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Immunology and Infection

डिजिटल पीसीआर का उपयोग करके माउस टिश्यू में जेनियोनिक मेरिन मॉडल और मानव टी सेल के क्वांटिफिकेशन में ग्रेफ्ट-वर्सस-होस्ट रोग का प्रेरण और स्कोरिंग

doi: 10.3791/59107 Published: May 23, 2019

Summary

यहाँ, हम प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करने के लिए और एक xenogeneic भ्रष्टाचार-versus-होस्ट रोग (xenoGVHD) मॉडल में रोग स्कोर. xenoGVHD मानव टी कोशिकाओं के इम्यूनोसुप्रेशन का अध्ययन करने के लिए एक इन विवो मॉडल प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, हम वर्णन कैसे एक उपकरण के रूप में डिजिटल पीसीआर के साथ ऊतकों में मानव टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इम्यूनोसुप्रेशन परिमाणित करने के लिए.

Abstract

तीव्र कलम-वर्सस-होस्ट रोग (GVHD) हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल प्रत्यारोपण प्राप्त करने वाले रोगियों के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा है जो हेमेटोलॉजिकल कमियों और द्रोहियों के लिए चिकित्सा के रूप में है। तीव्र जीवीएचडी तब होता है जब दाता टी कोशिकाओं एक विदेशी प्रतिजन के रूप में मेजबान ऊतकों को पहचान और मेजबान के लिए एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया माउंट. वर्तमान उपचार में विषाक्त इम्यूनोसप्रेसिव दवाएं शामिल होती हैं जो संक्रमण और पुनरावृत्ति के लिए अतिसंवेदनशील रोगियों को प्रदान करती हैं। इस प्रकार, वहाँ चल रहे अनुसंधान के लिए एक तीव्र GVHD चिकित्सा है कि प्रभावी ढंग से दाता टी कोशिकाओं को लक्षित कर सकते हैं और साइड इफेक्ट को कम प्रदान कर रहा है. इस पूर्व नैदानिक काम के अधिकांश xenogenic GVHD (xenoGVHD) murine मॉडल है कि मानव कोशिकाओं पर इम्यूनोसप्रेसिव उपचार के परीक्षण के लिए अनुमति देता है के बजाय एक में विवो प्रणाली में murine कोशिकाओं का उपयोग करता है. इस प्रोटोकॉल की रूपरेखा कैसे xenoGVHD प्रेरित करने के लिए और कैसे अंधा और लगातार परिणाम सुनिश्चित करने के लिए नैदानिक स्कोरिंग मानकीकृत करने के लिए. इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे डिजिटल पीसीआर का उपयोग करने के लिए माउस ऊतकों में मानव टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, जो बाद में परीक्षण चिकित्सा की प्रभावकारिता मात्रा में इस्तेमाल किया जा सकता है. xenoGVHD मॉडल न केवल GVHD चिकित्सा लेकिन किसी भी चिकित्सा है कि मानव टी कोशिकाओं को दबा सकते हैं, जो तब कई भड़काऊ रोगों के लिए लागू किया जा सकता है परीक्षण करने के लिए एक मॉडल प्रदान करता है.

Introduction

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एलोजेनिक हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल ट्रांसप्लांट (एचएससीटी) खराब पूर्वानुमान के साथ ल्यूकेमिया जैसे हेमेटोलॉजिकल द्रोह से पीड़ित रोगियों के लिए नियमित उपचार बन गया है। एचएससीटी की एक महत्वपूर्ण जटिलता तीव्र भ्रष्टाचार-वर्सस-होस्ट रोग (जीवएचडी) है। 2012 के एक अध्ययन में बताया गया है कि एचएससीटी के 39% रोगियों में तीव्र जीवएचडी विकसित किया गया है जो भाई दाताओं से प्रत्यारोपण प्राप्त कर रहे हैं और 59% रोगियों को असंबंधित दाताओं से प्रत्यारोपण प्राप्त कर रहे हैं1. तीव्र जीवीएचडी तब होता है जब दाता व्युत्पन्न टी कोशिकाओं प्राप्तकर्ता के अंगों पर हमला. जीवीएचडी के लिए एकमात्र सफल चिकित्सा अत्यधिक इम्यूनोसप्रेसिव दवाओं के साथ उपचार है2, जो अत्यधिक विषाक्त होते हैं और संक्रमण और ट्यूमर पुनरावृत्ति के जोखिम को बढ़ाते हैं। इस प्रकार, हाल के वर्षों में तीव्र GVHD अस्तित्व में किए गए सुधार के बावजूद3,4,5, वहाँ अभी भी कम से कम विषाक्तता है कि लंबी अवधि की छूट को बढ़ावा देने के साथ बेहतर GVHD उपचार के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है.

निम्नलिखित विधियों का समग्र लक्ष्य को प्रेरित करने और xenogenic जीवीएचडी (xenoGVHD) स्कोर करने के लिए है। xenoGVHD मॉडल नैदानिक परीक्षणों के लिए पूर्व नैदानिक जीवीएचडी अनुसंधान के अधिक प्रत्यक्ष अनुवाद के लिए अनुमति देने के बजाय मानव कोशिकाओं के साथ तीव्र GVHD प्रेरित करने के लिए एक उपकरण के रूप में विकसित किया गया था6. इस मॉडल में मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) को NOD-SCID आईएल-2Rnull (एनएसजी) चूहों में इंजेक्शन लगाना शामिल है जो sublethally विकिरणित होते हैं। इंजेक्शन मानव टी कोशिकाओं मानव प्रतिजन पेश कोशिकाओं द्वारा सक्रिय कर रहे हैं (APCs) murine प्रतिजन पेश और सक्रिय टी कोशिकाओं प्रणालीगत सूजन और अंततः मौत6,7में जिसके परिणामस्वरूप दूर के ऊतकों के लिए पलायन 8 , 9 , 10. रोग विकृति और xenoGVHD मॉडल में प्रगति बारीकी से मानव तीव्र जीवीएचडी नकल. विशेष रूप से, रोगजनक मानव टी कोशिकाओं murine प्रमुख हिस्टो संगतता परिसर (MHC) प्रोटीन के लिए प्रतिक्रियाशील हैं, जो मानव GVHD6,9में टी सेल alloreactivity के समान है. माउस MHC-mismatch मॉडल पर xenoGVHD मॉडल का प्राथमिक लाभ, अन्य व्यापक रूप से इस्तेमाल किया GVHD मॉडल, यह murine कोशिकाओं के बजाय मानव कोशिकाओं पर उपचार के परीक्षण के लिए अनुमति देता है. यह सीधे किसी भी संशोधन के बिना क्लिनिक के लिए अनुवाद किया जा सकता है कि उत्पादों के परीक्षण के लिए अनुमति देता है क्योंकि वे मानव कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए बना रहे हैं. हाल ही में, इस मॉडल के लिए एक मानव विरोधी आईएल -2 एंटीबॉडी11,मानव थाइमिक नियामक टी कोशिकाओं (Tregs)12 और मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं13 तीव्र जीवीएचडी के लिए संभावित उपचार के रूप में परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. एक व्यापक संदर्भ में, इस मॉडल को किसी भी दवा या सेल प्रकार है कि मानव टी सेल गतिविधि को दबा सकते हैं के लिए एक में विवो दमन परख के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, स्टॉकिस एट अल.14 ने विवो में ट्रेग दमनकारी गतिविधि पर integrin के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए xenoGVHD मॉडल का उपयोग किया। इस प्रकार, xenoGVHD मॉडल एक में vivo सेटिंग में टी कोशिकाओं को लक्षित किसी भी चिकित्सा के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.

इस प्रोटोकॉल में वर्णित एक अतिरिक्त विधि है कि कैसे माउस ऊतकों में मानव टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए डिजिटल polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (dPCR) का उपयोग कर. इस विधि का लक्ष्य लक्ष्य ऊतकों में प्रवास और टी कोशिकाओं के प्रसार की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक उपकरण की पेशकश करना है, जो इस मॉडल में परीक्षण किया जा रहा इम्यूनोसप्रेसिव उपचार की प्रभावकारिता को मापते हैं। डीपीसीआर न्यूक्लिक अम्लों15के परिमाणीकरण के लिए एक अपेक्षाकृत नवीन विधि है। संक्षेप में, PCR प्रतिक्रिया मिश्रण विभाजन है कि लक्ष्य अनुक्रम या बिल्कुल भी कोई लक्ष्य की छोटी संख्या होते हैं में विभाजित है. लक्ष्य अनुक्रम तो प्रवर्धित और डीएनए intercalating रंगों या फ्लोरोसेंट लक्ष्य विशेष जांच का उपयोग कर पता चला है. डीपीसीआर सकारात्मक विभाजन और Poison के आँकड़े15,16के अंश के आधार पर लक्ष्य अनुक्रम की प्रतियों की संख्या का परिमाण निर्धारित करता है। dPCR के साथ टी कोशिकाओं का पता लगाने के प्रवाह साइटोमेट्री और ऊतक विज्ञान सहित अन्य वैकल्पिक तरीकों के साथ तुलना में बहुत कम ऊतक की आवश्यकता है, और जमे हुए या निश्चित ऊतक पर किया जा सकता है. dPCR प्रतिलिपि संख्याओं को निर्धारित करने के लिए एक मानक वक्र की आवश्यकता नहीं है, और न ही तकनीकी प्रतिकृतियां आवश्यक हैं। यह पारंपरिक मात्रात्मक पीसीआर (QPCR)16की तुलना में dPCR के लिए आवश्यक अभिकर्मक और टेम्पलेट डीएनए की मात्रा कम कर देता है। पीसीआर प्रतिक्रिया को डीपीसीआर में उप-प्रतिक्रियाओं में विभाजित करने से लक्ष्य17को प्रभावी ढंग से ध्यान केंद्रित किया जाता है। इस प्रकार, डीपीसीआर मुख्य रूप से गैर-लक्ष्य डीएनए की एक बड़ी राशि में दुर्लभ लक्ष्यों का पता लगाने के लिए एक उपकरण है। उदाहरण के लिए , डीपीसीआर का उपयोगदूध में जीवाणु संदूषण का पता लगाने के लिए किया जा रहा है 18 , एस्ट्रोजन रिसेप्टर जीन 19 में दुर्लभ उत्परिवर्तनों की पहचान करना और रोगियों के रक्त में ट्यूमर डीएनए का पता लगाने के लिए20. इस प्रोटोकॉल में, dPCR का पता लगाने और xoGVHD के साथ चूहों के ऊतकों में मानव टी कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक कुशल उपकरण के रूप में कार्य करता है.

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Protocol

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सभी माउस प्रयोगों के अनुपालन में प्रदर्शन किया गया, और से अनुमोदन के साथ, कान्सास मेडिकल सेंटर संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय. सभी स्वस्थ मानव रक्त के नमूने सूचित सहमति के तहत और कान्सास मेडिकल सेंटर विश्वविद्यालय में संस्थागत समीक्षा बोर्ड से अनुमोदन के साथ प्राप्त किए गए थे।

1. एनएसजी चूहे का विकिरण

  1. PBMC इंजेक्शन से पहले एक दिन, विकिरण 8-12 सप्ताह पुराने NSG चूहों (या तो सेक्स इस्तेमाल किया जा सकता है). एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट में, चूहों को एक बाँझ पाई पिंजरे या माइक्रोइसोलेटर में रखें। एक Cs137 स्रोत या छोटे पशु विकिरणक में विकिरण चूहों (जैसे, रुपये 2000) धीमी गति से रोटेशन के साथ 150 cGy की कुल खुराक के साथ भी विकिरण सुनिश्चित करने के लिए.
  2. चूहों को एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट में साफ पिंजरों में रखें।

2. इंजेक्शन के लिए मानव पीबीएमसी की तैयारी

  1. माउस प्रति 1.1 x 107 PBMC को अलग करने के लिए पर्याप्त स्वस्थ मानव रक्त लीजिए. फॉस्फेट बफर ्ड नमकीन (पीबीएस) में 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) की एक समान मात्रा में heparinized रक्त को पतला।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के साथ, PMBC उपज आम तौर पर है 0.5-1 x 107 पूरे रक्त के प्रति 10 एमएल. प्रत्येक माउस को पीबीएस के 100 डिग्री एल में 107 पीबीएमसी प्राप्त होगा। अतिरिक्त 1 x 106 में 10 डिग्री सेल्सियस प्रति माउस सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक माउस PBMC की पूरी खुराक प्राप्त करता है, सिरिंजों को भरने के साथ कोई समस्या होनी चाहिए.
  2. एक 50 एमएल शंकु ट्यूब के लिए 15 एमएल लिम्फोसाइट जुदाई घनत्व ढाल मध्यम (उदा., फिकॉल) जोड़ें और फिर ध्यान से घनत्व ढाल के शीर्ष पर पतला रक्त के 25 एमएल तक ओवरले। ब्रेक के बिना कमरे के तापमान पर 40 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर घनत्व ढाल और पतला रक्त युक्त ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. एक 50 एमएल शंकु ट्यूब में पीबीएस के 10 एमएल में PBMC इंटरफ़ेस हार्वेस्ट. 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनेंट को निकालें।
  4. ट्यूब flicking द्वारा ढीला गोली और 10 एमएल पीबीएस में resuspend PBMC धोने के लिए. 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. (वैकल्पिक) अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम (ACK) lysis बफर कि गोली मात्रा के बराबर है की एक मात्रा जोड़कर सेल गोली में supernatant और lyse लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) को छोड़ दें। धीरे से गोली resuspend और 30-60 s. सीरम मुक्त RPMI मीडिया के साथ ट्यूब भरें और 5 मिनट के लिए 400 x g पर ट्यूब centrifuge के लिए ट्यूब घूमता है.
  6. सुपरनेंट निकालें और पीबीएस के 5 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। एक हेमोसाइटोमीटर और एक माइक्रोस्कोप के साथ trypan नीले बहिष्करण का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना.
  7. 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनेंट निकालें और पीबीएस में 1 x 108 कोशिकाओं/एमएल पर कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।

3. चूहों में मानव पीबीएमसी के रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन21

  1. बाँझपन बनाए रखने के लिए एक स्तरीय प्रवाह हुड में एक संज्ञाहरण कक्ष रखें। पूर्व प्रभारी 5% आइसोलुरेन के साथ संज्ञाहरण कक्ष और 5 मिनट के लिए 1 एल /
  2. isoflurane को कम करने के लिए 2% और संज्ञाहरण कक्ष में एक ही पिंजरे से चूहों डाल दिया. एक बार चूहों सही खो देते हैं, कक्ष में 5 मिनट के लिए चूहों anesthetize. इस समय के दौरान, सेल निलंबन के 100 जेडएल (1 x 107 कोशिकाओं) के साथ प्री-फिल सिरिंज।
  3. संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए नाक शंकु में अपनी नाक के साथ एक हीटिंग पैड पर माउस रखें। एक पैर पैड pinching और पलटा की कमी के लिए जाँच करके चेतना के नुकसान के लिए जाँच करें.
  4. अंगूठे और मध्यम उंगली के साथ माउस को नियंत्रित करें। 28 जी 1/2 को सुई में डालें, जो कि नीचे की ओर से मध्य कैंथस के लिए, कंजंक्टिव झिल्ली के माध्यम से तब तक डालें जब तक कि आंख का पिछला हिस्सा नहीं पहुंच जाता। सुई को थोड़ा पीछे हटा लें और धीरे-धीरे कोशिकाओं का 100 डिग्री सेल्सियस इंजेक्ट करें (1 x 107 कोशिकाएं)।
  5. पूरी तरह से सुई वापस लेने और ठीक से सिरिंज और सुई के निपटान. पलक बंद करें और एक धुंध स्पंज के साथ इंजेक्शन साइट के लिए हल्के दबाव लागू होते हैं।
  6. सूजन या अन्य दृश्य मान आघात के लिए इंजेक्शन साइट की जांच करें। घर पिंजरे में जाने से पहले बिस्तर की आकांक्षा को रोकने के लिए कागज तौलिए के साथ लाइन में खड़ा एक बाँझ पिंजरे में चेतना हासिल करने के लिए माउस की अनुमति दें। किसी भी खून बह रहा बंद कर दिया है के बाद, analgesia के लिए आंख के लिए proparacaine की एक बूंद लागू होते हैं।
    नोट: पूंछ नस इंजेक्शन इस प्रोटोकॉल के लिए PBMC के अंतःशिरा इंजेक्शन का एक वैकल्पिक तरीका है के रूप में Macholz एट अल द्वारा वर्णित22.

4. चूहे में तीव्र जीवीएचडी का नैदानिक स्कोरिंग (चित्र 1)23

  1. उपाय GVHD हर दूसरे दिन स्कोर जब तक चूहों बलिदान के दिन तक एक 2 और फिर हर दिन के स्कोर तक पहुँचने.
    1. एक laminar प्रवाह हुड में पिंजरे प्लेस, भोजन और पानी को हटाने और ढक्कन पर वापस डाल दिया. 5 मिनट के लिए चूहों को देख कर गतिविधि स्कोर और इस प्रकार के रूप में स्कोर आवंटित: 0 ] माउस एक दो मिनट के भीतर चलना शुरू होता है और पिंजरे के चारों ओर घूमना रहता है, 1 ] माउस एक दो मिनट से अधिक लगता है उठो और पिंजरे के चारों ओर धीरे धीरे चलता है, 2 ] माउस में नहीं मिलता है 5 मिनट और केवल चलता है जब छुआ.
  2. एक गिलास बीकर में प्रत्येक माउस वजन और एक वजन घटाने स्कोर दे: 0 [ और lt;10% परिवर्तन, 1 ] 10-25% परिवर्तन और 2 ] gt;25% परिवर्तन.
  3. जबकि माउस बीकर में अभी भी है, आसनके लिए निरीक्षण: 0 ] सामान्य, 1 ] आराम में hunching, 2 ] hunching आंदोलन ख़राब; फरबनावट: 0 ] सामान्य, 1 ] हल्के से मध्यम ruffling, 2 - गंभीर ruffling, और त्वचा अखंडता: 0 ] सामान्य, पंजे के 1 ] स्केलिंग /
  4. पांच श्रेणियों और प्रत्येक श्रेणी के लिए 0-2 के स्कोर के साथ, एक माउस 10 के एक अधिकतम स्कोर तक पहुँच सकते हैं. जब एक माउस 7 या अधिक से अधिक के स्कोर तक पहुँचता है या 42 दिनों के बाद इंजेक्शन तक पहुँचता है, सीओ2 इच्छामृत्यु या अन्य विधि स्थानीय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित के माध्यम से माउस ethanize.
    नोट: परिणामों की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, स्कोरिंग एक शोधकर्ता जो उपचार समूहों24के लिए अंधा है द्वारा किया जाता है। इसके अतिरिक्त, हालांकि शरीर के वजन घटाने के 20% कई IACUC प्रोटोकॉल के लिए अनुशंसित मानवीय समापन बिंदु है, इस प्रोटोकॉल के अतिरिक्त औचित्य IACUC अनुमोदन के साथ प्राप्त किया जा सकता है.

5. यूथेनाइज्ड चूहों से जीनोमिक डीएनए के लिए कटाई ऊतकऔर जीनोमिक डीएनए को अलग-थलग करना

  1. बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों का उपयोग कर चूहों को अलग करना। ब्याज के एक अंग से आकार में 3 मिमी x 0.5 मिमी के बारे में ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा कट, जैसे, फेफड़े, जिगर, या तिल्ली. ऊतक के नमूने का वजन करें और ऊतक के टुकड़े को 1.5 एमएल ट्यूब में रखें। यदि कई ऊतकों का संग्रह, प्रत्येक अंग काटने के बीच इथेनॉल के साथ उपकरण धोने.
  2. तरल नाइट्रोजन में ऊतक युक्त ट्यूबों को जलमग्न करके ऊतकों को फ्रीज करें जब तक कि यह बुदबुदाने और रात में -80 डिग्री सेल्सियस में स्टोर नहीं कर देता। ऊतक के नमूने thaw और उन्हें एक जीनोमिक डीएनए (gDNA) अलगाव किट के अनुसार lyse.
  3. किट में वर्णित के रूप में निर्माता के निर्देशों के अनुसार जीनोमिक डीएनए अलग करें। ऊतक की मात्रा है कि eluted gDNA के माइक्रोलीटर प्रति संसाधित किया गया था ध्यान दें करने के लिए सुनिश्चित करें (mg/$L).
    नोट: जमे हुए ऊतकों को बाद में प्रसंस्करण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

6. डिजिटल पीसीआर का उपयोग कर मानव टी कोशिकाओं की मात्रा (चित्र 2)

  1. इस्तेमाल किया जा रहा डिजिटल पीसीआर मशीन के लिए डीएनए बाइंडिंग रंगों के लिए प्रोटोकॉल के अनुसार डिजिटल पीसीआर प्रतिक्रियाओं को तैयार करें। मानव CD3 epsilon जीनोमिक डीएनए के लिए विशिष्ट निम्नलिखित प्राइमर का उपयोग करें (NCBI संदर्भ अनुक्रम: NG$007383.1); फॉरवर्ड प्राइमर: AGGCTGCTAACTCCAAG, रिवर्स प्राइमर: GCCCTACCCGTGTGGAAAC. इन प्राइमर 105 बीपी का एक एकल बैंड उपज होगी.
    नोट: जीनोमिक डीएनए को पचाने के लिए प्रत्येक प्रतिक्रिया में एक प्रतिबंध एंजाइम, जैसे हिंडIII का 0.5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों की जुदाई का अनुकूलन करने के लिए अलग gDNA कमजोर पड़ने का परीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें। इसके अतिरिक्त, घुसपैठ टी कोशिकाओं का एक सबसेट गैर-रोगजनक नियामक टी कोशिकाओं हो सकता है। इन कोशिकाओं को नियामक टी सेल मार्करों के लिए अतिरिक्त प्राइमर का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.
  2. निम्नलिखित परिस्थितियों के तहत डिजिटल पीसीआर प्रतिक्रिया बाहर ले: 105 डिग्री सेल्सियस पर लिड, 10 मिनट (1 चक्र) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, रैंप 2 डिग्री सेल्सियस और 55 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 मिनट, रैंप 2 डिग्री सेल्सियस / 10 मिनट, 12 डिग्री सेल्सियस पकड़ के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
    नोट: इन पैरामीटर डिजिटल PCR उपकरण के आधार पर समायोजित करने के लिए आवश्यकता हो सकती है।
  3. विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ डिजिटल पीसीआर डेटा प्राप्त करें। निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करते हुए ऊतक की प्रति मिलीग्राम प्रति प्रति मिलीग्राम प्रति प्रति प्रतिव्यक्तियों की संख्या के रूप में डेटा की रिपोर्ट करें: (प्रतियों की संख्या/जेडएल) ग (प्रतिक्रिया में gDNA का $L) x (डिल्यूशन फैक्टर) /(कुल gDNA के ऊतक/जेडएल की मिलीग्राम )

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Representative Results

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Sublethally विकिरणित 8-12 सप्ताह पुराने दोनों लिंगों कि मानव PBMC प्राप्त की NSG चूहों दिन के आसपास GVHD के नैदानिक लक्षण प्रदर्शित शुरू कर दिया 10 पोस्ट इंजेक्शन नकारात्मक नियंत्रण चूहों कि पीबीएस केवल प्राप्त की तुलना में (चित्र 1A) XenoGVHD चूहों 23.5 दिनों की एक औसत अस्तित्व था (चित्र 1B) डिजिटल पीसीआर के साथ, CD3 एप्सिलॉन सकारात्मक मानव टी कोशिकाओं चूहों कि मानव PBMC प्राप्त के फेफड़ों और जिगर के नमूनों में पाया जा सकता है. पीबीएस के साथ इंजेक्ट किए गए चूहों के ऊतक नमूनों का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया गया (चित्र 2) ।

Figure 1
चित्रा 1: GVHD रोग प्रगति. सबलेटली विकिरणित 8-12-सप्ताह पुराने पुरुष और महिला एनएसजी चूहों को एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 1 x 107 मानव पीबीएमसी (एन जेड 6) या पीबीएस (एन जेड 4) के साथ रेट्रो-ऑर्बिटलली इंजेक्शन दिया गया था। दिखाए गए डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के संयुक्त परिणाम हैं. (ए) जीवीएचडी स्कोर हर दूसरे दिन मापा गया था जब तक चूहों बलिदान के दिन तक एक 2 और फिर हर दिन के स्कोर तक पहुँच गया. GVHD स्कोर के लिए प्रत्येक समय बिंदु पर रिपोर्ट डेटा प्रत्येक समूह में किसी भी मृत चूहों के अंतिम स्कोर के साथ संयुक्त लाइव चूहों का मतलब है - SEM स्कोर. * पी एंड एलटी; 0.05 के रूप में मान Whitney यू परीक्षण द्वारा निर्धारित. (बी) अस्तित्व की Kaplan-Meier वक्र. मौत के रूप में चिह्नित किया गया था जब GVHD स्कोर $ 7 था. * पी और 0.05 लॉग रैंक परीक्षण द्वारा निर्धारित के रूप में। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: डिजिटल पीसीआर का उपयोग कर मानव टी कोशिकाओं का पता लगाना. फेफड़ों और जिगर के नमूने चूहों से एकत्र किए गए थे कि पीबीएस के साथ रेट्रो-ऑर्बिटलली इंजेक्शन थे (एन $ 3) या 1 x 107 मानव PBMC (एन ] 3) जब चूहों $ 7 या 42 दिनों के बाद इंजेक्शन के एक GVHD स्कोर तक पहुँच गया. डेटा 3 स्वतंत्र प्रयोगों से एकत्र किए गए थे. gDNA अलग किया गया था और डिजिटल पीसीआर ऊतक के मिलीग्राम प्रति मानव CD3 एप्सिलॉन की प्रतियां निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. () प्रतिनिधि डिजिटल पीसीआर साजिश फेफड़ों और जिगर के नमूने पीबीएस या PBMC के साथ इंजेक्शन माउस से. (बी) पीबीएस या पीबीएम सी एम सी के साथ इंजेक्ट किए गए चूहों से ऊतक के प्रति मिलग्राम मानव सीडी 3 एप्सिलॉन की प्रतियों का परिमाणीकरण। * पी $ 0.05 के रूप में मान Whitney यू परीक्षण द्वारा निर्धारित. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

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रोग प्रगति आम तौर पर xenoGVHD मॉडल में संगत है, यहां तक कि विभिन्न दाताओं से PBMC के इंजेक्शन के साथ, तो कई प्रयोगों को जोड़ा जा सकता है. इस स्थिरता को बनाए रखने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण कदम उचित i.v. इंजेक्शन तकनीक, अंधा कर रहे हैं और लगातार स्कोरिंग कर रहे हैं। Nervi एट अल द्वारा एक अध्ययन25 प्रदर्शन किया है कि अंतःशिरा पूंछ नस इंजेक्शन की तुलना में, PBMC के रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन अधिक सुसंगत engraftment और अधिक गंभीर GVHD में हुई. Leon-Rico एट अल.26 भी प्रदर्शन किया है कि रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन पूंछ नस इंजेक्शन की तुलना में चूहों में अधिक सुसंगत hematopoietic स्टेम सेल engraftment में हुई. हालांकि, यदि आवश्यक हो, पूंछ नस इंजेक्शन xenoGVHD मॉडल27,28,29में एक वैकल्पिक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

पूंछ नस इंजेक्शन के साथ जुड़े परिणामों की परिवर्तनशीलता की समस्या विषयों की संख्या में वृद्धि से कम किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, यह महत्वपूर्ण है कि चूहों स्कोरिंग व्यक्ति इस तरह की गतिविधि या फर बनावट के रूप में अधिक व्यक्तिपरक मानदंडों के स्कोरिंग में पूर्वाग्रह से बचने के लिए माउस उपचार के लिए अंधा है. क्लिनिक24में अंधा जीवीएचडी स्कोरिंग के महत्व का भी प्रदर्शन किया गया है . चूहों का इंजेक्शन लगाने वाला व्यक्ति चूहों को स्कोर करने वाला एक ही व्यक्ति नहीं होना चाहिए। यदि यह संभव नहीं है, नियंत्रण और उपचार ट्यूबों यादृच्छिक किया जा सकता है और किसी अन्य व्यक्ति द्वारा नई आईडी के साथ लेबल (यानी, नियंत्रण ए है, उपचार बी है) तो इंजेक्शन अंधा किया जा सकता है. माउस स्कोरिंग हर दिन एक ही समय के आसपास और एक ही दिन के बाद इंजेक्शन विभिन्न प्रयोगों के बीच प्रदर्शन किया जाना चाहिए.

इस मॉडल में एक संभावित बाधा जीवएचडी विकास की कमी है। यह पीबीएमसी की कम व्यवहार्यता के कारण हो सकता है जिसे ट्रिपन ब्लू के साथ गिनती कक्षों द्वारा पीबीएमसी की व्यवहार्यता की जांच करके संबोधित किया जा सकता है। यदि सेल व्यवहार्यता के साथ परेशानी का सामना करना पड़ता है, कोशिकाओं PBS में रखा जा सकता है 2% FBS के साथ पूरक अस्तित्व में सुधार करने के लिए. इसके अलावा, कम चूहों समय कोशिकाओं कमरे के तापमान पर बैठने को कम करने के लिए एक समय में इंजेक्शन किया जा सकता है. रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन की प्रभावकारिता समस्या हो सकती है। चूहे कि PBMC के साथ इंजेक्शन लेकिन GVHD विकसित नहीं करते हैं euthanized किया जा सकता है और प्रतिरक्षा कोशिकाओं उनके तिल्ली से अलग dPCR या प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से मानव कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए विश्लेषण किया जा सकता है. यदि वहाँ गरीब engraftment है, तो वहाँ की संभावना इंजेक्शन तकनीक के साथ एक समस्या है. इंजेक्शन तकनीक के एक परीक्षण के रूप में, चूहों इवांस नीले रंग के 200 डिग्री एल के साथ रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन किया जा सकता है। यदि इंजेक्शन सफल होता है, तो माउस के कान, पंजे और पूंछ नीले हो जाएंगे।

xenoGVHD मॉडल बारीकी से मानव तीव्र जीवएचडी रोग रोगजनन और प्रगति30नकल करता है. Murine MHC बेमेल GVHD मॉडल के विपरीत, xenoGVHD मॉडल murine कोशिकाओं के बजाय मानव कोशिकाओं पर, मानव सेल चिकित्सा सहित इम्यूनोसप्रेसिव चिकित्सा के प्रभाव के परीक्षण की अनुमति देता है. यह क्लिनिक के लिए अनुसंधान परिणामों को लागू करते समय प्रजातियों के अंतर के कारण भिन्नता कम कर देता है। xenoGVHD मॉडल भी टी सेल अनुसंधान के अन्य क्षेत्रों में एक में विवो दमन परख के रूप में सेवा कर सकते हैं. इस प्रकार, xenoGVHD मॉडल का उपयोग प्रयोगों से परिणाम GVHD के अलावा किसी भी मानव टी सेल मध्यस्थता भड़काऊ रोग के लिए लागू किया जा सकता है.

xenoGVHD मॉडल की सीमाएं हैं। ये प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता और क्लिनिक की तुलना में जीवीएचडी उपचार में संभव मतभेद शामिल हैं. प्रायोगिक विसंगतियों माउस तनाव में मतभेद से स्टेम कर सकते हैं, PBMC इंजेक्शन की साइटों, विकिरण खुराक और माइक्रोबियल पर्यावरण30,31. इस प्रकार, इस मॉडल का उपयोग करने वाली प्रयोगशालाओं को संगत परिणामों को सुनिश्चित करने के लिए इन पैरामीटरों का मानकीकरण करने का प्रयास करना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, हम स्कोरिंग विधियों का वर्णन करते हैं जो स्कोरिंग में परिवर्तनशीलता को कम करने में मदद करते हैं. नैदानिक परिणामों के लिए विदेशी जीवीएचडी डेटा की तुलनीयता को सीमित करने वाले कारकों में जीवीएचडी रोगनिरोधी दवाओं के साथ उपचारित नियंत्रण समूहों की कमी और विदेशी जीवीएचडी मॉडल31में कंडीशनिंग के एकमात्र स्रोत के रूप में विकिरण का उपयोग शामिल है। इसके अतिरिक्त, xenoGVHD की तंत्र पूरी तरह से मानव जीवीएचडी में अंतर्निहित रोगजनन recapitulate नहीं करता है। उदाहरण के लिए, यह दाता APCs के बजाय मेजबान APCs है कि exoGVHD मॉडल में मानव टी कोशिकाओं को सक्रिय है, जबकि मेजबान APCs मानव GVHD7में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. इस प्रकार, सबसे पूर्व नैदानिक मॉडल के साथ के रूप में, वहाँ incompatibilities xenoGVHD और मानव जीवीएचडी के बीच है कि क्लिनिक के लिए xenoGVHD से उत्पन्न डेटा के आवेदन को सीमित कर सकते हैं.

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Disclosures

ब्याज का कोई संघर्ष घोषित नहीं किया गया।

Acknowledgments

हम इन प्रयोगों में इस्तेमाल डिजिटल पीसीआर मशीन प्रदान करने के लिए लेन Christenson की प्रयोगशाला स्वीकार करना चाहते हैं और तकनीकी सहायता प्रदान की. हम डॉ थॉमस यांकी को उनके मार्गदर्शन और सलाह के लिए भी धन्यवाद देना चाहेंगे। इन अध्ययनों Tripp परिवार फाउंडेशन द्वारा समर्थित थे.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL eppendorf tubes Fisher 05-408-129
10 mL serological pipet VWR International 89130-898
10mL BD Vacutainers - Green capped with Sodium Heparin Becton Dickinson 366480
250 µL Ranin pipette tips Rainin 17001118 Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
50 mL conical tube VWR International 89039-656
96-Well ddPCR plate Bio-Rad 12001925
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer Lonza 10-548E Optional
Alcohol Wipes Fisher Scientific 6818
Anesthesia Chamber World Precision Instruments EZ-178 Provided by animal facility
Anesthesia Machine Parkland Scientific PM1002 Provided by animal facility
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set Becton Dickinson 367281
DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator Bio-Rad 1864007
DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O Life Technologies 1811318
Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology Sigma-Aldrich E7023-500ML
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150
Ficoll Fisher Scientific 45001750
Insulin Syringe Fisher Scientific 329424
Isoflurane Sigma-Aldrich CDS019936 Provided by animal facility
Liquid nitrogen N/A N/A
Mouse Irradiator Pie Cage Braintree Scientific, Inc. MPC 1 Holds up to 11 mice
Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4") Fisher Scientific 19-027-761
P1000 pipetman MidSci A-1000
P200 pipetman MidSci A-200
Pierceable Foil Heat Seal Bio-Rad 1814040
Pipetaid Gilson Macroman Fisher Scientific F110756
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ Rainin 17013805 Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit Qiagen 69506
qPCR plates VWR International 89218-292
QX200 Droplet Digital PCR System Bio-Rad 12001925 Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications
QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen Bio-Rad 1864006
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix Bio-Rad 1864033
RNase and DNase-free plate seal Thermo Scientific 12565491
RPMI Advanced 1640 Life Technologies 12633012
Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply) Fisher Scientific 67522
Sterile Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 21040CV
Sterile reservoir VWR International 89094-662
Surgial Scissors Kent Scientific INS600393-4
Surgical Forceps Kent Scientific INS650914-4

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References

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डिजिटल पीसीआर का उपयोग करके माउस टिश्यू में जेनियोनिक मेरिन मॉडल और मानव टी सेल के क्वांटिफिकेशन में ग्रेफ्ट-वर्सस-होस्ट रोग का प्रेरण और स्कोरिंग
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Seng, A., Markiewicz, M. A. Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR. J. Vis. Exp. (147), e59107, doi:10.3791/59107 (2019).More

Seng, A., Markiewicz, M. A. Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR. J. Vis. Exp. (147), e59107, doi:10.3791/59107 (2019).

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