Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

אינדוקציה והבקיע של מחלת השתל מול מארחים ב מודל Murine מורה Xenoic ו כימות האדם תאים T ברקמות העכבר באמצעות PCR דיגיטלי

doi: 10.3791/59107 Published: May 23, 2019

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום ולצבור מחלות ב-xenogeneic השתל-מול-מארח (Xenogeneic) מודל. xenoGVHD מספק מודל vivo כדי ללמוד דיכוי חיסוני של תאים האדם T. בנוסף, אנו מתארים כיצד לזהות תאים האדם T ברקמות עם PCR דיגיטלי ככלי כדי לכמת את הדיכוי החיסוני.

Abstract

השתל חריפה לעומת מארחים (GVHD) היא מגבלה משמעותית עבור חולים המקבלים השתלת תא גזע המטופאות כטיפול בליקויים המטולוגיים וממאירות. GVHD חריפה מתרחשת כאשר תאים התורם T לזהות רקמות מארח כמו אנטיגן זר והר תגובה חיסונית למארח. הטיפולים הנוכחיים כוללים תרופות מדכאים חיסוני רעיל הרינדור חולים הרגישים זיהום והישנות. כך, יש מחקר מתמשך כדי לספק טיפול GVHD חריפה שיכולים ביעילות למקד את תאי התורם T ולהפחית תופעות לוואי. הרבה מהעבודה הפרה-קלינית הזאת משתמשת במודל ה-GVHD (xenoGVHD) המאפשר בדיקה של טיפולים חיסוניים מדכאים על תאים אנושיים במקום תאים מורניים במערכת vivo. פרוטוקול זה מתאר כיצד לגרום ל-xenoGVHD וכיצד לעוור ולתקנן ניקוד קליני כדי להבטיח תוצאות עקביות. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש ב-PCR דיגיטלי כדי לזהות תאי T אנושיים ברקמות העכבר, אשר יכול לאחר מכן לשמש לכמת את היעילות של טיפולים נבדק. מודל xenoGVHD לא רק מספק מודל לבדוק טיפולים GVHD אבל כל טיפול שיכול לדכא את תאי T האדם, אשר לאחר מכן ניתן להחיל על מחלות דלקתיות רבות.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

להשתלת תא גזע המטמית (HSCT) הפכה לטיפול שגרתי עבור חולים הסובלים ממאירות המטולוגית כגון לוקמיה עם פרוגנוזה גרועה. סיבוך משמעותי של HSCT הוא השתל חריפה-מול-מארחים מחלה (GVHD). מחקר 2012 דיווחו כי GVHD חריפה שפותחה ב 39% מהחולים HSCT לקבל השתלות מתורמים אח ו 59% של חולים שקיבלו השתלות מתורמים שאינם קשורים1. GVHD חריפה מתרחשת כאשר התורם נגזר תאים T לתקוף איברים של המטופל. הטיפול המוצלח היחיד עבור GVHD הוא טיפול עם תרופות מדכאים חיסוני מאוד2, אשר רעילים מאוד להגדיל את הסיכון לזיהום והישנות הגידול. לפיכך, למרות שיפורים שנעשו בהישרדות gvhd חריפה בשנים האחרונות3,4,5, יש עדיין צורך חיוני עבור טיפולים משופרים של gvhd עם רעילות מינימלית המקדמים הפוגה ארוכת טווח.

המטרה הכוללת של השיטות הבאות היא לגרום ולהבקיע xenogeneic GVHD (Xenogeneic). מודל xenoGVHD פותחה ככלי כדי לגרום GVHD חריפה עם תאים אנושיים במקום תאים מורטין המאפשר תרגום ישיר יותר של מחקר GVHD מראש קליני ניסויים קליניים6. מודל זה כולל הזרקת באופן מובהק את התאים האנושיים היקפיים (PBMC) לתוך עכברים-SCID IL-2Rγnull (NSG) עכבר כי הם לקרינה משנית. מוזרק האדם תאים t מופעלים על ידי האדם אנטיגן הצגת תאים (apcs) הצגת אנטיגן murine ואת התאים הפעילים T להעביר לרקמות רחוקות וכתוצאה מכך דלקת מערכתית בסופו של דבר מוות6,7, בן שמונה , מיכל בן 10 , 10. המחלה פתולוגיה והתקדמות במודל xenoGVHD הדוק מקרוב האדם gvhd אקוטי. באופן ספציפי, התאים האנושיים T הפתוגניים הם מגיבים מערכת מורכבים היסטורתתאימות (mhc) חלבונים, אשר דומה לפעילות ה-alloreactivity של האדם gvhd6,9. היתרון העיקרי של מודל xenoGVHD מעל מודל התנגשות MHC העכבר, מודל GVHD בשימוש נרחב, הוא מאפשר בדיקות של טיפולים על תאים אנושיים ולא תאים מורקיים. זה מאפשר בדיקות של מוצרים שיכולים ישירות להיות מתורגם למרפאה ללא כל שינוי כי הם עשויים למקד את התאים האנושיים. לאחרונה, מודל זה נעשה שימוש כדי לבדוק את האדם anti-IL-2 נוגדן11, הגוף הרגיל הרתי T תאים (tregs)12 ותאי גזע mesenchymal אנושי13 כטיפולים פוטנציאליים עבור gvhd חריפה. בהקשר רחב יותר, מודל זה יכול לשמש כvivo לדיכוי של כל סוג של סם או תא שיכול לדכא את פעילות תא T האנושית. לדוגמה, Stockis ואח '14 השתמשו במודל xenoGVHD כדי ללמוד את ההשפעה של חסימת אינטגרציה αVβ8 על פעילות מדכאים treg ב vivo. כך, מודל xenoGVHD יכול לספק תובנה לתוך המנגנון של כל תרפיה לכוון תאים T ב vivo הגדרה.

שיטה נוספת המתוארת בפרוטוקול זה היא כיצד לזהות תאי T אנושיים ברקמות העכבר באמצעות תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלי (dPCR). המטרה של שיטה זו היא להציע כלי כדי לכמת הגירה והתפשטות של תאים T ברקמות היעד, אשר למדוד את היעילות של טיפולים חיסוניים מדכאים נבדק במודל זה. dPCR היא שיטה מקורית יחסית לקוונפיקציה של חומצות גרעין15. בקצרה, תערובת התגובה של ה-PCR מחולקת למחיצות המכילות מספר קטן של רצף היעד או ללא מטרה כלל. רצף היעד הוא לאחר מכן מוגבר וזוהה באמצעות צבעי DNA intercalating או היעד הספציפי המטרה-בדיקות ספציפיות. dpcr ככמת את מספר העותקים של רצף היעד בהתבסס על שבריר של מחיצות חיוביות וסטטיסטיקה של פואסון15,16. זיהוי תאים T עם dPCR דורש רקמות הרבה פחות לעומת שיטות חלופיות אחרות, כולל הזרמת cy, היסטולוגיה, וניתן לבצע על הרקמות קפוא או קבוע. dPCR אינו דורש עיקול רגיל כדי לקבוע מספרי עותקים, וגם לא משכפל טכני. זה מפחית את כמות ה-DNA של התבנית ואת התבניות הדרושות עבור dPCR בהשוואה ל-PCR כמותי מסורתי (qPCR)16. חלוקת תגובת ה-PCR לתגובות משנה ב-dPCR ביעילות מתמקדת במטרות17. לפיכך, dPCR הוא בעיקר כלי לזיהוי מטרות נדירות בכמות גדולה של דנ א שאינו מטרה. לדוגמה, dPCR משמש כדי לזהות זיהום חיידקי בחלב18, לזהות מוטציות נדירות בגן קולטן אסטרוגן19, ולזהות במחזור DNA גידול בדם של חולים20. בפרוטוקול זה, dPCR משמש כלי יעיל לזיהוי וכימות האדם בתאי T ברקמות של עכברים עם xenoGVHD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל הניסויים בעכבר בוצעו בהתאם, ובאישור, המרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס טיפול בבעלי חיים מוסדיים והוועדה השתמש. כל דגימות הדם האנושיות הבריאים הושגו תחת הסכמה מושכלת ובאישור ממועצת הסקירה המוסדית במרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס.

1. הקרנה של עכברים NSG

  1. יום אחד לפני הזרקת PBMC, הקרין 8-12 שבועות עכברים NSG (או סקס יכול לשמש). בארון ביולוגי סטרילי, המקום עכברים בכלוב של עוגה סטרילית או מיקרובודדים. הקרנה עכברים ב-Cs137 מקור או בעלי חיים קטנים הסקה (g., RS 2000) עם מנה מוחלטת של 150 cgy עם סיבוב איטי כדי להבטיח אפילו הקרנות.
  2. מניחים עכברים לתוך כלובים נקיים בארון ביולוגי סטרילי.

2. הכנת PBMC אנושי להזרקה

  1. לאסוף מספיק דם אנושי בריא כדי לבודד 1.1 x 107 pbmc לכל עכבר. לדלל את הדם heparinized בנפח שווה של 2% סרום העובר העוברי (FBS) ב מלוחים פוספט באגירה (PBS).
    הערה: באמצעות פרוטוקול זה, תפוקת PMBC היא בדרך כלל 0.5 – 1 x 107 לכל 10 מ ל של דם שלם. כל עכבר יקבל 107 pbmc ב 100 μl של PBS. התוספת 1 x 106 ב 10 μl לכל עכבר מבטיח כי כל עכבר מקבל את המינון המלא של pbmc, צריך להיות בעיות עם מילוי מזרקים.
  2. הוסף 15 מ ל לימפוציטים צפיפות ההפרדה בינוני (למשל, Ficoll) לצינור 50 mL ולאחר מכן שכבת בזהירות עד 25 מ ל של דם מדולל על גבי מעבר הדחיסות. צנטריפוגה את הצינור המכיל צפיפות הדרגתי ואת הדם מדולל ב 400 x g עבור 40 דקות בטמפרטורת החדר ללא בלם.
  3. לקצור את ממשק PBMC ל 10 מ ל של PBS בצינור 50 mL. צנטריפוגה את התאים ב 400 x g עבור 10 דקות. הסר את הסופרנטאנט.
  4. לשחרר את הגלולה על ידי מצליף שפופרת ולהשעות מחדש ב 10 מ ל PBS לשטוף את PBMC. צנטריפוגה את התאים ב 400 x g עבור 5 דקות.
  5. אופציונלי התעלם מתאי הדם האדומים (RBCs) בתוך הגלולה של התא על-ידי הוספת נפח של מאגר הליזה אמוניום-כלוריד (ACK) השווה לנפח הגלולה. השעיית מחדש בעדינות את הגלולה ומערבולת הצינור במשך 30-60. מילוי צינור עם מדיה RPMI ללא סרום וצנטריפוגה את הצינור ב 400 x g עבור 5 דקות.
  6. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את. הגלולה ב -5 מ ל של PBS לספור את התאים באמצעות טריבין כחול הדרה עם הומוציטומטר ומיקרוסקופ.
  7. צנטריפוגה את התאים ב 400 x g עבור 5 דקות. הסר את התאים מחדש והשהה בתוך 1 x 108 תאים/mL ב-PBS.

3. רטרו-הזרקה מסלולית של pbmc האדם לתוך עכברים21

  1. מניחים תא הרדמה בתוך כיסוי. זרימה משכבתית כדי לשמור על עקרות הטען מראש את חדר ההרדמה עם 5% isofלוריאן ו 1 L/min שיעור זרימת חמצן עבור 5 דקות.
  2. ולשים עכברים מאותו הכלוב. לתוך תא ההרדמה , ברגע שעכברים מאבדים את התאורה. עכברים מריגזים בחדר 5 דקות במהלך הזמן הזה, מזרק טרום למלא עם 100 μL (1 x 107 תאים) של השעיית תא.
  3. מניחים את העכבר על משטח חימום עם אפו בקונוס האף כדי לשמור על ההרדמה. בדוק אובדן הכרה על ידי צובט משטח כף רגל ובדיקת חוסר רפלקס.
  4. רסן את העכבר עם האגודל והאצבע האמצעית. הוסף את 28 G 1/2 במחט עם שפוע למטה לרוחב כדי canthus האמצעי, דרך קרום לחאל עד החלק האחורי של העין הוא הגיע. למשוך מעט את המחט ולהזריק לאט 100 μL של תאים (1 x 107 תאים).
  5. מלא לסגת את המחט כראוי להיפטר המזרק ואת המחט. סגרו את העפעף והפעילו לחץ קל על אתר ההזרקה בעזרת ספוג גזה.
  6. בדוק את אתר ההזרקה לנפיחות או טראומה גלויה אחרת. לאפשר לעכבר להחזיר את ההכרה בכלוב סטרילי מרופדת עם מגבות נייר כדי למנוע שאיפה של מצעים לפני שעובר לכלוב הבית. לאחר כל דימום הופסק, להחיל טיפה אחת של proparacaine לעין על כאבים.
    הערה: הזרקת וריד הזנב היא שיטה חלופית של הזרקה של PBMC עבור פרוטוקול זה כפי שמתואר על-ידי מאצ et al.

4. הניקוד הקליני של GVHD חריפה בעכברים (איור 1)23

  1. מדידת ציון GVHD כל יום אחר עד שעכברים מגיעים לתוצאה של 2 ואז כל יום עד יום ההקרבה.
    1. הניחו את הכלוב במכסה של זרם למינארי, הסירו את המזון והמים והניחו את המכסה בחזרה. ציון פעילות על ידי התבוננות עכברים 5 דקות ולהקצות ציונים כדלקמן: 0 = העכבר מתחיל ללכת בתוך כמה דקות ושומר על הליכה סביב כלוב, 1 = העכבר לוקח יותר מכמה דקות כדי לקום והולך לאט סביב הכלוב, 2 = העכבר לא לקום ב 5 דקות הליכה בלבד כאשר נגע.
  2. שוקלים כל עכבר בגביע זכוכית לתת ציון ירידה במשקל : 0 = < 10% שינוי, 1 = 10 – 25% שינוי 2 = > 25% שינוי.
  3. בעוד העכבר עדיין בגביע, לבדוק את היציבה: 0 = נורמלי, 1 = המשך במנוחה, 2 = המשך פוגע בתנועה; מרקם פרווה: 0 = נורמלי, 1 = קל עד בינוני הרופלינג, 2 = מרופחים חמורים, ושלמות העור : 0 = נורמלי, 1 = קנה מידה של כפות רגליים/זנב, 2 = אזורים ברורים של העור מודגש (להסתכל על האוזניים, זנב וכפות לשינוי גודל).
  4. עם חמש קטגוריות ניקוד של 0 – 2 עבור כל קטגוריה, עכבר יכול להגיע לציון המרבי של 10. כאשר עכבר מגיע ציון של 7 או יותר או מגיע 42 ימים לאחר ההזרקה, המתת חסד העכבר באמצעות CO2 המתת חסד או שיטה אחרת אושרה על ידי הוועדה המקומית טיפול בעלי חיים מוסדיים והשתמש.
    הערה: כדי להבטיח דיוק של תוצאות, הניקוד מבוצע על ידי חוקר שעוור את קבוצות הטיפול24. בנוסף, למרות ש> 20% מאובדן משקל הגוף היא נקודת הקצה המומלצת לאנושיות עבור פרוטוקולים של IACUC רבים, עם אישור הצדקה IACUC נוסף של פרוטוקול זה ניתן להשיג.

5. קצירת רקמות עבור דנ א גנומית של עכברים מורדמים ובידוד דנ א גנומית

  1. מנתחים עכברים באמצעות כלי ניתוח סטרילי. חותכים פיסת רקמה קטנה על 3 מ"מ x 0.5 מ"מ בגודל של איבר של עניין, למשל, ריאות, כבד, או טחול. שוקלים את דגימת הרקמה ומניחים את פיסת הרקמה בצינור 1.5 mL סטרילי. אם איסוף מספר רקמות, לשטוף כלים עם אתנול בין חיתוך כל איבר.
  2. הקפאת רקמות על ידי תת מיזוג הצינורות המכילים את הרקמה בחנקן נוזלי עד שהוא מפסיק מבעבע ולאחסן ב-80 ° c לילה. הפשרת דגימות רקמות ולאחר אותם על פי דנ א גנומית (gDNA) ערכת בידוד.
  3. בידוד דנ א גנומית לפי הוראות היצרן כמתואר בערכה. הקפידו לשים לב לכמות הרקמה שתעובד למיקרו-ליטר של מספר gDNA (mg/μL).
    הערה: ניתן לאחסן רקמות קפואות ב-80 ° c לעיבוד במועד מאוחר יותר.

6. קוונפיקציה של תאי T האדם באמצעות PCR דיגיטלי (איור 2)

  1. הכינו תגובות PCR דיגיטלי בהתאם לפרוטוקול עבור צבעים איגוד ה-DNA עבור מכונת ה-PCR הדיגיטלי בשימוש. השתמש מסוימים התחל הבאים ספציפיים עבור CD3 האנושי אפסילון גנומית (רצף התייחסות NCBI ק: NG_ 007383.1); מדריך קדמי: הפוך להילוך אחורי: היפוך כמוסות, הפוכה. התחל האלה תניב. רצועה אחת של 105 bp
    הערה: הוסף 0.5 μL של אנזים הגבלה, כגון HindIII, לכל תגובה כדי לעכל את ה-DNA גנומית. הקפד לבדוק מדלל gDNA שונים כדי למטב את ההפרדה של טיפות חיוביות ושליליות. בנוסף, קבוצת משנה של הסתננות תאים T עשוי להיות לא פתוגניים תאי T הרגולציה. תאים אלה ניתן לכמת באמצעות תחל נוסף עבור סמני תא T הרגולציה.
  2. בצע את תגובת ה-PCR הדיגיטלי תחת התנאים הבאים: מכסה 105 ° c, 95 ° c עבור 10 דקות (מחזור 1); 95 ° c עבור 30, רמפה 2 ° צ'/s ו 55 ° צ' עבור 1 דקות, כבש 2 ° צ'/s (40 מחזורים); 72 ° צ' במשך 10 דק ', 12 ° c להחזיק.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך לכוונן פרמטרים אלה בהתאם לציוד ה-PCR הדיגיטלי.
  3. לרכוש נתונים PCR דיגיטלי עם תוכנת ניתוח. דווח על נתונים כמספרי עותקים לכל מ ג של רקמה באמצעות המשוואה הבאה: (מספר עותקים/μL) x (μL של gDNA בתגובה) x (מקדם דילול)/(mg של רקמה/μL של סך של gDNA)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

משנה לקרינה 8-12 שבוע עכברים NSG הישן של שני המינים שהתקבלו PBMC האדם התחיל להציג סימנים קליניים של GVHD סביב היום 10 לכתוב הזרקה לעומת עכברים שליטה שלילית שקיבלו PBS בלבד (איור 1A). לעכברים XenoGVHD היתה הישרדות חציון של 23.5 ימים (איור 1B). עם ה-PCR הדיגיטלי, CD3 אפסילון חיובי האדם תאים לא ניתן להבחין בדגימות הריאות והכבד של עכברים שהתקבלו PBMC אנושי. דגימות רקמה מעכברים שהוחדרו עם PBS שימשו כפקדים (איור 2).

Figure 1
איור 1: התקדמות המחלה GVHD. מתחת לקרינה 8-12-בשבוע בן זכר, נקבה NSG עכברים היו רטרו-אורבאלי הוזרק עם 1 x 107 pbmc אנושי (n = 6) או PBS (n = 4) כפקד שלילי. נתונים המוצגים הם התוצאות המשולבות של שלושה ניסויים עצמאיים. (א) הציון הגדיסק הקשיח נמדד כל יום אחר עד שעכברים הגיעו לתוצאה של 2 ולאחר מכן כל יום עד יום ההקרבה. נתונים שדווחו בכל נקודה עבור ניקוד GVHD הוא הציון ± SEM ממוצע של עכברים חיים בשילוב עם התוצאות האחרונות של כל העכברים מת בכל קבוצה. * p < 0.05 שנקבע על ידי מבחן מאן ויטני U. (ב) בעיקול קפלן-מאייר של ההישרדות. המוות סומן בעת ציון GVHD היה ≥ 7. * p < 0.05 כפי שנקבע על ידי בדיקה בדרגת יומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: זיהוי תאי T אנושיים באמצעות PCR דיגיטלי. דגימות ריאות הכבד נאספו מעכברים שהיו רטרו-אורבאלי הוזרק עם PBS (n = 3) או 1 x 107 האדם pbmc (n = 3) כאשר עכברים הגיעו ציון gvhd של ≥ 7 או 42 ימים לאחר הזרקת. הנתונים נאספו 3 ניסויים עצמאיים. gDNA היה מבודד ו-PCR דיגיטלי שימש כדי לקבוע את ההעתקים של CD3 האדם אפסילון לכל מיליגרם של רקמות. (א) המייצגת את העלילה ה-PCR הדיגיטלי של דגימות הריאות והכבד מהעכבר שהוזרק באמצעות PBS או pbmc. (ב) כימות של עותקים של CD3 האדם אפסילון לכל מילגרם של רקמה מעכברים שהוחדרו עם PBS או pbmc. * p ≤ 0.05 שנקבע על ידי מבחן מאן ויטני U. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

התקדמות המחלה היא עקבית בדרך כלל במודל xenoGVHD, אפילו עם הזרקה של התורמים שונים, כך ניסויים מרובים ניתן לשלב. השלבים העיקריים הנדרשים כדי לשמור על עקביות זו הם שיטת הזרקת העירוי הנכונה, מסנוור ועקבי הניקוד. מחקר של Nervi ואח '25 הפגינו כי בהשוואה הזרקת וריד הזנב, הזרקות רטרו מסלולית של pbmc הביא העפילו עקבי יותר וחמור יותר gvhd. ליאון ריקו ואח '26 הפגינו גם כי הזריקות רטרו מסלולית הביא לתאי גזע המטפי יותר עקבי בתוך עכברים לעומת הזרקת וריד הזנב. עם זאת, במידת הצורך, זריקות וריד הזנב ניתן להשתמש כשיטה חלופית ב-xenogvhd מודל27,28,29.

הבעיה של שינויים של תוצאות הקשורות זריקות וריד יכול להיות מופחת על ידי הגדלת מספר נושאים. בנוסף, חשוב כי האדם הבקיע את העכברים הוא עיוור לטיפול בעכבר כדי למנוע הטיה בניקוד של קריטריונים סובייקטיבית יותר כגון פעילות או פרווה מרקם. החשיבות של הניקוד העיוור GVHD הוכח גם במרפאה24. האדם שהזריק לעכברים לא צריך להיות אותו אדם שקלע את העכברים. אם זה לא אפשרי, שליטה צינורות הטיפול יכול להיות אקראי מתויג עם מזהה חדש של אדם אחר (כלומר, השליטה היא A, הטיפול הוא B) כך זריקות יכול להיות עיוור. הניקוד העכבר צריך להתבצע בסביבות באותו הזמן בכל יום באותו היום לאחר ההזרקה בין ניסויים שונים.

מכשול פוטנציאלי אחד במודל זה הוא חוסר פיתוח GVHD. זה יכול להיות בגלל הכדאיות הנמוכה של PBMC אשר ניתן לטפל על ידי בדיקת הכדאיות של PBMC ידי ספירת תאים עם טריפי כחול. אם נתקלת בבעיות בכדאיות של תאים, ניתן להכניס את התאים באמצעות PBS בתוספת 2% FBS כדי לשפר את ההישרדות. כמו כן, ניתן להזריק פחות עכברים בזמן כדי להקטין את תאי הזמן היושבים בטמפרטורת החדר. היעילות של הזרקה מסלולית רטרו יכול להיות הבעיה. עכברים כי הם מוזרק עם pbmc אבל לא לפתח gvhd ניתן מורדמים ותאים חיסוניים מבודדים טחולים שלהם ניתן לנתח עבור נוכחות של תאים אנושיים דרך dpcr או זרימה cy, לנסות. אם יש חרט עני, אז סביר להניח שיש בעיה עם טכניקת הזרקה. כמבחן של טכניקת הזרקה, עכברים יכולים להיות מוזרק רטרו-אוריואלי עם 200 μL של אוונס כחול. אם הזריקה מוצלחת, האוזניים, כפות הידיים והזנב של העכבר יהפוך כחול.

המודל xenoGVHD מחקה היטב את האדם האנושי חריפה המחלה GVHD והתקדמות30. שלא כמו מודל GVHD של התאמה MHC מורלא, מודל xenoGVHD מאפשר בדיקה של ההשפעה של טיפולים חיסוניים מדכאים, כולל טיפולי תאים אנושיים, על תאים אנושיים ולא תאים מוראים. זה מפחית את הווריאציה בשל הבדלים במינים כאשר מיישמים תוצאות מחקר למרפאה. מודל xenoGVHD יכול גם לשמש כvivo לדיכוי בתחומים אחרים של מחקר התא T. כך, תוצאות של ניסויים באמצעות מודל xenoGVHD ניתן להחיל על כל האדם T בתיווך מחלה דלקתית בנוסף ל-GVHD.

קיימות מגבלות של מודל xenoGVHD. אלה כוללים שינויים ניסיוניים והבדלים אפשריים בטיפול GVHD לעומת המרפאה. חוסר עקביות ניסיוני יכול לנבוע הבדלים במתח העכבר, אתרים של הזרקת pbmc, מינון קרינה סביבה מיקרוביאלית30,31. לפיכך, מעבדות המשתמשות במודל זה אמורות לנסות לתקנן פרמטרים אלה כדי להבטיח תוצאות עקביות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות הבקיע שמסייעות להפחית את השונות בניקוד. גורמים שעשויים להגביל את השוואת היכולת של נתוני xenoGVHD לתוצאות קליניות כוללים את העדר קבוצות בקרה המטופלת בתרופות מניעה מסוג GVHD והשימוש בהקרנה כמקור היחיד למיזוג ב-xenoGVHD מודל31. בנוסף, המנגנון של xenoGVHD אינו מסכם לחלוטין את הפתוגנזה הבסיסית ב-GVHD האנושית. לדוגמה, זהו התורם APCs במקום מארח APCs המפעילים תאי T אנושיים במודל xenoGVHD, בעוד מארח APCs לשחק תפקיד משמעותי ב-GVHD האנושית7. כך, כמו עם רוב הדגמים הפרה-קליניים, יש חוסר עקביות ואי-התאמות בין xenoGVHD ו-GVHD האדם שעשוי להגביל את יישום הנתונים שנוצר מ-xenoGVHD למרפאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין קונפליקטים של עניין מוצהר.

Acknowledgments

היינו רוצים להכיר את המעבדה של ליין Christenson לספק את מכונת ה-PCR הדיגיטלי המשמש ניסויים אלה ועל התמיכה הטכנית סיפק. אנחנו רוצים גם להודות לד ר תומס יאנקי על הדרכתו והמנטורה שלו. מחקרים אלה תמכו בקרן משפחת טריפ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL eppendorf tubes Fisher 05-408-129
10 mL serological pipet VWR International 89130-898
10mL BD Vacutainers - Green capped with Sodium Heparin Becton Dickinson 366480
250 µL Ranin pipette tips Rainin 17001118 Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
50 mL conical tube VWR International 89039-656
96-Well ddPCR plate Bio-Rad 12001925
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer Lonza 10-548E Optional
Alcohol Wipes Fisher Scientific 6818
Anesthesia Chamber World Precision Instruments EZ-178 Provided by animal facility
Anesthesia Machine Parkland Scientific PM1002 Provided by animal facility
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set Becton Dickinson 367281
DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator Bio-Rad 1864007
DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O Life Technologies 1811318
Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology Sigma-Aldrich E7023-500ML
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150
Ficoll Fisher Scientific 45001750
Insulin Syringe Fisher Scientific 329424
Isoflurane Sigma-Aldrich CDS019936 Provided by animal facility
Liquid nitrogen N/A N/A
Mouse Irradiator Pie Cage Braintree Scientific, Inc. MPC 1 Holds up to 11 mice
Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4") Fisher Scientific 19-027-761
P1000 pipetman MidSci A-1000
P200 pipetman MidSci A-200
Pierceable Foil Heat Seal Bio-Rad 1814040
Pipetaid Gilson Macroman Fisher Scientific F110756
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ Rainin 17013805 Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit Qiagen 69506
qPCR plates VWR International 89218-292
QX200 Droplet Digital PCR System Bio-Rad 12001925 Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications
QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen Bio-Rad 1864006
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix Bio-Rad 1864033
RNase and DNase-free plate seal Thermo Scientific 12565491
RPMI Advanced 1640 Life Technologies 12633012
Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply) Fisher Scientific 67522
Sterile Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 21040CV
Sterile reservoir VWR International 89094-662
Surgial Scissors Kent Scientific INS600393-4
Surgical Forceps Kent Scientific INS650914-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jagasia, M., et al. Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation. Blood. 119, (1), 296-307 (2012).
  2. Bolanos-Meade, J., et al. Phase 3 clinical trial of steroids/mycophenolate mofetil vs steroids/placebo as therapy for acute GVHD: BMT CTN 0802. Blood. 124, (22), quiz 3335 3221-3227 (2014).
  3. Gooley, T. A., et al. Reduced mortality after allogeneic hematopoietic-cell transplantation. New England Journal of Medicine. 363, (22), 2091-2101 (2010).
  4. Hahn, T., et al. Significant improvement in survival after allogeneic hematopoietic cell transplantation during a period of significantly increased use, older recipient age, and use of unrelated donors. Journal of Clinical Oncology. 31, (19), 2437-2449 (2013).
  5. Khoury, H. J., et al. Improved survival after acute graft-versus-host disease diagnosis in the modern era. Haematologica. 102, (5), 958-966 (2017).
  6. King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical & Experimental Immunology. 157, (1), 104-118 (2009).
  7. Lucas, P. J., Shearer, G. M., Neudorf, S., Gress, R. E. The human antimurine xenogeneic cytotoxic response. I. Dependence on responder antigen-presenting cells. Journal of Immunology. 144, (12), 4548-4554 (1990).
  8. Ito, R., et al. Highly sensitive model for xenogenic GVHD using severe immunodeficient NOG mice. Transplantation. 87, (11), 1654-1658 (2009).
  9. Kawasaki, Y., et al. Comprehensive Analysis of the Activation and Proliferation Kinetics and Effector Functions of Human Lymphocytes, and Antigen Presentation Capacity of Antigen-Presenting Cells in Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 24, (8), 1563-1574 (2018).
  10. Ito, R., et al. A Novel Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease Model for Investigating the Pathological Role of Human CD4(+) or CD8. T Cells Using Immunodeficient NOG Mice. American Journal of Transplantation. 17, (5), 1216-1228 (2017).
  11. Trotta, E., et al. A human anti-IL-2 antibody that potentiates regulatory T cells by a structure-based mechanism. Nature Medicine. 24, (7), 1005-1014 (2018).
  12. Dijke, I. E., et al. Discarded Human Thymus Is a Novel Source of Stable and Long-Lived Therapeutic Regulatory T Cells. American Journal of Transplantation. 16, (1), 58-71 (2016).
  13. Huang, F., et al. Human Gingiva-Derived Mesenchymal Stem Cells Inhibit Xeno-Graft-versus-Host Disease via CD39-CD73-Adenosine and IDO Signals. Frontiers in Immunology. 8, 68 (2017).
  14. Stockis, J., et al. Blocking immunosuppression by human Tregs in vivo with antibodies targeting integrin alphaVbeta8. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, (47), E10161-E10168 (2017).
  15. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, (16), 9236-9241 (1999).
  16. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A Technology Review. Sensors (Basel). 18, (4), (2018).
  17. Sykes, P. J., et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13, (3), 444-449 (1992).
  18. Ma, H., et al. Evaluation of Bacterial Contamination in Goat Milk Powder Using PacBio Single Molecule Real-Time Sequencing and Droplet Digital PCR. Journal of Food Protection. 1791-1799 (2018).
  19. Vitale, S. R., et al. An optimized workflow to evaluate estrogen receptor gene mutations in small amounts of cell-free DNA. Journal of Molecular Diagnostics. (2018).
  20. Gorgannezhad, L., Umer, M., Islam, M. N., Nguyen, N. T., Shiddiky, M. J. A. Circulating tumor DNA and liquid biopsy: opportunities, challenges, and recent advances in detection technologies. Lab Chip. 18, (8), 1174-1196 (2018).
  21. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. LabAnimal. 40, (5), 155-160 (2011).
  22. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  23. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, (8), 3230-3239 (1996).
  24. Weisdorf, D. J., et al. Prospective grading of graft-versus-host disease after unrelated donor marrow transplantation: a grading algorithm versus blinded expert panel review. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 9, (8), 512-518 (2003).
  25. Nervi, B., et al. Factors affecting human T cell engraftment, trafficking, and associated xenogeneic graft-vs-host disease in NOD/SCID beta2mnull mice. Experimental Hematology. 35, (12), 1823-1838 (2007).
  26. Leon-Rico, D., et al. Comparison of haematopoietic stem cell engraftment through the retro-orbital venous sinus and the lateral vein: alternative routes for bone marrow transplantation in mice. LabAnimal. 49, (2), 132-141 (2015).
  27. Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rgammanull mice display a T-effector memory phenotype. PLoS One. 7, (8), e44219 (2012).
  28. van Rijn, R. S., et al. A new xenograft model for graft-versus-host disease by intravenous transfer of human peripheral blood mononuclear cells in RAG2-/- gammac-/- double-mutant mice. Blood. 102, (7), 2522-2531 (2003).
  29. Wunderlich, M., et al. OKT3 prevents xenogeneic GVHD and allows reliable xenograft initiation from unfractionated human hematopoietic tissues. Blood. 123, (24), e134-e144 (2014).
  30. Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Models & Mechanisms. 4, (3), 318-333 (2011).
  31. Zeiser, R., Blazar, B. R. Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation? Blood. 127, (25), 3117-3126 (2016).
אינדוקציה והבקיע של מחלת השתל מול מארחים ב מודל Murine מורה Xenoic ו כימות האדם תאים T ברקמות העכבר באמצעות PCR דיגיטלי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seng, A., Markiewicz, M. A. Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR. J. Vis. Exp. (147), e59107, doi:10.3791/59107 (2019).More

Seng, A., Markiewicz, M. A. Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR. J. Vis. Exp. (147), e59107, doi:10.3791/59107 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter