Summary
Nous présentons ici un protocole de quantification ciblée séquentielle et d’analyse indifférenciés de composés fluorés dans l’eau par spectrométrie de masse. Cette méthode fournit des niveaux quantitatifs de composés connus de composés fluorés et identifie des produits chimiques indéterminés dans les exemples associés avec des estimations semi-quantitatives de leur abondance.
Abstract
Historiques et émergents par- et substances polyfluoroalkyle (PFASs) ont suscité d’intérêt significatif depuis les institutions publiques et gouvernementales de l’échelon local au niveau fédéral. L’évolution continue des chimies RFP présente un défi pour la surveillance de l’environnement, où le développement continu des méthodes ciblées accuse nécessairement la découverte de nouveaux composés chimiques. Il faut, par conséquent, d’avoir les méthodologies prospectives qui peuvent détecter des composés nouveaux et inattendus, surveiller ces espèces au fil du temps et régler les détails de leur structure chimique pour permettre de futures à travailler dans la santé humaine. À cette fin, indifférenciés analyse par spectrométrie de masse haute résolution offre une approche large détection de base qui peut être combinée avec presque n’importe quel schéma de préparation d’échantillon et fournit des capacités importantes pour l’identification des composés après détection. Dans les présentes, nous décrivons une méthode de concentration échantillon extraction en phase solide (SPE) basée à l’écoute pour la chaîne plus courte et plus hydrophiles chimies de RFP, tels que par acides éthers fluorés et sulfonates et décrire l’analyse des échantillons préparés de cette façon dans modes ciblés et non ciblés. Méthodes ciblées fournissent quantification supérieure lorsque les normes de référence sont disponibles mais sont intrinsèquement limités aux composés attendus lors de l’exécution de l’analyse. En revanche, une approche non ciblée peut identifier la présence de composés inattendus et fournir des informations sur leur structure chimique. Informations sur les fonctionnalités chimiques permet de corréler des composés dans l’ensemble de points d’échantillonnage et de suivre l’abondance et présence au fil du temps.
Introduction
La classe par- et substances polyfluoroalkyle (PFASs) sont des polluants organiques persistants, avec une préoccupation de santé publique important. Le perfluorooctane (SPFO) et l’acide perfluorooctanoïque (APFO) de composés spécifiques ont l’eau potable santé niveau consultatif fixées par l’EPA1,2 et leur importante production américaine a cessé dans les années 20003,4 . Pour acquérir une compréhension importante pour les propriétés de RFP documents du produit textiles et consommation, fabrication des sphères, des centaines, sinon des milliers d’autres chimies RFP ont été conçus pour combler les niches de produits, y compris le remplacement des les composés désapprouvée5,6,7,8. Il y a un en cours doivent surveiller les concentrations dans l’environnement d’acides perfluorocarboxyliques à chaîne droite et sulfonates telle PFOS, PFOA et leurs séries homologues connexes, mais de nouveaux composés chimiques ne sont pas couverts par des méthodes reconnues telles que l’EPA 537 méthode9 et souvent manque de normes analytiques pour les analyses ciblées traditionnelles. L’intention du présent protocole est donc double. Il fournit une voie pour l’analyse de LC-MS/MS ciblée des espèces de composés fluorés dans l’eau où il existe des normes analytiques et détaille l’intégration transparente d’une approche non ciblée, haute résolution basé sur la spectrométrie de masse pour l’analyse des données qui permet la détection de composés inconnus ou inattendues dans les mêmes échantillons.
Extraction en phase solide (SPE) est une technique établie pour l’échantillon et la concentration des demandes visant plusieurs analytes et échantillon matrices10,11. Pour l’analyse des propositions d’action, plusieurs phases rétentives solides, y compris non polaires, fonctionnalisés polaire et colonnes échangeuses d’ions ont servi à des degrés variables pour les sous-classes d’espèces fluorés dans une grande variété de matrices9,12, 13,14,15,16. Avances dans l’analyse de l’échantillon SPE en utilisant des configurations en ligne grandement augmentent le débit de l’approche et à améliorer la reproductibilité de la manipulation des échantillons, mais le processus fondamental demeure cohérente17. Des efforts pour éliminer la concentration en mode hors connexion de SPE en utilisant des injections de grand volume ont aussi été réalisées, mais elles nécessitent des modifications à la chromatographie qui les exposent en dehors du domaine d’analyse occasionnelle18,19 . Notre analyse de l’échantillon utilise une phase rétentive de polymère anionique faible échange (cire) pour bien séparer les matières acides RFP les contaminants organiques traditionnels tout en réalisant des facteurs de concentration important échantillon. Cette phase de cire est importante de saisir les acides perfluorés à chaîne courte comme le sulfonate de perfluorobutane (PFBS) ou les éthers de perfluorés tels que l’acide dimère oxyde d’hexafluoropropylene (HFPO-DA) qui sont plus polaires que le plus long perfluorés hérités de chaîne espèces de20,21. Comme il y a eu une évolution significative vers des plus courtes chaînes et l’inclusion de l’éther dans le récent RFP chimie5, cette sélection de phase permet une récupération plus complète de nouveaux composés pour analyse par SM.
Quantification de la LC-MS/MS ciblé à l’aide authentifié normes et isotopes stables, intitulée normes internes fournit un niveau inégalé de la spécificité et la sensibilité pour l’analyse quantitative. Bien que cette approche soit souhaitable dans de nombreuses situations, il est impraticable pour les situations de tout-trop-commun dans l’analyse. Approches ciblées fonctionnent uniquement pour les espèces qui sont attendus dans l’échantillon, et pour quelles méthodes ont déjà été établis. Pour les composés nouveaux et émergents, cette approche est incapable de détecter même les espèces qui peuvent être d’intérêt, indépendamment de leur chimie ou de la concentration, et les spectromètres de masse basse résolution sont presque incapables de fournir suffisamment d’informations pour faire sans équivoque affectations chimiques de composés inconnus. Par conséquent, le domaine de l’analyse non ciblés a été soulevée, s’appuyant sur la puissance des spectromètres de masse modernes à haute résolution pour analyser les échantillons sans une hypothèse présupposée et attribuer rétroactivement produits chimiques caractéristiques détectables dans l’échantillon. Cette approche a été largement utilisée dans les domaines de la biologie22,23,24 et sciences de l’environnement25,26,27 sur nombreuses catégories de produits chimiques. Produits chimiques perfluorés sont particulièrement faciles à identifier dans cette méthode en raison de leurs habitudes de spectrométrie de masse uniques, et des centaines de composés ont été décrites dans juste les dernières quelques années5,28.
Le protocole nous discuté vise à aligner ciblée quantification RFP LC-MS/MS avec la nécessité d’identifier et de contrôler semi quantitativement émergents composés d’intérêt. La phase SPE sélection et des techniques de préparation d’échantillon visent à assurer l’intégration des acides plus hydrophiles de RFP émergents de l’eau et peut être moins adaptée pour la plus longue chaîne polymérique espèces et non ioniques. En outre, les données générées par l’analyse indifférenciés sont denses et de haute dimensionnalité, qui nécessite l’utilisation du logiciel d’analyse de données. Ces progiciels sont fréquemment fournisseur spécifique et nécessitent des modifications à opérer entre les plates-formes de l’instrument. Si possible, le processus d’analyse a été décrite de manière générique et alternatives open source/freeware sont référencés, mais l’efficacité et la précision de toute approche de logiciels doivent être évalués sur une base individuelle.
Protocol
1. la collecte d’échantillons d’eau
- Préparation des Stocks Standard RFP
- Préparer un mélange standard de RFP dans du méthanol contenant des composés ciblés d’intérêt (p. ex., PFOA, PFOS, HFPO-DA) à 1 ng/µL. C’est le mélange de RFP Native. Il existe également des mélanges préparés commercialement (c.-à-d. les PFAC Mix A et les B Mix).
- Préparer un mélange standard contenant des isotopes stables correspondant étiqueté composés RFP (SIL) (p. ex., 13C4- PFOA, 13C8- SPFO, 13C3- HFPO-DA) à 1 ng/µL. C’est le mélange de RFP est. Il existe également des mélanges préparés commercialement (c.-à-d., les MPAFC Mix A et les B Mix).
Remarque : Si une version SIL des RFP ciblées n’est pas disponible, une mère porteuse avec longueur semblable de structure et de la chaîne peut être utilisée (p. ex. 13C2- PFHxA pour HFPO-DA)
- Préparation du champ vide (FB), échantillons de Spike blanc (SB)
- Remplir deux, polypropylène propre de haute densité (PEHD) ou bouteilles de polypropylène (PP) avec 1 000 mL de laboratoire désionisée (DI), connus pour être des RFP gratuit.
Attention : Matériaux RFP fréquemment ont indéfinis toxicité et/ou de cancérogénicité. Il faut pour éviter l’exposition orale ou cutanée à des normes ou des solutions mères. - Ajouter une quantité de mélange standard RFP à l’une des bouteilles à une concentration finale équivalente aux concentrations attendues échantillon (par exemple, 100 ng/L). Il s’agit de la Vierge de Spike (SB).
- Ajouter 5 mL d’acide nitrique de 35 % conservateur à la Vierge de Spike.
- Transporter les échantillons SB et le champ enrichit vide à l’emplacement de l’échantillonnage en tant que contrôles.
- Remplir deux, polypropylène propre de haute densité (PEHD) ou bouteilles de polypropylène (PP) avec 1 000 mL de laboratoire désionisée (DI), connus pour être des RFP gratuit.
- Échantillonnage sur le terrain
NOTE : Collecteur d’échantillon devrait porter gants en nitrile et échantillon de systèmes courante lorsque c’est possible. Échantillons de robinet puisse s’écouler et équilibrer avant échantillonnage (2-3 min).- Recueillir 500-1 000 mL d’eau de l’emplacement du champ dans une bouteille propre en PEHD ou PP.
- Ajouter 5 mL d’acide nitrique de 35 % conservateur pour flacons à échantillon et champ vide.
Attention : l’acide nitrique est corrosif et un oxydant fort
2. extraction de l’échantillon
NOTE : RFP est omniprésents et persistants. S’assurer que tous les solvants sont de la plus haute qualité et ont été analysés pour bas niveau contamination de RFP. Rincer abondamment tous les équipements de laboratoire utilisés pour la préparation des normes avant de préparer les témoins et les échantillons.
- Prétraitement de l’échantillon
- Verser chaque échantillon dans un séparé, préalablement nettoyé 1 L PEHD diplômé cylindre et enregistrer le volume exact.
- Ajouter 10 mL de méthanol à la bouteille vide, couronner et secouez bien pour rincer les RFP adsorbé à l’intérieur de la bouteille.
- Retourner l’échantillon d’eau mesurée à la bouteille rincée avec le rinçage méthanolique.
- Courbe d’étalonnage pour le dosage
- Huit, remplir 1 bouteilles L PEHD/PP avec DI pa-libre de l’eau.
- Sélectionner huit concentrations régulièrement espacées, couvrant la gamme de dosage désiré. Par exemple : 10, 25, 50, 100, 250, 500, 750 et 1 000 ng/L pour une gamme de 10-1 000 ng/L.
- Ajouter une quantité de mélange de RFP Native de chaque bouteille pour obtenir les concentrations finales des propositions d’action à la section 2.2.2 (par exemple, 100 µL RFP Mix A à 1L d’eau DI = 100 ng/L).
- Ajout d’un étalon interne
Remarque : Ajout d’isotopes stables étiqueté étalon interne (IS) est nécessaire uniquement si vous désirez les résultats quantitatifs en plus de l’analyse non ciblés.- Ajouter le mélange de RFP est à chaque échantillon à une concentration se rapprochant du point médian de la courbe d’étalonnage (par exemple, 250 µL du mélange est pa = 250 ng/L)
- Filtration
- Filtrer les échantillons à travers des filtres de fibre de verre GF/A (47 mm, taille de pore 1,6 µm) sous vide doux dans une fiole à vide 1 L PEHD préalablement nettoyée.
- Si les particules reste dans la bouteille, rincer à l’eau désionisée supplémentaire dans le filtre. Reverser l’eau filtrée dans la bouteille d’échantillon ou un nouveau conteneur pour l’extraction en phase solide.
- Extraction en phase solide (SPE)
NOTE : Concentration de cartouche décrite ici utilise une pompe à piston débit constant. Autres méthodes de concentration à l’aide d’un collecteur sous vide20 ou une installation en ligne de17 SPE-LC-MS sont possibles mais pas discuté.- Conditionner une cartouche d’échange (cire) anion faible avec 25 mL de méthanol.
- Conditionner la cartouche de cire avec 25 mL d’eau désionisée supplémentaire.
- Position pompe dessiner tubes échantillons filtrés et étiqueter les cartouches SPE avec les noms correspondants d’échantillon.
- Pompe 500 mL de l’échantillon d’eau à travers la cartouche à un débit constant de 10 mL/min (total de 500 mL), mise au rebut accréditives liquide à perdre.
Remarque : Les volumes plus ou moins peuvent être concentrés selon les concentrations de l’échantillon attendu. - Retirez la cartouche de pompe à piston pour l’élution.
Remarque : Si la concentration d’échantillons supplémentaires à l’aide de la même pompe, la pompe à piston doit être rincée avec 25 mL de méthanol avant d’installer la cartouche suivante pour l’équilibration. - Transférer la cartouche SPE à une tubulure de vide et d’équiper avec réservoir en verre externe.
- Rincer les cartouches SPE avec 4 mL de 25 mM, tampon d’acétate de sodium 4.0 pH sous vide doux. Jeter les traversent. Cartouche SPE laver avec 4 mL de méthanol neutre.
Remarque : Le neutre laver fraction peut être collectée si des analytes polaires non ioniques spécifiques sont prévus. Dans le cas contraire, jeter des déchets - Place un tube à centrifuger en polypropylène 15 mL sous chaque cartouche SPE pour recueillir l’éluant. Éluer échantillon avec 4 mL d’hydroxyde d’ammonium 0,1 % dans le méthanol.
- Retirez le tube d’élution et réduire le volume de l’éluat à 500-1 000 µL par évaporation sous courant d’azote sec dans un bain d’eau à une température légèrement élevée (40 ° C).
- Concentré d’échantillon extraits peuvent être stockés avant l’analyse à la température ambiante.
- Dosage de LC-MS/MS ciblé
- Diluer 100 µL de l’échantillon extrait avec 300 µL de tampon d’acétate d’ammonium 2 mM dans un flacon HPLC.
- Calibrer et équilibrer un système HPLC et MS selon les instructions du fabricant.
NOTE : Fond RFP sont souvent détectés en raison de l’utilisation de composants de polymère fluoré de la plupart des systèmes LC et septa flacon échantillon. Confirmer que les niveaux détectables blancs est négligeable avant utilisation. Modification du système LC pour remplacer les composants de téflon est suggérée lorsque c’est possible. L’utilisation d’une colonne analytique de « hold-up » adjacente à la vanne mélangeuse LC est également suggérée29. - Préparer une liste des tâches analytiques consistant en la courbe d’étalonnage, des échantillons et une réplique supplémentaire de la courbe standard pour évaluer la dérive instrumentale dans l’ensemble de la course. Une liste des tâches exemple sont montré dans le tableau 1.
- Analyser les échantillons selon des méthodes LC et MS définies pour les composés ciblés d’intérêt. Le gradient de LC exemple est montré dans le tableau 2 et les paramètres de méthode MS sont indiquées au tableau 3 et tableau 4. On trouvera plus approfondi au McCord et al.,21.
- Générer une courbe d’étalonnage à partir d’échantillons témoins en utilisant le rapport aire des pics de l’analyte à l’étalon interne contre la concentration de l’analyte. Générer une formule de régression quadratique avec 1 / pondération pour la prévision de concentration9x.
- Quantifier les analytes ciblés dans chaque échantillon en utilisant les courbes d’étalonnage préparées et rapport des surfaces (zone standard / zone) pour chaque mesure.
- Si la concentration est supérieure à la gamme d’étalonnage, diluer l’échantillon original avec l’eau distillée, additionné à la concentration appropriée de IS et réextraire pour abaisser la concentration dans la plage appropriée.
- Collecte de données indifférenciés LC-MS/MS
- Diluer 100 µL de l’échantillon extrait avec 300 µL de tampon d’acétate d’ammonium 2 mM dans un flacon HPLC.
- Calibrer et équilibrer une HPLC et haute résolution MS selon les instructions du fabricant.
- Préparer une liste de tâches analytique comme 2.6.2.
- En utilisant le logiciel de l’instrument, collecter des données de LC-MS avec un large balayage MS1 en mode dépendant des données à collecter gradient MS/MS. exemple LC dans le tableau 5. On trouvera dans Strynar et al.,30 et31de la Newton et al., approfondi des paramètres de l’instrument.
Remarque : Pour améliorer SM/SM qualité dépendant des données analyse peut être effectuée avec une liste préférée ion d’un sous-ensemble de fonctionnalités restant après traitement des données dans 2.8.1-2.8.8.
- Traitement de données indifférenciés
Remarque : L’analyse des données peut être effectuée avec une large gamme de logiciels et ces méthodes ne reflètent pas la seule, ou la meilleure méthode pour un ensemble de données arbitraire. Si possible, étapes fournissent une description générique qui peut être effectuée dans le logiciel remplaçant. Traitement de l’exemple de données utilisée dans ce manuscrit a été effectué à l’aide de logiciels spécifiques de fournisseur (1 logiciel et logiciel 2) comme détaillé dans Newton et al.31.- Effectuer l’extraction de caractéristiques moléculaires des caractéristiques chimiques en utilisant l’un de plusieurs logiciels open source software packages32,33 ou du vendeur pour identifier des masses monoisotopique, temps de rétention et des Pits intégrée de produit chimique fonctionnalités.
- Dans le logiciel 1, sélectionnez ajouter/supprimer des fichiers échantillon > ajouter des fichiers et sélectionnez les données brutes de l’expérience non ciblée, puis appuyez sur OK.
- Dans sélectionnez logiciel 1 Batch récursif Feature Extraction > méthode ouverte... de charger une méthode préétablie, ou de modifier manuellement les paramètres du logiciel. Profinder paramètres d’extraction de caractéristiques se trouvent dans le tableau 6.
- 1 logiciel, après extraction de la fonctionnalité, sélectionnez fichier > exporter en CSV..., fichier > exporter comme CEF..., ou fichier > exporter comme PFA... pour un traitement ultérieur. Fichiers CEF sont présumées pour le reste de la description.
- Dans les 2 logiciels (MPP) créer une nouvelle expérience avec Type non identifié et le type de Workflow Assistant importation de données , puis cliquez sur OK.
- MPP, Sélectionnez les fichiers de données et recherchez les résultats du logiciel 1 exportés (CEF ou PFA) à importer ; puis cliquez sur suivant jusqu'à ce que les options de Paramètre d’alignement s’affichent.
- Dans député, les valeurs d’alignement composé à 0.0 (alignement a été déjà réalisée dans l’extraction de la fonctionnalité du logiciel 1, étape 2.8.1.2) puis cliquez sur suivant à travers les étapes jusqu'à ce que la finition est disponible.
- Filtrer les identifications basées sur la reproductibilité analytique. Lorsque plusieurs échantillons sont disponibles, les caractéristiques doivent être présentes dans > 80 % des personne réplique et ont un coefficient de variation (CV) de < 30 % d’analytique
- Dans sélectionnez MPP montage expérimental > expérience groupement et affecter chaque fichier raw un groupe correspondant à l’échantillon d’origine (c'est-à-dire, réplique de la même source doit être dans le même groupe). Plusieurs groupes peuvent être créés correspondant aux variables imbriquées (par exemple, instrumental vs réplicats techniques).
- Dans sélectionnez MPP montage expérimental > interprétation de créer puis sélectionnez le paramètre de l’expérience (c'est-à-dire, groupe) et cliquez sur suivant jusqu'à ce que la finition est disponible. Cela va créer une catégorie qui filtrage futurs peut fonctionner sur.
- Dans sélectionnez MPP contrôle de la qualité > filtre de fréquence. La valeur Entity List Toutes les entités et l’interprétation à l’échantillon créé au point 2.8.2.2 Group(non-averaged), puis cliquez sur suivant.
- Pour des paramètres d’entrée, la valeur de rétention de l’entité à 80 % de l’échantillon au moins une condition, puis cliquez sur suivant jusqu'à ce que la finition est disponible. Nommez la liste filtrée de fréquence caractéristiques
- Dans sélectionnez MPP contrôle de la qualité > filtre sur la variabilité de l’échantillon. Trouve la liste des entités aux fréquences filtrées caractéristiques de 2.8.2.4 et l’interprétation de Group(non-averaged), puis cliquez sur suivant.
- Sélectionnez la case d’option pour les Fichiers RAW et la gamme d’intérêt au Coefficient de variation < 30 %. Cliquez sur suivante > terminer et enregistrez la liste filtrée comme CV.
- Supprimer des fonctionnalités où aucun échantillon n’ont significativement plus élevé (> 3 fois) l’abondance que l’échantillon de champ vide (FB).
- Dans sélectionnez MPP analyse > plier changement. La valeur Entity List CV filtré caractéristiques et l’interprétation à l’échantillon de groupe, puis cliquez sur suivant. Sélectionnez l’option de changement de pli à tous contre seule condition et sélectionnez condition FB ou tout ce qui était le nom du groupe pour l’échantillon traité vide.
- Sur l’écran suivant, la valeur du seuil de pli-changement 3.0 et cliquer pour accéder à la fin des invites. Enregistrer la liste en tant que Liste filtrée de FC.
- Effectuer des comparaisons binaires des échantillons individuels d’intérêt avec un échantillon de fond appropriée (par exemple, en amont vs en aval d’une source ponctuelle) pour déterminer le pli-modifications des caractéristiques chimiques individuelles.
- Dans sélectionnez MPP analyse > filtre sur le Plot du volcan. Définir la liste des entités à la Liste filtrée des FC et de l’interprétation au groupe.
- Pour la condition de pli-changement paire choisir deux échantillons de comparaison (par exemple, un échantillon apparié en amont et en aval) et sélectionnez test Mann-Whitney non appariés.
- Pour une analyse préliminaire, ne pas choisir une valeur pour plusieurs essai de correction sur l’écran suivant, cliquer pour accéder à l’intrigue de résultat.
- Sur l’écran des résultats, sélectionnez un seuil de pli-changement de 3.0 et un seuil de valeur prédictive à 0,1. Puis terminer et exporter la liste comme Résultats Prelim.
- Pour chaque fonctionnalité restant après filtrage, générer prédit connaissez-vous chimique de la masse exacte et le spectre de masse composite.
- En MPP, sélectionnez interprétation des résultats > Identification de IDBrowser et la liste des entités Résultats Prelim .
- Dans l’IDBrowser sélectionnez identifier tous les composés à l’aide de générateur de formule moléculaire (MFG) comme la méthode d’identification.
- Dans la formule de générer des options ajouter F à la colonne des éléments et fixé la limite à 50, puis sélectionnez terminer. Après la génération de formule, sélectionnez enregistrer et revenir à revenir au député.
- MPP, faites un clic droit le filtrée et MFG égalé Entity List et sélectionnez Exporter liste. Enregistrer les résultats.
- Examiner la masse monoisotopique d’espèces dans la liste réduite caractéristique chimique importante pour ceux qui contiennent des défauts de masse indicatifs de fluoration ; voir genre et Fiehn34.
- Notez la série chimique contenant des motifs communs de polyfluorination (CF2 (m/z 49.9968), CF2O (m/z 65.9917), CH2CF2O (m/z 80.0074), etc.) en utilisant un algorithme de tracé ou logiciel de défaut de masse ; voir la section discussion, Liu et al.,17, Loos et coll.35 et dieme et al.,36.
- Rechercher des formules chimiques prévues ou neutres masses contre la base de données de tableau de bord EPA chimie et/ou d’autres bases de données pour retourner des structures chimiques potentiels.
- Ouvrez l’outil EPA Comptox recherche de lot de produits chimiques tableau de bord (https://comptox.epa.gov/dashboard/dsstoxdb/batch_search) et collez la liste des identificateurs (formules ou masses) dans la zone identificateur, après avoir sélectionné le type d’identificateur (par exemple, MS-prêt Formule ou masse Monoisotopique).
- Sélectionnez Télécharger les données chimiques... et aussi sélectionner des données de physique/chimie/toxicologie désirées pour les correspondances possibles dans la liste déroulante.
- En utilisant intuition chimique et données de référence disponibles, supprimer correspond probablement pas dans la liste de structure chimique potentielle pour chaque formule basée sur la faisabilité en raison de la stabilité chimique, les propriétés physiques telles qu’ionizability ou hydrophobie, la présence de fabrication de produits chimiques provenant de sources à proximité, etc... En l’absence de données supplémentaires, faisabilité spectrale peut être classée purement sur la base de la prévalence de la littérature ; voir McEachran et al.,37.
- Confirmer les structures à l’aide de normes disponibles et/ou ciblées MS/MS à haute résolution correspondant à des fragments contre les spectres de bases de données, in silico les spectres théoriques ou curation manuelle.
- Effectuer l’extraction de caractéristiques moléculaires des caractéristiques chimiques en utilisant l’un de plusieurs logiciels open source software packages32,33 ou du vendeur pour identifier des masses monoisotopique, temps de rétention et des Pits intégrée de produit chimique fonctionnalités.
Representative Results
LC-MS/MS des résultats quantitatifs sont sous forme d’ion-chromatogrammes pour le chromatogramme ionique total (TIC) et les chromatogrammes d’ion extrait (CPN) de transitions chimiques spécifiques pour les substances chimiques mesurées (Figure 1). La surface du pic intégré d’une transition chimique est liée à l’abondance de composés et peut être utilisée pour calculer la concentration exacte à l’aide d’une courbe d’étalonnage normalisée selon un standard interne (Figure 2). Une réponse faible ou plate d’analytes individuel indique que la gamme d’étalonnage est en dehors de la gamme linéaire du spectromètre de masse, ou que l’instrument exige réglage/étalonnage. Mauvaise précision de réplicats indique un problème avec l’injection de l’échantillon ou chromatographie incompatible qui nécessite une modification des paramètres de la LC.
Indifférenciés l’analyse à l’aide d’une analyse complète de la MS1 donne un TIC pour échantillons (Figure 3), qui permet une génération ad hoc du SCEI pour ions individuels (Figure 4). N’importe quel point donné temps chromatographique contienne des signaux d’espèces chimiques et en utilisant un spectromètre de masse à haute résolution, l’empreinte isotopique du composé. Identification de composés d’après le scan MS1 est réalisée par programmation par un algorithme de cueillette des pic en utilisant plusieurs approches38,39,40. Cueillette de pointe donne des caractéristiques chimiques avec une masse précise mesurée et temps de rétention chromatographique, ainsi que le spectre de masse de l’ion et la surface du pic chromatographique. Ces informations sont généralement stockées dans un format numérique de base de données pour un traitement ultérieur et le filtrage, mais le caractère imbriqué et interconnecté des données peut être compris sur le plan conceptuel (Figure 5).
La liste des fonctionnalités est filtrée pour les composés répondant à l’un de plusieurs critères à retenir pour un examen plus approfondi. Le premier et le plus simple sont le filtrage par défaut de masse (la différence entre la masse exacte d’une fonction et sa masse nominale). RFP composés ont des défauts de masse négatives (Figure 6) en raison de leur prépondérance des atomes de fluor et composés polyfluorés défauts de masse positives, mais largement plus faible que les matériaux organiques homologues31,34 . Une deuxième méthode de filtrage étape est d’identifier les séries homologues, contenant des unités répétitives communs aux espèces de propositions d’action, tels que CF2 ou CF2O. identification de ceux-ci peut se faire à l’aide de Kendrick masse défaut parcelles17,36, ou progiciels tels que R non ciblés paquet35 (Figure 7).
Après filtrage, attribution de la dénomination chimique sur la liste restreinte de très différemment observé et/ou provisoirement par / polyfluorés espèces peuvent commencer. Masse exacte fournit une liste relativement petite des formules chimiques potentiels pour la correspondance, mais ne permet pas d’identification sans ajout de spectrale correspondant au modèle isotopique du spectre de masse41. De haute résolution MS1 données, une ou plusieurs formules chimiques putatifs sont mises en correspondance avec l’empreinte isotopique du spectre de masse et a marqué (Figure 8). Formules pour la correspondance peut être générés à l’ab initio à l’aide d’un ensemble défini d’atomes ou peut provenir d’une combinaison de la littérature rapporte des composés et le contenu d’une ou plusieurs bases de données. Les hôtes nous EPA chimie Dashboard (https://comptox.epa.gov/dashboard/) une liste constamment mise à jour des propositions d’action composés identifiés par l’agence, ainsi que listes compilée par d’autres organisations telles que le NORMAN Network42.
Formules chimiques peuvent être confirmées, et quelques informations structurelles peuvent être récoltées de spectres MS/MS (Figure 9). Il existe des structures candidat de grandes bases de données chimiques tels que l’EPA chimie tableau de bord, Pubchem, le numéro de registre cas, etc.. Prédit les spectres peuvent être générés ou acquis en utilisant une variété de programmes de fragmentation et assignés,43 ou spectres MS/MS peuvent être interprétés manuellement.
Une matrice de données exemple est disponible dans les informations complémentaires contenant une matrice de toute fonctionnalité de dix échantillons (5 en amont, en aval des 5) recueillie en amont et en aval d’une source ponctuelle de composés fluorés. Chaque ligne représente une caractéristique chimique avec des temps de rétention associée, masse neutre, spectre de masse et l’abondance de brut pour chaque échantillon. (Table supplémentaire, feuille 1). Initial de filtrage (Table supplémentaire, feuille 2) pour défaut de masse négative et signification statistique dans un t-test non apparié entre en amont et en aval réduisent le nombre de fonctions chimiques « intéressants » à ~ 120. Prédit des formules chimiques ont été obtenus à partir d’Agilent IDBrowser et cherchés contre l’EPA Comptox produits chimiques Dashboard, qui retourne les correspondances possibles (Tableau supplémentaire, fiche 3). Le « haut-hit » pour chaque formule chimique basé sur des données sources37 a été affecté (Table supplémentaire, feuille 4). Notez que plus de la moitié des fonctionnalités restantes n’ont pas de matchs de haute qualité. Caractéristiques identifiées avec aucune correspondance peuvent être le résultat de la formation à la source de fragmentation/adduit, mauvaise affectation de formule, ou l’identification des PFASs est introuvable dans la base de données source. Interprétation des spectres brutes afin de valider les affectations déborde le cadre de ce manuscrit, mais on trouvera plus d’informations dans les ouvrages cités15,30,31,44, 45.
| ID | Exemple de nom | Type d’échantillon | STD Conc | Flacon | Méthode de LC | Méthode MS |
| 1 | DB_001 | Vide | 1 : A, 1 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 2 | DB_002 | Vide | 1 : A, 1 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 3 | DB_003 | Vide | 1 : A, 1 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 4 | DB_004 | Vide | 1 : A, 1 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 5 | DB_005 | Vide | 1 : A, 1 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 6 | FB | Vide | 1 : A, 2 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 7 | 10 std | Norme | 10 | 1 : A, 3 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 8 | 25 std | Norme | 25 | 1 : A, 4 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 9 | 50 std | Norme | 50 | 1 : A, 5 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 10 | 100 std | Norme | 100 | 1 : A, 6 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 11 | 250 std | Norme | 250 | 1 : A, 7 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 12 | 500 std | Norme | 500 | 1 : A, 8 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 13 | 750 std | Norme | 750 | 1 : B, 1 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 14 | 1000 std | Norme | 1000 | 1 : B, 2 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 15 | DB_006 | Vide | 1 : B, 3 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 16 | SB_DUP1 | Analyte | 1 :, 4 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 17 | SB_DUP2 | Analyte | 1 : B, 5 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 18 | Site de SW 03 | Analyte | 1 : B, 6 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 19 | Site de SW 16 | Analyte | 1 : B, 7 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 20 | Site de SW 30 | Analyte | 1 : B, 8 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 21 | DB_007 | Analyte | 1, 1 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 22 | Site de SW 19 | Analyte | 1, 2 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 23 | Site de SW 48 | Analyte | 1, 3 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 24 | SW Site 49 | Analyte | 1, 4 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 25 | Site de SW 05 | Analyte | 1, 5 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 26 | Site de SW 47 | Vide | 1 : C, 6 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 27 | DB_008 | Analyte | 1, 7 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 28 | Site de SW 19_DUP | Analyte | 1, 8 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 29 | Site de SW 20 | Analyte | 1 : D, 1 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 30 | Site de SW 21 | Analyte | 1 : D, 2 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 31 | Site de SW 46 | Analyte | 1 : D, 3 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 32 | Site de SW 47 | Analyte | 1 : D, 4 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 33 | DB_009 | Vide | 1 : D, 5 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 28 | Site de SW 32 | Analyte | 1 : D, 6 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 29 | Site de SW 50 | Analyte | 1 : D, 7 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 30 | Site de SW 25 | Analyte | 1 : D, 8 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 31 | Site de SW 21_DUP | Analyte | 1:E, 1 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 32 | Site de SW 52 | Analyte | 1:E, 2 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 33 | DB_010 | Vide | 1:E, 3 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 34 | FB | Vide | 1 : A, 2 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 35 | 10 std | Norme | 10 | 1 : A, 3 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 36 | 25 std | Norme | 25 | 1 : A, 4 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 37 | 50 std | Norme | 50 | 1 : A, 5 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 38 | 100 std | Norme | 100 | 1 : A, 6 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 39 | 250 std | Norme | 250 | 1 : A, 7 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 40 | 500 std | Norme | 500 | 1 : A, 8 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 41 | 750 std | Norme | 750 | 1 : B, 1 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 42 | 1000 std | Norme | 1000 | 1 : B, 2 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 43 | DB_011 | Vide | 1 : B, 2 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 44 | DB_012 | Vide | 1:E, 4 | RFP grad 400uL/min - 9 min exécuter | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
Tableau 1 : Exemple worklist pour analyse ciblée et la quantification des pa à l’aide de LC-MS/MS
| Temps (min) 0 |
% A (2,5 mM d’acétate d’Ammonium dans MeOH de 5 %) 90 |
% B (2,5 mM d’acétate d’Ammonium dans MeOH de 95 %) 10 |
| 5 | 15 | 85 |
| 5.1 | 0 | 100 |
| 7 | 0 | 100 |
| 7.1 | 90 | 10 |
| 9 | 90 | 10 |
Tableau 2 : Gradient d’exemple pour la séparation de la LC en analyse ciblée
| Capillaire tension (kv) | 1,97 |
| Cône de tension (V) | 15 |
| Extracteur de tension (V) | 3 |
| Lentille de RF (V) | 0,3 |
| Temp de source | 150 |
| Temp de désolvatation | 40 |
| Débit de gaz de désolvatation (L/h) | 300 |
| Cône de débit (L/h) | 2 |
Tableau 3 : Paramètres de source d’ionisation pour analyse ciblée
| CMP | Précurseur | Produit | Temps de pause | Cône de tension (V) | Énergie de collision (eV) |
| PFBA | 212,80 | 168,75 | 0,01 | 15 | 10 |
| 13C 4-PFBA EST | 216.80 | 171.75 | 0,01 | 15 | 10 |
| PFPeA | 262.85 | 218,75 | 0,01 | 15 | 9 |
| PFBS ° 1 | 298.70 | 79.90 | 0,01 | 40 | 30 |
| PFBS ° 2 | 298.70 | 98.80 | 0,01 | 40 | 28 |
| PFHxA ° 1 | 312.70 | 118.70 | 0,01 | 13 | 21 |
| PFHxA ° 2 | 312.70 | 268,70 | 0,01 | 13 | 10 |
| 13C 2-PFHxA est | 314.75 | 269,75 | 0,01 | 13 | 9 |
| HFPO-DA 1° | 329.16 | 168.90 | 0,01 | 10 | 12 |
| HFPO-DA 2° | 329.16 | 284.90 | 0,01 | 10 | 6 |
| HFPO-DA EST 1° | 332.16 | 168.90 | 0,01 | 10 | 12 |
| HFPO-DA EST 2° | 332.16 | 286.90 | 0,01 | 10 | 6 |
| PFHpA ° 1 | 362.65 | 168,65 | 0,01 | 14 | 17 |
| PFHpA ° 2 | 362.65 | 318,70 | 0,01 | 14 | 10 |
| PFHxS ° 1 | 398.65 | 79.90 | 0,01 | 50 | 38 |
| PFHxS ° 2 | 398.65 | 98.80 | 0,01 | 50 | 32 |
| 13C 4-PFHxS est | 402.65 | 83.90 | 0,01 | 50 | 38 |
| APFO ° 1 | 412.60 | 168,70 | 0,01 | 15 | 18 |
| APFO ° 2 | 412.60 | 368.65 | 0,01 | 15 | 11 |
| 13C 4-PFOA EST | 416.75 | 371.70 | 0,01 | 15 | 11 |
| PFNA ° 1 | 462.60 | 218,75 | 0,01 | 15 | 17 |
| PFNA ° 2 | 462.60 | 418.60 | 0,01 | 15 | 11 |
| PFNA EST | 467.60 | 422.60 | 0,01 | 15 | 11 |
| SPFO ° 1 | 498.65 | 79.90 | 0,01 | 60 | 48 |
| SPFO ° 2 | 498.65 | 98.80 | 0,01 | 60 | 38 |
| 13C 4-SPFO EST | 502.60 | 79,70 | 0,01 | 60 | 48 |
| PFDA ° 1 | 512,60 | 218,75 | 0,01 | 16 | 18 |
| PFDA ° 2 | 512,60 | 468.55 | 0,01 | 16 | 12 |
| 13 2 - PFDA EST | 514.60 | 469.55 | 0,01 | 16 | 12 |
Tableau 4 : Tableau de transition d’exemple et paramètres de MS/MS pour le contenu de PFA-MXA, avec HFPO-DA
| Temps (min) |
% A (2,5 mM d’acétate d’Ammonium dans MeOH de 5 %) |
% B (2,5 mM d’acétate d’Ammonium dans MeOH de 95 %) |
| 0 | 90 | 10 |
| 0,5 | 90 | 10 |
| 3 | 50 | 50 |
| 3.5 | 50 | 50 |
| 5.5 | 40 | 60 |
| 6 | 40 | 60 |
| 7 | 0 | 100 |
| 11 | 0 | 100 |
Tableau 5 : Gradient d’exemple pour la séparation de la LC en analyse indifférenciés
| Paramètre profinder | Mise en valeur |
| Filtre à hauteur d’extraction maximale | 800 chefs d’accusation |
| Ions autorisées | -H / + H |
| Fonction d’Extraction modèle isotopique | Molécules organiques communs |
| Les États de Charge autorisées | 2 - Jan |
| Composé ionique comte seuil | Deux ou plusieurs ions |
| Tolérance d’alignement RT | 0,40 min + 0,0 % |
| Alignement de tolérance masse | 20,00 ppm + 2.0mDa |
| Post-traitement hauteur absolue filtre | > = 10000 points dans un échantillon |
| Post-traitement MFE Score filtre | > = 75 dans un échantillon |
| Algorithme d’intégration de pointe | Agile 2 |
| Intégration de pointe hauteur filtre | > = 5000 points |
| Trouver par Ion hauteur absolue filtre | > = 7500 points dans un échantillon |
| Trouver par Ion Score filtre | > = 50.00 dans un échantillon |
Tableau 6 : Moléculaire d’extraction et d’alignement paramètres des fonctionnalités pour le logiciel Profinder. Toutes les valeurs non cotées conservé leurs paramètres par défaut pour le traitement des données.
| Seuil de l’abondance des ions | Seuils de fonctionnalité | Seuil de répliquer (n = 5) | Moment de l’exécution | fonctionnalités | Passer le seuil répétée | Passer le seuil de CV | Caractéristiques à 90 % des TIC |
| 1 x S/N | 2000 | Aucun | 8.15 | 987 | 505 | 421 | 91 |
| 2 x S/N | 5000 | Aucun | 5.02 | 707 | 357 | 313 | 93 |
| 3 x S/N | 10000 | Aucun | 2.3 | 308 | 249 | 230 | 93 |
| 1 x S/N | 2000 | 100 % | 3.3 | 603 | 339 | 297 | 92 |
| 2 x S/N | 35000 | 100 % | 1,58 | 310 | 248 | 229 | 93 |
| 3 x S/N | 10000 | 100 % | 1.45 | 202 | 190 | 182 | 92 |
Tableau 7 : Comparaison des temps de traitement des échantillons et des identifications de la caractéristique chimique pour les seuils d’extraction de caractéristique différente.
Figure 1 : Total chromatogramme ion et ion extrait chromatogrammes pour un sous-ensemble de normes éther perfluorés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Courbes d’étalonnage représentative pour les composés démontrant baisse de qualité de construction de la courbe analytique. Plus à gauche panneau indique une calibration de haute qualité ; Panneau central indique un composé avec une précision médiocre dans l’ensemble des doublons de préparation, en particulier les concentrations élevées ; Panneau droit indique une courbe avec une précision médiocre et une faible gamme dynamique linéaire, ce qui entraîne une réponse plate à l’extrémité supérieure de la gamme d’étalonnage et aucun signal détectable à l’extrémité inférieure. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Superposées chromatogrammes ionique total (TIC) pour les eaux de surface extraits prélevés en amont et en aval d’un site de production de produits chimiques fluorés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Ion extrait de chromatogrammes (EIC) pour tous a relevé des caractéristiques chimiques auprès d’un échantillon d’eau de surface contenant plusieurs classes de composés fluorés. Chaque trace chimique est d’une couleur différente pour la différenciation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Le schéma conceptuel d’informations brutes et prévus pour une caractéristique chimique identifiée comme l’acide dimère oxyde d’hexafluoropropylene (HFPO-DA). Caractéristiques chimiques sont tirées d’extraction de logiciel des données brutes de mesures MS et contiennent chromatographiques (p. ex., le temps de rétention (RT)) et les informations de la spectrométrie de masse. Formule prévue, les structures et les dénominations chimiques sont générées à partir des données de mesure brutes pour chaque fonctionnalité. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Défaut de masse terrain à caractéristiques chimiques identifiées dans un exutoire de fabrication (rouge, à gauche) et les eaux de surface de référence (bleu, à droite). Composés fluorés tombent près et en dessous le pointillé ligne zéro. Notez la série PFOA/SPFO persistante dans l’échantillon d’eau de surface de fond (à droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Masse vs masse défaut intrigue pour des caractéristiques chimiques non identifiés auprès d’un échantillon d’eau de surface avec des séries homologues identifiés et étiquetés par le non ciblés progiciel R. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Spectre de masse d’un inconnu caractéristiques chimiques avec des intensités isotopiques prévues de trois formule chimique possible avec le même monoisotopique Massachusetts S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Spectre de fragmentation d’un éther perfluorés composé avec annotated pics fragment. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : Représentation graphique des seuils de filtrage. De gauche à droite, seuil d’abondance d’ion de spectres de masse caractéristique chimique, seuil d’abondance pour les extraits caractéristiques chromatographiques en vedette et de répliquer seuil de fréquence de détection de fonctionnalité dans une expérience d’injection en triple. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Préparation et manipulation des échantillons
L’inclusion des normes de référence/spike revêtent une importance primordiale pour toute analyse ciblée, puisqu’elles fournissent un filet de sécurité pour la vérification de validité analytique. Le manque d’échantillons QC empêche toute évaluation de l’exactitude des résultats ; l’ubiquité de composés fluorés signifie que la contamination des échantillons sur le terrain, traitement des matériaux ou système SM-chance n’est pas rare et doit être pris en compte. En outre, il permet la validation du protocole indépendamment de la variation dans l’échantillon au jour le jour, traitements, que bon nombre des étapes peuvent être très variables, en particulier la SPE et étapes de concentration échantillon. L’extraction de deux produits chimiques perfluorés anciens et nouveaux peut être fortement influencée par le choix de la phase stationnaire pour la concentration et les composants des échantillons source, comme le pH et la salinité46. L’influence des conditions de l’échantillon devrait considérer si des catégories particulières de produits chimiques pefluorinated présentent un intérêt. Programmes d’échantillon alternatif préparation des extraits aqueux peuvent être utilisés si l’installation du laboratoire est disponible et l’analyse des données en aval reste similaire.
Analyse des données ciblées
Pour les composés avec les normes disponibles et apparié, stable isotope intitulée normes internes, les principales préoccupations pour l’analyse des données sont instrumental et la détermination des limites de détection et gammes considérées appropriées peuvent être déterminées sur une base par-un laboratoire en utilisant des approches standards, comme le rapport signal-sur-bruit de bas niveau standard pointes47. En l’absence de normes internes correspondants des effets de matrice ne correspondent pas des erreurs peuvent survenir, et dos-prévision précise des échantillons enrichis peut être utilisé pour estimer la précision de la mesure. Lors de l’absence de normes pour préparer une courbe, une estimation quantitative d’un inconnu peut être faite en le traitant identiquement à une norme étroitement assortie composée, mais sont d’erreurs dans l’estimation de l’ordre de 10 + pli ayant une capacité limitée pour quantifier l’incertitude, voir McCord, Newton et Strynar21. Dans ces cas, tendance peut encore être collectées, mais les estimations de concentration sont peu fiables en soi.
Analyse des données non ciblée
Paramètres de cueillette de pointe ont un impact important sur le nombre d’éléments chimiques identifiés, mais la qualité de la sélection des fonctionnalités est également fortement touchée. Les décisions d’intérêt dans la cueillette de pointe sont 1) intensité des masses individuelles devant figurer dans les spectres, le seuil de l’abondance d’ion 2) l’intensité du chromatogramme extrait culmine à considérer les caractéristiques, la fonctionnalité abondance seuil 3) détection fréquence, le seuil de répliquer et 4) variation analytique, le seuil de CV (Figure 10).
Réglage des seuils exagérément basses pour résultats de cueillette de pointe à une augmentation exponentielle de temps d’échantillon pour résoudre des fonctionnalités supplémentaires de plus en plus faible abondance (tableau 7). Les filtres de seuil d’ion-abondance de masse caractéristiques spectrales où suffisamment de l’abondance de l’isotope individuel ne passent pas le seuil. Idéalement, cela sélectionne uniquement pour les fonctions avec les spectres MS de qualité, s’assurer qu’ils sont caractéristiques chimiques véritables au lieu du bruit instrumental et permettant pour la formule prévision en traitement en aval. Un seuil approprié est basé sur le bruit instrumental, idéalement au moins 3 x le seuil de bruit pour MS1 scanne. Seuil d’abondance de fonctionnalité filtres chimiques caractéristiques basées sur l’intensité ou la zone de la fonctionnalité chromatographique extraite. Cette étape permet le rejet des pics de faible abondance, qui sont généralement de mauvaise qualité chromatographique, ont des variances élevées ou sont le résultat d’autre extraction pauvre logiciel. Un seuil approprié doit être déterminé par expérience et par matrice basée sur un niveau acceptable de génération mauvaise fonctionnalité (par exemple, les fonctionnalités ci-dessous la chromatographie trop mauvaise pièce de seuil). Encore QC analytique peut être utilisé pour rejeter les caractéristiques au niveau chromatographique basé sur l’identification incompatible en répétitions analytiques et/ou préparatoires (seuil répétée) ou fondée sur la mauvaise reproductibilité dans répétitions (seuil de CV). Niveaux appropriés dépendent de la qualité du logiciel intégration pic utilisé et les entités chimiques incriminés. Pour les composés perfluorés soluble dans l’eau et protocoles d’intégration légèrement optimisée, les caractéristiques doivent être identifiées dans 80 + % d’analytique réplique et CVs devraient tomber sous les 30 %, tel que décrit dans la section méthodes.
Les pics détectés d’analyse non ciblés ne donnent pas des estimations quantitatives des concentrations des matériaux détectés. En outre, l’identité du véritables inconnues peut être difficile à confirmer car de nouveaux composés sont absents des bases de données accessibles au public. Détermination de structure roman exige une analyse approfondie avec plusieurs méthodes et nécessite une expertise en chimie et en spectrométrie de masse. Cependant, normaliser la surface des pics des caractéristiques chimiques peut produire des estimations semi-quantitatives des concentrations d’inconnues des espèces connues de21. Si cohérent d’échantillonnage et les étapes de préparation sont employés, information sur les tendances temps pour chaque espèce peut être généré pour surveiller la persistance d’un produit chimique dans l’avenir comme la réponse pour une seule espèce devrait correspondre à moins grande variations dans la matrice21.
Le principal avantage de cette méthode est l’extensibilité de la traitement de l’échantillon pour permettre une analyse ciblée et non ciblée. Analyse ciblée fournit des informations quantitatives équivalentes ou supérieures, il manque grandement de profondeur de l’analyse souhaitée lorsqu’ils traitent avec des matériaux nouveaux et émergents, ainsi que leur relation avec les matériaux de matrice. Appliquer une méthodologie ciblée, ou même un suspect méthode de criblage basée uniquement sur les matériaux connus et bases de données limités est complètement aveugle aux espèces précédemment non prise en charge, même s’ils peuvent avoir des effets importants sur la santé. Comme le logiciel améliore et bases de données deviennent plus robustes, la précision d’identité inconnue continuera d’augmenter, avec une diminution concomitante de l’investissement de temps et le niveau d’expertise nécessaire pour analyser les données multidimensionnelles générées par cette approche. Néanmoins, les données produites actuellement sont très utile de futur parce que la banque de données permettant l’analyse post-hoc avec logiciel nouvellement développé et permet la comparaison au fil du temps même si l’identité d’un composé détecté est actuellement inconnue.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
La U.S. Environmental Protection Agency, par le biais de son bureau de recherche et développement, financé et géré la recherche présentée ici. Ce document a été revu par la U.S. Environmental Protection Agency, Office de la recherche et le développement et approuvé pour publication. Les opinions exprimées dans cet article sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues ou les politiques de la U.S. Environmental Protection Agency. Cette recherche a été financée en partie par une nomination pour le programme de recherches postdoctorales au laboratoire de recherche exposition National administré par l’Institut d’Oak Ridge pour la Science et l’éducation par le Interagency DW89992431601 accord entre la US Department of Energy et l’Environmental Protection Agency des États-Unis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acqity ultra-high performance liquid chromatography system | Waters Corporation | Modified with PFCs analysis kit (176001744); equivalent UPLC system is acceptible if PFAS background is checked and confirmed to be low | |
| Ammonium acetate | Fluka | 17836 | Mass spectrometry grade >99% pure |
| Ammonium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| Balance | Mettler | AB204S | |
| BEH C18 reverse phase UPLC column, 2.1×50 mm, 1.7 μm | Waters Corporation | 186002350 | |
| Dual piston syringe pump | Waters Corporation | SPC10-C | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | ARK2183 | |
| Glass Microfiber Filters | Whatman | 1820-070 | |
| High density polyethelye sample bottle | Nalgene | 2189-0032 | |
| High Resolution Mass Spectrometer | Various | Mass Spectrometer should be capable of providing accurate mass to <10ppm and collecting MS/MS data. Agilent 6530 qTOF and Thermo Fisher Orbitrap Fusion were used in this work | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| Nitric Acid (35% w/w) | Thermo Fisher Scientific | SVCN-5-1 | Can be prepared in house using concentrated nitric acid and reagent water |
| Polypropylene Buchner funnel | ACE Glass | 12557-09 | |
| Polypropylene cenitrfuge tube and cap | BD Falcon | 352096 | |
| Polypropylene Vacuum Flask (1 L) | Nalgene | DS4101-1000 | |
| Quattro Premier XE triple quadrupole mass spectrometer | Waters Corporation | Equivalent triple-quadrupole or better system can be used instead, should provide high sensitivity and stability for targeted analysis | |
| Reagent Water | Any source determined to be PFAS free | ||
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
| TurboVap nitrogen evaporator | Caliper Life Sciences | 103198 | Equivalent systems or rotary vacuum evaporator may be used instead |
| Weak anion exchange SPE cartridge (Oasis WAX Plus) | Waters Corporation | 186003519 | |
| Standard Solutions | |||
| 2,3,3,3-Tetrafluoro-2-(1,1,2,2,3,3,3-heptafluoropropoxy)propanoic acid (HFPO-DA) | Wellington | HFPO-DA | |
| Additional targeted compound standards of interest | to be determined based on preliminary analysis and standard availability | ||
| Mass labeled HFPO-DA | Wellington | M2HFPO-DA | |
| Native PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL) | Wellington | PFAC-MXA | or PFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest |
| Stable Isotope Labeled PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL) | Wellington | MPFAC-MXA | or MPFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest as appropriate for Native PFASs |
| Software | |||
| Mass Profiler Professional | Agilent | Or open source software packages | |
| Profinder | Agilent | Or open source software packages |
References
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