMC pero no desarrollan EICH pueden ser eutanasiados y las células inmunitarias aisladas de sus bazos se pueden analizar para detectar la presencia de células humanas a través de dPCR o citometría de flujo. Si hay un injerto deficiente, entonces es probable que haya un problema con la técnica de inyección. Como prueba de la técnica de inyección, los ratones se pueden inyectar retro-orbitalmente con 200 l de tinte azul Evans. Si la inyección tiene éxito, las orejas, las patas y la cola del ratón se volverán azules.
El modelo xenoGVHD imita de cerca la patogénesis y progresión de la enfermedad de la EICH aguda humana30. A diferencia del modelo de GVHD de desajustemante, el modelo xenoGVHD permite probar el efecto de las terapias inmunosupresoras, incluidas las terapias de células humanas, en las células humanas en lugar de las células murinas. Esto reduce la variación debido a las diferencias de especies al aplicar los resultados de la investigación a la clínica. El modelo xenoGVHD también puede servir como un ensayo de supresión in vivo en otros campos de la investigación de células T. Por lo tanto, los resultados de experimentos que utilizan el modelo xenoGVHD se pueden aplicar a cualquier enfermedad inflamatoria mediada por células T humanas además de la EICH.
Hay limitaciones del modelo xenoGVHD. Estos incluyen la variabilidad experimental y las posibles diferencias en el tratamiento de la EICH en comparación con la clínica. Las incoherencias experimentales pueden derivarse de diferencias en la tensión del ratón, los sitios de inyección de PBMC, la dosis de radiación y el entorno microbiano30,31. Por lo tanto, los laboratorios que utilizan este modelo deben intentar estandarizar estos parámetros para garantizar resultados coherentes. En este protocolo, se describen métodos de puntuación que ayudan a reducir la variabilidad en la puntuación. Entre los factores que pueden limitar la comparabilidad de los datos xenoGVHD con respecto a los resultados clínicos figuran la falta de grupos de control tratados con fármacos profilácticos de la EICH y el uso de la irradiación como única fuente de acondicionamiento en el modelo31de xenoGVHD. Además, el mecanismo de xenoGVHD no recapitula completamente la patogénesis subyacente en la EICH humana. Por ejemplo, son los ADC de donantes en lugar de los ADC de host los que activan las células T humanas en el modelo xenoGVHD, mientras que los ADC de host desempeñan un papel importante en la EICH7humana. Así, al igual que con la mayoría de los modelos preclínicos, existen incoherencias e incompatibilidades entre xenoGVHD y la EICH humana que pueden limitar la aplicación de datos generados desde la xenoGVHD a la clínica.
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Disclosures
No se declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Nos gustaría reconocer al laboratorio de Lane Christenson por proporcionar la máquina pcR digital utilizada en estos experimentos y por el soporte técnico proporcionado. También nos gustaría agradecer al Dr. Thomas Yankee por su orientación y tutoría. Estos estudios fueron apoyados por la Fundación De la Familia Tripp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL eppendorf tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 mL serological pipet | VWR International | 89130-898 | |
| 10mL BD Vacutainers - Green capped with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 366480 | |
| 250 µL Ranin pipette tips | Rainin | 17001118 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
| 50 mL conical tube | VWR International | 89039-656 | |
| 96-Well ddPCR plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Optional |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 6818 | |
| Anesthesia Chamber | World Precision Instruments | EZ-178 | Provided by animal facility |
| Anesthesia Machine | Parkland Scientific | PM1002 | Provided by animal facility |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set | Becton Dickinson | 367281 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864007 | |
| DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O | Life Technologies | 1811318 | |
| Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | 45001750 | |
| Insulin Syringe | Fisher Scientific | 329424 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | Provided by animal facility |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mouse Irradiator Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC 1 | Holds up to 11 mice |
| Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4") | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| P1000 pipetman | MidSci | A-1000 | |
| P200 pipetman | MidSci | A-200 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad | 1814040 | |
| Pipetaid Gilson Macroman | Fisher Scientific | F110756 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
| Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| qPCR plates | VWR International | 89218-292 | |
| QX200 Droplet Digital PCR System | Bio-Rad | 12001925 | Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications |
| QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| RNase and DNase-free plate seal | Thermo Scientific | 12565491 | |
| RPMI Advanced 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply) | Fisher Scientific | 67522 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 21040CV | |
| Sterile reservoir | VWR International | 89094-662 | |
| Surgial Scissors | Kent Scientific | INS600393-4 | |
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650914-4 |
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