Her presenterer vi en protokoll for sekvensiell målrettet kvantifisering og ikke-målrettede analyse av fluorholdige forbindelser i vannet ved massespektrometri. Denne metoden gir kvantitative kjent fluorochemical forbindelser og identifiserer ukjente kjemikalier i relaterte prøver med semi kvantitative beregninger av sin overflod.
Historiske og nye per- og polyfluoroalkyl stoffer (PFASs) har fått betydelig interesse fra de offentlige og offentlige organer fra lokale til føderale nivåer. Fortsetter utviklingen av PFAS kjemikalier presenterer en utfordring å miljøovervåking, der pågående utvikling av målrettede metoder nødvendigvis etterslep oppdagelsen av nye kjemiske forbindelser. Det er behov, derfor har fremtidsrettede metoder som kan oppdage nye og uventede forbindelser, overvåker disse arter over tid og løse detaljer om sin kjemiske struktur for å muliggjøre fremtidig arbeid i helse. Dette ikke-målrettede analyse av høyoppløselige massespektrometri tilbyr en bred base oppdagelsen tilnærming som kan kombineres med nesten alle prøve forberedelse ordningen og gir betydelige muligheter for sammensatte identifikasjon etter. Her, vi beskriver en solid-fase utvinning (SPE) basert eksempel konsentrasjon metode innstilt for kortere kjede og mer hydrofile PFAS kjemikalier, som per fluorholdige Eter syrer og sulfonates, og beskriver analyse av prøver forberedt på denne måten i både målrettet og ikke-målrettede moduser. Målrettede metoder gir overlegen kvantifisering når referanse standarder er tilgjengelig, men er egentlig begrenset til forventet forbindelser når utføre analyse. I kontrast, kan en ikke-målrettede tilnærming identifisere tilstedeværelsen av uventede forbindelser og gi litt informasjon om sin kjemiske struktur. Informasjon om kjemisk funksjoner kan brukes til å koordinere forbindelser over eksempel steder og spore overflod og forekomst over tid.
Klasse per- og polyfluoroalkyl stoffer (PFASs) er Persistente organiske miljøgifter med betydelig folkehelseproblem. Den spesifikke forbindelser perfluorooctanoic acid (PFOA) og perfluorooctanesulfonate (PFOS) har drikkevann helse rådgivende nivåer satt av EPA1,2 og store amerikanske produksjonen opphørte i 2000-tallet3,4 . Blitt for å få en betydelig forståelse for egenskapene til PFAS i tekstil og forbruker produktet produksjon kuler, hundrevis, om ikke tusenvis, av alternative PFAS kjemikalier har utviklet materiale for å fylle produktet nisjer, inkludert erstatning for Avskrevne forbindelser5,6,7,8. Det er en pågående må overvåke miljø nivåer av rett kjeden perfluorinated karboksylsyre og sulfonates slike PFOS, PFOA og deres relaterte homologe serien, men nye kjemiske forbindelser dekkes ikke av etablerte metoder som EPA Metoden 5379 og ofte mangel analytisk standarder for tradisjonelle målrettet analyse. Hensikten med denne protokollen er todelt. Det gir en sti for målrettet LC–MS-/ MS analyse av fluorochemical Art i vann der analytisk standarder er tilgjengelige og detaljer sømløs integrering av en ikke-målrettede, høyoppløselige masse massespektrometri tilnærming for dataanalyse som gjør det mulig for gjenkjenning av ukjente eller uventede forbindelser i samme prøvene.
Solid-fase utvinning (SPE) er en etablert teknikk for eksempel opprydding og konsentrasjon med programmer og mange matriser10,11-med analytter og utvalg. For PFAS analyse, flere solid retentive faser inkludert ikke-polar functionalized polar og ionebytte kolonner er brukt forskjellig grad for underklasser av fluorholdige arter i en rekke matriser9,12, 13,14,15,16. Fremskritt innen SPE eksempel analyse med on-line oppsett sterkt øker gjennomstrømningen av tilnærming og forbedre reproduserbarhet eksempel håndtering, men den grunnleggende prosessen forblir konsekvent17. Noen innsats for å fjerne frakoblede konsentrasjonen av SPE med stort volum injeksjoner har også gjort, men dette krever endringer i kromatografi som plasserer dem utenfor riket av casual analysen18,19 . Vår eksempel analyse bruker en polymere svak anion exchange (voks) retentive fase grundig skille Sure PFAS materialer fra tradisjonelle organiske forurensninger mens de oppnår betydelige eksempel konsentrasjon faktorer. Dette voks er viktig å ta den korte kjede perfluorinated syren som perfluorobutane sulfonate (PFBS) eller perfluorinated etere som hexafluoropropylene oksid dimer syre (HFPO-DA) som er mer polar enn den lengre kjede eldre perfluorinated arter20,21. Som det har vært en betydelig omlegging mot kortere fluorholdige kjeder og Eter inkludering i siste PFAS kjemi5, kan denne fasen utvalget grundigere utvinning av romanen forbindelser for MS analyse.
Målrettet LC–MS-/ MS kvantifisering bruke godkjente standarder og stabil isotop merket interne standarder gir en enestående grad av spesifisitet og følsomhet for kvantitativ analyse. Mens dette er ønskelig i mange situasjoner, er det upraktisk for alle-også-felles situasjoner i analysen. Målrettede tilnærminger fungerer bare for arter som forventes i utvalget og hvilke metoder har tidligere blitt etablert. For nye og kommende forbindelser, denne tilnærmingen er i stand til å oppdage selv arter som kan være av interesse, uansett deres kjemi eller konsentrasjon, og lav masse spektrometre er nesten i stand til å gi nok informasjon til å gjøre utvetydig kjemiske tildelinger av ukjent forbindelser. Følgelig har feltet ikke-målrettede analyse oppstått, leveraging makten av høyoppløselige moderne masse spektrometre å analysere prøver uten en forutsatte hypotese og tilbakevirkende kraft tilordne kjemikalier til synlig funksjoner i utvalget. Denne tilnærmingen er brukt mye i biologi22,23,24 og miljølære25,26,27 på mange klasser av kjemikalier. Perfluorinated kjemikalier er spesielt enkelt å identifisere i denne metoden på grunn av sin unike masse spectral mønstre, og hundrevis av forbindelser er beskrevet i bare de siste par år5,28.
Protokollen diskutert her er ment å justere målrettet LC–MS-/ MS PFAS kvantifisering med behovet for å identifisere og semi kvantitativt overvåke nye forbindelser av interesse. SPE fasen utvalget og prøve matlaging teknikker er ment å sikre erobringen av mer hydrofile nye PFAS syrer fra vann og kan være mindre egnet for lengre kjede polymere arter og ikke-ioniske arter. Videre dataene som genereres ved ikke-målrettede analyse er tett og av høy dimensionality, som nødvendiggjør bruk av dataanalyse programvare. Slike programvarepakker er ofte forhandlerspesifikke og kreve endring opererer mellom instrument plattformer. Der det er mulig analyseprosessen har blitt beskrevet i en generisk måte og åpen kilde/freeware alternativer refererer til, men effektiviteten og nøyaktigheten av enhver programvare tilnærming må vurderes enkeltvis.
Eksempel håndtering og forberedelse
Inkludering av referanse/pigg standarder er av overordnet betydning for noen målrettede analyse, som de gir en backstop for avmerker analytisk gyldighet. Mangel på QC prøver hindrer vurdere nøyaktigheten av resultatene; allestedsnærværende natur fluorochemicals betyr at sjansen forurensning av feltet prøver, behandling materialer eller LC-MS systemet er ikke uvanlig og må regnskapsføres. Videre det gir mulighet for validering av protokollen uansett variasjon i daglige prøven behandling, som mange av disse trinnene kan være svært variabel, spesielt SPE og prøve konsentrasjon skritt. Utvinning av både eldre og romanen perfluorinated kjemikalier kan være sterkt påvirket av valg av stasjonære fase for konsentrasjon og komponenter i kilde utvalgene, for eksempel pH og saltholdighet46. Påvirkning av prøven forholdene anses Hvis bestemte klasser av pefluorinated kjemikalier av interesse. Alternative eksempel forberedelse ordninger for vann ekstrakter kan brukes hvis laboratorium er tilgjengelig og nedstrøms dataanalyse forblir lignende.
Målrettet dataanalyse
For forbindelser med tilgjengelig standarder og matchet, stabil isotop merket interne standarder, de primære sakene for dataanalyse er instrumental og fastsetting av metoden oppdagelsen grenser og passende rapportering områder kan bestemmes på en laboratoriet-av-laboratoriet basis benytter standard tilnærminger, som signal til støyforhold fra lavnivå standard toppene47. I fravær av matchet interne standarder feil fra matrix effekter kan oppstå, og nøyaktig tilbake-anslag av piggete prøver kan brukes til å anslå nøyaktigheten av målene. Når mangler standarder for å forberede en kurve, et kvantitativt overslag av en ukjent kan gjøres ved å behandle det likt til en jevn standard sammensatte, men feil i estimatet er på 10 + brett med begrenset evne å kvantifisere usikkerheten, se McCord og Newton Strynar21. I disse tilfellene trenddata kan fortsatt bli samlet, men konsentrasjon er svært lite troverdige.
Ikke-målrettede dataanalyse
Topp plukke innstillinger har en betydelig innvirkning på antall kjemiske funksjoner identifisert, men kvaliteten på funksjonen utvalget er også sterkt påvirket. Vedtak interessepunkter i topp plukke er 1) intensiteten av personlige massene skal inkluderes i spectra, ion overflod terskelen 2) intensiteten av utdraget chromatogram topper vurderes funksjoner, funksjon overflod terskelen 3) funksjonen gjenkjenning frekvens, Repliker terskelen og 4) analytisk variasjon, CV terskelen (Figur 10).
Setter urealistisk lave terskler for topp plukke resultater i en eksponentielle økning i testtiden løse tilleggsfunksjoner stadig lav overflod (Tabell 7). Ion-overflod terskelen filtrene masse spectral funksjoner hvor nok av personlige isotop krillens ikke passerer terskelen. Ideelt velger bare for funksjoner med kvalitet MS spectra, de er virkelig kjemiske funksjoner i stedet for instrumental støy, og tillate formel prediksjon nedstrøms behandling. En riktig terskelen basert på instrumental støy, ideelt minst 3 x støy terskelen for MS1 skanner. Funksjon overflod terskelen filtrerer kjemiske funksjoner basert på intensitet eller området av funksjonen brukt kromatografiske utdraget. Dette trinnet kan avvisning av lav overflod topper, som er vanligvis brukt kromatografiske kvalitet, har høy avvik eller er et resultat av andre dårlig programvare extraction. En riktig terskelen må bestemmes per eksperimentet, og matrise basert på et akseptabelt nivå av dårlig funksjonen generasjon (f.eks funksjoner under terskelen utstillingen uakseptabelt dårlig kromatografi). Videre kan analytisk QC brukes å avvise funksjoner på brukt kromatografiske basert på inkonsekvent identifikasjon i analytisk og/eller forberedende replikat (Repliker terskel) eller basert på dårlig reproduserbarhet replikat (CV terskel). Riktig nivå, avhenger av kvaliteten på topp integrering programvaren brukes og kjemiske enhetene under etterforskning. Vannløselige perfluorinated forbindelser og lett optimalisert integrering protokoller, funksjoner bør identifiseres i 80 + % av analytiske replikerer og CVs forventes å falle under 30%, som beskrevet i avsnittet metoder.
Toppene oppdaget fra ikke-målrettede analyse gir ikke kvantitative beregninger av konsentrasjonen av materialene oppdaget. Videre identiteten til sann ukjente kan være vanskelig å bekrefte fordi romanen forbindelser er fraværende fra offentlig tilgjengelige databaser. Romanen strukturelle besluttsomhet krever omfattende analyse med flere metoder og krever kompetanse i både massespektrometri og kjemi. Normalisere peak områdene kjemiske funksjoner kan imidlertid gi semi kvantitative beregninger av konsentrasjoner av ukjente fra kjente arter21. Hvis konsekvent prøvetaking og forberedelsene er ansatt, kan trend tidsinformasjon for individuelle arter genereres for å overvåke utholdenhet av en kjemisk i fremtiden som svaret for en individuelle arter skal være konsekvent sperring store variasjoner i matrix21.
Hovedfordelen ved denne metoden er utvidelsesmuligheter for prøve behandling å tillate både målrettet og nontargeted. Mens målrettede analyse gir tilsvarende eller bedre kvantitativ informasjon, mangler det sterkt bredden av analyse ønsket når du arbeider med nye og kommende materialer, samt deres forhold til matrix materialer. Bruke en målrettet metodikk, eller selv en mistenkt screening metode basert på kjente materialer og begrenset databaser er helt blind for tidligere ubemerket arter, selv om de har vesentlige helseeffekter. Programvaren forbedrer og databaser blir mer robust, vil nøyaktigheten av ukjent ID fortsette å øke, med en samtidig nedgang i gang investering og kompetanse nødvendig å analysere flerdimensjonale dataene denne tilnærming. Data som er generert for tiden er likevel betydelig fremtidig verdi fordi data bank gir innlegg-hoc analyse med nyutviklede programvaren og muliggjør sammenlikning på tvers tid selv om identiteten til en oppdaget sammensatte er foreløpig ukjent.
The authors have nothing to disclose.
US Environmental Protection Agency, gjennom Office for forskning og utvikling, finansiert og klarte forskning beskrevet her. Dette dokumentet har blitt vurdert av US Environmental Protection Agency, Office for forskning og utvikling, og godkjent for publisering. Synspunktene til uttrykk i denne artikkelen er de av forfatterne, og nødvendigvis representerer ikke synspunkter eller politikken av det amerikanske Environmental Protection Agency. Denne forskningen var støttes delvis av en avtale i postdoktor forskning programmet ved det nasjonale eksponering forskningslaboratorium administrert av Oak Ridge Institutt for vitenskap og utdanning gjennom Interagency avtalen DW89992431601 mellom det US Department of Energy og US Environmental Protection Agency.
Acqity ultra-high performance liquid chromatography system | Waters Corporation | Modified with PFCs analysis kit (176001744); equivalent UPLC system is acceptible if PFAS background is checked and confirmed to be low | |
Ammonium acetate | Fluka | 17836 | Mass spectrometry grade >99% pure |
Ammonium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
Balance | Mettler | AB204S | |
BEH C18 reverse phase UPLC column, 2.1×50 mm, 1.7 μm | Waters Corporation | 186002350 | |
Dual piston syringe pump | Waters Corporation | SPC10-C | |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | ARK2183 | |
Glass Microfiber Filters | Whatman | 1820-070 | |
High density polyethelye sample bottle | Nalgene | 2189-0032 | |
High Resolution Mass Spectrometer | Various | Mass Spectrometer should be capable of providing accurate mass to <10ppm and collecting MS/MS data. Agilent 6530 qTOF and Thermo Fisher Orbitrap Fusion were used in this work | |
Methanol | Sigma-Aldrich | ||
Nitric Acid (35% w/w) | Thermo Fisher Scientific | SVCN-5-1 | Can be prepared in house using concentrated nitric acid and reagent water |
Polypropylene Buchner funnel | ACE Glass | 12557-09 | |
Polypropylene cenitrfuge tube and cap | BD Falcon | 352096 | |
Polypropylene Vacuum Flask (1 L) | Nalgene | DS4101-1000 | |
Quattro Premier XE triple quadrupole mass spectrometer | Waters Corporation | Equivalent triple-quadrupole or better system can be used instead, should provide high sensitivity and stability for targeted analysis | |
Reagent Water | Any source determined to be PFAS free | ||
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
TurboVap nitrogen evaporator | Caliper Life Sciences | 103198 | Equivalent systems or rotary vacuum evaporator may be used instead |
Weak anion exchange SPE cartridge (Oasis WAX Plus) | Waters Corporation | 186003519 | |
Standard Solutions | |||
2,3,3,3-Tetrafluoro-2-(1,1,2,2,3,3,3-heptafluoropropoxy)propanoic acid (HFPO-DA) | Wellington | HFPO-DA | |
Additional targeted compound standards of interest | to be determined based on preliminary analysis and standard availability | ||
Mass labeled HFPO-DA | Wellington | M2HFPO-DA | |
Native PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL) | Wellington | PFAC-MXA | or PFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest |
Stable Isotope Labeled PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL) | Wellington | MPFAC-MXA | or MPFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest as appropriate for Native PFASs |
Software | |||
Mass Profiler Professional | Agilent | Or open source software packages | |
Profinder | Agilent | Or open source software packages |