Summary
हम Arabidopsis थालियाना के फ्लोरोसेंट लाइव इमेजिंग प्रदर्शन के लिए एक सरल और बहुमुखी विधि की रिपोर्ट समय की एक विस्तारित अवधि में पत्तियों । हम एक ट्रांसजेनिक Arabidopsis संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के spatiotemporal समझ पाने के लिए एक उदाहरण के रूप में एक प्रतिरक्षा संबंधी प्रमोटर के नियंत्रण में एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन व्यक्त संयंत्र का उपयोग करें ।
Abstract
संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया एक जीनोम चौड़ा transcriptional reprogramminging के साथ जुड़े संक्रमण के स्थल पर शुरू की है । इस प्रकार, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया स्थानिक और लौकिक विनियमित है । एक एक स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में एक प्रतिरक्षा से संबंधित प्रमोटर के नियंत्रण में एक फ्लोरोसेंट जीन का उपयोग एक सरल तरीका है संयंत्र प्रतिरक्षा के spatiotemporal विनियमन समझ है । जड़ ऊतकों है कि विभिंन intravital फ्लोरोसेंट इमेजिंग प्रयोगों की एक संख्या के लिए इस्तेमाल किया गया है के विपरीत, वहां कुछ फ्लोरोसेंट रहते है पत्ती ऊतकों कि हवाई माइक्रोबियल संक्रमण की एक सरणी मुठभेड़ के लिए इमेजिंग उदाहरण मौजूद हैं । इसलिए, हम समय की एक विस्तारित अवधि में लाइव सेल इमेजिंग के लिए Arabidopsis थालियाना पौधों की पत्तियों को माउंट करने के लिए एक सरल तरीका विकसित किया । हम ट्रांसजेनिक Arabidopsis पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त पौधों का इस्तेमाल किया (YFP) परमाणु स्थानीयकरण संकेत करने के लिए genefused (एनएलएस) एक रक्षा से संबंधित मार्कर जीन के प्रवर्तक के नियंत्रण में, रोगजनन-1 से संबंधित ( PR1) । हमने Pseudomonas syringae पीवी के साथ एक ट्रांसजेनिक पत्ती से घुसपैठ की । टोमॅटो DC3000 (avrRpt2) तनाव (Pst_a2) और vivo में प्रदर्शन YFP संकेत की एक कुल के लिए समय-चूक इमेजिंग ४० एक स्वचालित प्रतिदीप्ति stereomicroscope का उपयोग कर एच । इस विधि न केवल संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पर अध्ययन के लिए लेकिन यह भी विभिंन विकासात्मक घटनाओं और पर्यावरण पत्ती ऊतकों में होने वाली प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
Introduction
संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया एक गतिशील transcriptional एकाधिक प्रतिलेखन कारकों द्वारा विनियमित reprogramminging के रूप में के रूप में अच्छी तरह से phytohormones1शामिल है । transcriptome डेटा का संचय संयंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली के बारे में जानकारी एकत्रित करने के लिए अवसर प्रदान करता है: उदाहरण के लिए, सिग्नलिंग कैस्केडिंग की नेटवर्क संरचना2. हालांकि, हमारे ज्ञान संयंत्र प्रतिरक्षा के स्थानिक और लौकिक गतिशीलता अभी भी3,4,5सीमित रहता है ।
पिछले अध्ययनों में, रक्षा से संबंधित जीन अभिव्यक्ति का spatiotemporal विनियमन ज्यादातर सीटू संकरण और एक β-glucuronidase (गस) रिपोर्टर परख6,7,8में उपयोग कर विश्लेषण किया गया है । ये विधियां हमें सीटू में रुचि के विभिन्न जीनों की transcriptional सक्रियण की कल्पना करने में सक्षम बनाती हैं । हालांकि, इन प्रक्रियाओं नमूनों की रासायनिक निर्धारण की आवश्यकता है, और इस प्रकार सभी लौकिक जानकारी के नुकसान में परिणाम । प्रतिरक्षा, समय के साथ प्रगति के रूप में जैविक घटनाओं, । एक संवाददाता के रूप में luciferase का उपयोग3ब्याज के प्रवर्तक के लौकिक गतिशीलता का कब्जा सक्षम है । हालांकि, luciferase आधारित परख एक महंगी सब्सट्रेट और अति संवेदनशील डिटेक्टरों की आवश्यकता है । संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के spatiotemporal पहलुओं की हमारी समझ बढ़ाने के लिए एक सरल प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, हम ट्रांसजेनिक Arabidopsis थालियाना पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) जीन से जुड़े पौधों को व्यक्त करने के लिए उत्पंन नाभिकीय स्थानीयकरण संकेत (YFP-एनएलएस) रक्षा संबंधी मार्कर जीन के प्रवर्तक के नियंत्रण में, रोगजनन-संबंधित 1 (PR1)9. हम क्लोरोफिल autofluorescence, जीवित कोशिकाओं के मार्कर का इस्तेमाल किया, क्रमादेशित कोशिका मृत्यु (PCD) है, जो अक्सर प्रभाव के दौरान होता है की प्रक्रिया को पकड़ने के लिए ट्रिगर प्रतिरक्षा (एति), संयंत्र प्रतिरक्षा विशेष रोगज़नक़ संक्रमण9 द्वारा प्रेरित का एक रूप , 10. इस तरह के Arabidopsis पत्ते रहने के रूप में स्वतंत्र रूप से चलती वस्तुओं, में प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता के लौकिक गतिशीलता की निगरानी, एक जटिल छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर या तो घर में बनाया या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध की आवश्यकता है । वैकल्पिक रूप से, चलती से नमूनों को रोकने के मुद्दे को हल करने के लिए एक सरल तरीका है । यहां, हम एक स्वचालित प्रतिदीप्ति stereomicroscope के तहत लंबी अवधि के अवलोकन के लिए एक ट्रांसजेनिक Arabidopsis संयंत्र के बढ़ते रहने पत्तियों के लिए एक बहुमुखी और सरल विधि विकसित की है । विधि हमें मिट्टी के भीतर प्रवर्तक गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए अनुमति देता है बरकरार संयंत्र कुछ दिनों में छोड़ देता है ।
Protocol
नोट: यह समय चूक इमेजिंग के दौरान रहने वाले पत्ती के नमूनों की नींद आंदोलन को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है । पत्तियों पर यांत्रिक तनाव को कम करने के लिए, पत्तियों के कोमल निर्धारण आवश्यक है । केवल पर्याप्त रूप से तैयार पत्ती नमूने विभिन्न छवि विश्लेषण के लिए उपयुक्त समय चूक छवियों का उत्पादन । PR1 जीन प्रवर्तक (pPR1-YFP-एनएलएस पादपों) और Pseudomonas syringae पीवी के नियंत्रण के अंतर्गत YFP-एनएलएस फ्यूजन व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक Arabidopsis पादपों का उपयोग करने वाला एक प्रोटोकॉल. टोमॅटो DC3000 (avrRpt2) तनाव (Pst_a2) एक उदाहरण के रूप में नीचे वर्णित है ।
1. पौधों और रोगजनकों की तैयारी
- autoclaved मिट्टी के साथ एक प्लास्टिक सेल प्लग ट्रे (सामग्री की मेज) भरें ।
- सेल प्रति एक ट्रांसजेनिक Arabidopsis बीज बोना (चित्रा 1ए) ।
- 23 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा एक वृद्धि कमरे में ट्रे हस्तांतरण और 2-3 सप्ताह के लिए निरंतर सफेद प्रकाश के तहत पौधों को विकसित ।
- दो दिन पूर्व रोगजनक टीका, लकीर Pseudomonas syringae पीवी. टोमॅटो DC3000 avrRpt2 तनाव (Pst_a2) से एक ग्लिसरॉल शेयर पर NYG मीडियम (5 ग्राम/L peptone, 3 g/l खमीर निकालने, 20 मिलीलीटर/l ग्लिसरॉल, 15 g/l जीवाणु आगर, pH ७.०) जिसमे १०० mg/l रिफैंपिसिन और ५० mg/l कनमीसिन और गर्मी में 28 ° c के लिए ४८ एच.
- फसल बैक्टीरियल कोशिकाओं है कि मध्यम की सतह पर दिखाई प्लास्टिक युक्तियों का उपयोग कर, उंहें एक प्लास्टिक 10 मिमी MgCl2युक्त ट्यूब को हस्तांतरण, और resuspend । ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) पर समाधान के ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) को मापने । 108 कॉलोनी गठन इकाइयों (CFU)/mL, जो आम तौर पर६०० = ०.२11आयुध डिपो से मेल खाती है बैक्टीरियल कोशिकाओं के अंतिम कोशिका एकाग्रता को समायोजित करें ।
2. रोगज़नक़ टीका
- सावधानी से एक सेल प्लग एक 2-3 सप्ताह पुराने संयंत्र से युक्त संयंत्र को नुकसान पहुंचाए बिना कटौती । कक्ष को एक रिक्त कक्ष प्लग ट्रे में सेट करें (2 x 2 कक्ष पर्याप्त हैं) एक अच्छा संतुलन बनाए रखने के लिए (चित्र 1B) ।
- टीका के लिए एक अदृश्य स्वस्थ पत्ती का चयन करें । आम तौर पर, तीसरे, चौथे, और पांचवें पत्ते (#3, #4, और #5, क्रमशः, चित्रा 1सीमें) संयंत्र के नीचे से संभाल करने के लिए आसान कर रहे हैं । बेहतर reproducibility के लिए प्रयोगों के एक सेट में एक ही स्थिति में पत्तियों का उपयोग करें । जल मिट्टी लंबी अवधि के समय चूक इमेजिंग के लिए टीका से पहले संयंत्र जोत ।
- वैकल्पिक रूप से, pPR1जैसे तनाव उत्तरदायी प्रवर्तकों का विश्लेषण करने के मामले में, यह सुनिश्चित करने के लिए कि पौधों पर स्वाभाविक रूप से बल नहीं दिया जाता है, रोगजनक टीका से पहले एक प्रतिदीप्ति stereomicroscope के अंतर्गत पत्तियों की जांच YFP सिग्नल के अभाव की पुष्टि करने के लिए करें. प्रयोग से YFP संकेत दिखा पत्तियों को छोड़ दें ।
- रोगजनक के साथ सीधे संपर्क से बचने के लिए घुसपैठ से पहले डिस्पोजेबल लेटेक्स दस्ताने पहनें । एक 1 मिलीलीटर सुई प्लास्टिक सिरिंज का उपयोग करना, ध्यान से जीवाणु निलंबन के साथ पत्ती के abaxial पक्ष घुसपैठ (108 CFU/एमएल)11 (चित्रा 1डी). पत्ती का एक-आधा पर एक छोटे से हिस्से के टीका pPR1 गतिविधि का एक अच्छा दृश्य सक्षम बनाता है; घुसपैठ क्षेत्र शेष पत्ती के साथ तुलना में रंग में गहरा हरा के रूप में दिखाई देता है । घुसपैठ के दौरान पत्ती को किसी भी यांत्रिक क्षति का कारण नहीं होना बेहद सावधान रहना ।
नोट: सुनिश्चित करें कि घुसपैठ क्षेत्र में सभी सेलुलर रिक्त स्थान पूरी तरह से (खड़ी) रोगज़नक़ निलंबन के साथ पूरा कर रहे हैं; अंयथा, PCD डोमेन के लिए फ्लोरोसेंट stereomicroscope के तहत कल्पना मुश्किल हो जाएगा । यह बस घुसपैठ क्षेत्र में अंधेरे हरियाली के पूरा होने की पुष्टि की जा सकती है । - एक नरम कागज तौलिया के साथ घुसपैठ पत्ती के घुसपैठ अनुभाग आसपास के क्षेत्र से बैक्टीरियल सस्पेंशन के अतिरिक्त अवशोषित ।
3. inoculated पत्ती बढ़ते
- टीका के तुरंत बाद, प्लास्टिक ट्रे पर एक ग्लास स्लाइड शल्य टेप (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर तय है कि घुसपैठ की पत्ती कांच स्लाइड के केंद्र में स्थित है । सुनिश्चित करें कि inoculated पत्ता ब्लेड पूरी तरह से ग्लास स्लाइड के भीतर फिट है (चित्रा 2ए) ।
- डबल स्तरित प्लास्टिक टेप तैयार (०.२ mm मोटी टेप के मामले में, सामग्री की तालिकादेखें) और यह दो टुकड़ों (चित्रा 2ख; टुकड़े 1 और 2) में कटौती करने के लिए घुसपैठ की पत्ती के डंठल के साथ रिक्त स्थान फिट । चित्र 2 aमें दिखाए गए दोहरे सिरों वाले तीर की लंबाई में फ़िट करने के लिए, आकृति 2Bमें डबल-सिरों वाले तीर के साथ दर्शाई गई इन दो टुकड़ों की लंबाई व्यवस्थित करें ।
नोट: दो टुकड़ों में से प्रत्येक से एक कोने में कटौती पत्ती ब्लेड को नुकसान से बचने में मदद करता है (चित्रा 2बी, ऐरोहेड; भी नीचे दिए गए चरण ३.४ देखें) । इसी तरह की मोटाई के साथ प्लास्टिक टेप के किसी भी प्रकार के डंठल पर एक पुल बनाने के लिए उपयुक्त है । प्लास्टिक टेप की कठोरता के नीचे वर्णित प्रक्रिया के दौरान आसान से निपटने के लिए महत्वपूर्ण है । - ठीक चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करना, छड़ी टेप टुकड़े 1 और 2 डंठल के दोनों ओर ऐसी है कि प्रत्येक टुकड़ा के कट कोनों पत्ती ब्लेड के आधार के साथ संरेखित करें (चित्रा 2सी) । सुनिश्चित करें कि टेप टुकड़े डंठल या पत्ती ब्लेड स्पर्श नहीं करते ।
नोट: इन डबल स्तरित पत्ती ब्लेड के आधार पर प्लास्टिक टेप टुकड़े स्पेसर के रूप में कार्य और बढ़ते के दौरान डंठल पर शारीरिक तनाव को रोकने के । - डबल स्तरित प्लास्टिक टेप का एक अतिरिक्त टुकड़ा तैयार (चित्रा 2बी, 3 टुकड़ा) चित्रा 2बी में डबल नेतृत्व में तीर के आकार के लायक है और यह टेप टुकड़े के शीर्ष पर छड़ी 1 और 2 डंठल पर एक पुल बनाने के लिए ( चित्रा 2डी, ई) । चित्र 2डी, ईमें तीर के साथ संकेत दिया स्थानों पर टेप टुकड़े के बीच सीधे डंठल और पत्ती ब्लेड को पकड़ने के लिए नहीं बेहद सावधान रहना ।
- धीरे पत्ती ब्लेड की नोक के ऊपर कांच स्लाइड पर सर्जिकल टेप (चित्रा 2एफ, 4 टुकड़ा) के एक छोटे से टुकड़े छड़ी इतना है कि पत्ती ब्लेड गिलास स्लाइड पर बहुत नरम तय है । केवल मजबूती से सीधे ग्लास स्लाइड (चित्रा 2एफ, एक डैश्ड लाल रेखा के साथ उल्लिखित क्षेत्र) को छूने सर्जिकल टेप का हिस्सा नीचे प्रेस, नहीं दूसरे भाग के पत्ते को पार कर ।
- डंठल और प्लास्टिक टेप टुकड़े (1, 2, और 3) की सीमा पर धीरे से सर्जिकल टेप (चित्रा 2जी, टुकड़ा 5) का एक और छोटा सा टुकड़ा छड़ी बहुत नरम दोनों कांच स्लाइड और प्लास्टिक टेप टुकड़े पर तय हो गई है । केवल मजबूती से ग्लास स्लाइड और प्लास्टिक टेप टुकड़े (चित्रा 2जी, एक डैश्ड लाल रेखा के साथ उल्लिखित क्षेत्र), नहीं अन्य भाग डंठल को छूने के लिए सीधे सर्जिकल टेप का हिस्सा संलग्न ।
- २०० µ l पिपेट tips (चित्रा 2एच) का उपयोग माइक्रोस्कोप के दृश्य के क्षेत्र में जाने से पड़ोसी पत्तियों को रोकने. मिट्टी में पिपेट युक्तियों डालें धीरे पड़ोसी के पत्ते घुसपैठ पत्ती से दूर पकड़ । संभव जड़ नुकसान से बचने के लिए मिट्टी में भी गहरी सुझावों डालने के लिए नहीं सावधान रहना ।
नोट: तैयार प्लांट अब प्रतिदीप्ति stereomicroscope इमेजिंग के लिए तैयार है ।
4. सूक्ष्म समय चूक अवलोकन
- फ्लोरोसेंट stereomicroscope को चालू करें ।
नोट: यहां, एक स्वचालित stereomicroscope 12 में एक अति संवेदनशील १.४ मेगापिक्सेल मोनोक्रोम डिजिटल कैमरा के साथ सुसज्जित बिट मोड (सामग्री की तालिका) काउपयोग किया जाता है । माइक्रोस्कोप एक अंधेरे कमरे में रखा जाना चाहिए एक वातानुकूलन इकाई या पर्याप्त वेंटिलेशन के साथ एक अंधेरे कैबिनेट में 23 ° c समय-चूक इमेजिंग के दौरान कमरे के तापमान को बनाए रखने के लिए । - इमेजिंग के लिए stereomicroscope के उद्देश्य लेंस के तहत ऊपर अंतरिक्ष में संयंत्र सेट करें ।
- समय-चूक इमेजिंग के लिए पैरामीटर्स सेट करें ( तालिका 1में उदाहरण देखें). समय के अंतराल अवधि के दौरान प्रकाश जोखिम के लिए कार्यक्रम कदम-चूक इमेजिंग के बाद से प्रकाश संयंत्र प्रतिरक्षा12पर एक प्रमुख प्रभाव पड़ता है सुनिश्चित करें ।
- YFP सिग्नल को विज़ुअलाइज़ करने के लिए पारंपरिक YFP फ़िल्टर (उत्तेजना 500-520 एनएम; उत्सर्जन 540-580 एनएम) का उपयोग करें ।
- का प्रयोग करें टेक्सास लाल (TXR) फ़िल्टर (उत्तेजना 540-580 एनएम; उत्सर्जन ६१० एनएम लंबे पास) क्लोरोफिल autofluorescence कल्पना करने के लिए इतना है कि PCD डोमेन एक अंधेरे क्षेत्र के रूप में दिखाई दे रहा है (कोई autofluorescence) YFP से घिरा-सकारात्मक सेल परतें9 (चित्रा 3 क).
- अतिरिक्त प्रकाश जोखिम कदम के लिए पारंपरिक महामारी उज्ज्वल क्षेत्र सेटअप का प्रयोग करें ।
नोट: प्रयोग से पहले, महामारी उज्ज्वल प्रकाश स्रोत की शक्ति को मापने और खुद के संयंत्र विकास की स्थिति के स्तर को समायोजित ।
- समय चूक इमेजिंग कार्यक्रम चलाते हैं । कई दिनों में लंबी अवधि के अवलोकन के लिए, संयंत्र उचित रूप से पानी पर विचार, उदाहरण के लिए, प्रकाश जोखिम कदम के दौरान ।
- छवि प्राप्ति के बाद, अंतराल में प्रकाश एक्सपोज़र के लिए उपयोग किए गए अतिरिक्त चैनल छोड़ दें (संगत चैनल 3-8 में तालिका 1में) डेटा सेट से. फिजी9जैसे विभिंन छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके विभिंन पद्धतियों, जैसे क्षेत्र-की-रुचि (ROI) विश्लेषण के साथ डेटा का विश्लेषण करें ।
Representative Results
यहां, हम समय चूक इमेजिंग के लिए एक उदाहरण के रूप में Pst_a2प्रेरित एति का इस्तेमाल किया । समय चूक डेटा छवियों, जिनमें से कुछ चित्र 3बीमें दिखाया गया है की एक श्रृंखला के रूप में प्राप्त किया गया है, और एक समय चूक फिल्म (पूरक फिल्म 1)9के रूप में । Pst_a2प्रेरित एति के दौरान pPR1-YFP-एनएलएस का उपयोग कर सफल प्रयोगों में, pPR1 के क्षणिक सक्रियण, YFP डोमेन आसपास के कोशिकाओं के कई परतों में, PCD व्यक्त घावों से स्पष्ट रूप में मनाया गया था (चित्रा 3बी) 9. PCD डोमेन आसपास के कोशिकाओं में pPR1 के सक्रियकरण आमतौर पर लगभग 5 घंटे पोस्ट टीका (hpi), चोटियों पर लगभग 12 hpi में शुरू होता है, और ४० hpi (चित्रा 3बी)9तक रहता है । चूंकि छवियां एक महामारी-फ्लोरोसेंट प्रणाली का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे, YFP यहां प्राप्त संकेतों कई adaxial कोशिका परतों से उत्पंन किया गया एपिडर्मल सहित के रूप में अच्छी तरह से ऊपरी mesophyll कोशिकाओं ।
चित्रा 1 : विधि में जीवाणु रोगज़नक़ की घुसपैठ के लिए इस्तेमाल किया Arabidopsis थालियाना पत्ता. (क) एक सेल प्लग ट्रे में दो-से-तीन सप्ताहीय Arabidopsis पौधे उगाए गए. (ख) टीका के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए चयनित संयंत्र से युक्त एक सेल प्लग और अवलोकन बाहर कट गया था और संतुलन बनाए रखने के लिए खाली सेल प्लग ट्रे में रखा गया था । (ग) तीसरे, चौथे, और पांचवें पत्ते (#3, #4, और #5, क्रमशः) छवि विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं । (घ) एक सुई सिरिंज का उपयोग कर एक चयनित पत्ती में रोगज़नक़ निलंबन की घुसपैठ. घुसपैठी क्षेत्र को शेष पत्ती की तुलना में उसके गहरे हरे रंग के आधार पर पहचाना जा सकता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : विधि घुसपैठ बढ़ते के लिए इस्तेमाल किया Arabidopsis समय के लिए पत्ता-चूक इमेजिंग । (a) inoculated लीफ के अंतर्गत निश्चित काँच की स्लाइड वाले Arabidopsis पौधे का फोटोग्राफ । घुसपैठ की पत्ती शीशे की स्लाइड के केंद्र में तैनात थी । डबल-सिरों वाला तीर प्लास्टिक टेप स्पेसर्स की लंबाई इंगित करता है । (ख) प्लास्टिक टेप स्पेसर्स और ब्रिज तैयार करना । डबल स्तरित प्लास्टिक टेप दो टुकड़ों में काट दिया गया था (1 और 2) स्पेसर्स के लिए, और एक और टुकड़ा (3, एक डैश्ड लाल रेखा के साथ उल्लिखित) एक पुल तैयार करने के लिए काट दिया गया था । डबल-सिरों वाले तीरों की लंबाई लगभग (A) में दोहरे सिरों वाले तीर की लंबाई के समान होती है. टुकड़े के चार कोनों में से एक 1 और 2, तीर के साथ संकेत दिया, काट रहे थे । (ग) दोहरे स्तरित प्लास्टिक टेप के दो टुकड़े (1 और 2 के रूप में गिने) ध्यान से डंठल और पत्ती ब्लेड के साथ सीधे संपर्क बनाने के बिना, ठीक चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग कर डंठल के साथ स्लाइड ग्लास पर चिपकाया गया । (घ) डबल स्तरित प्लास्टिक टेप का एक अतिरिक्त टुकड़ा (3 के रूप में गिने), जो (बी) से तैयार किया गया था, डंठल पर एक पुल बनाने के लिए दोनों बेसल स्पेसर्स (1 और 2) पर रखा गया था, जबकि 1 और 2 टेप के बीच डंठल को पकड़ने के लिए सुनिश्चित नहीं स्थिति तीर के साथ संकेत दिया । (ङ) टेप डंठल दिखा तस्वीर । यह महत्वपूर्ण है के लिए पौधों के ऊतकों को पकड़ नहीं प्लास्टिक टेप टुकड़े के बीच सीधे स्थानों पर तीर के साथ संकेत दिया । (च) सर्जिकल टेप का एक छोटा सा टुकड़ा (4 के रूप में गिने) पत्ती ब्लेड की नोक के आसपास गिलास स्लाइड पर धीरे से चिपकाया गया था । केवल डैश्ड लाल रेखा द्वारा उल्लिखित क्षेत्र मजबूती से कांच स्लाइड पर दबाया गया था । (छ) शल्य टेप का एक छोटा सा टुकड़ा (5 के रूप में गिने) धीरे डंठल और प्लास्टिक टेप टुकड़े की सीमा पर चिपकाया गया था । केवल धराशायी लाल रेखा द्वारा उल्लिखित क्षेत्र स्लाइड कांच और प्लास्टिक टेप टुकड़े पर धीरे डंठल फिक्सिंग के लिए दबाया गया था । (ज) दो डिस्पोजेबल पिपेट युक्तियां stereomicroscope के दृश्य के क्षेत्र में जाने से पड़ोसी पत्तियों को रोकने के लिए इस्तेमाल किया गया । पिपेट सुझावों को सीधे मिट्टी में उपयुक्त पदों पर डाला गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : प्रतिनिधि का उपयोग कर परिणाम Arabidopsis पत्ती बढ़ते विधि । (क) एक ट्रांसजेनिक Arabidopsis पत्ती (pPR1-YFP-एनएलएस plant) की फ्लोरोसेंट stereomicroscopic छवियाँ. पत्ती के एक हिस्से Pst_a2 (108 CFU/एमएल) के साथ अपनी abaxial सतह पर घुसपैठ की थी, और छवियों पर कब्जा कर लिया गया 22 घंटे पोस्ट टीका (hpi) । नाभिक में pPR1 प्रवर्तक सक्रिय YFP फ़िल्टर का उपयोग कर पाया गया, और क्रमादेशित कोशिका मृत्यु (PCD) क्लोरोफिल autofluorescence के नुकसान के आधार पर पता चला था टेक्सास लाल (TXR) फिल्टर का उपयोग कर । स्केल पट्टी = २.५ mm. (B) यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त किए गए ८०० चित्रों के संग्रह से चयनित कुछ समय-चूक छवियां । इन आंकड़ों ४० hpi के लिए pPR1 गतिविधि के spatiotemporal गतिशीलता के एक vivo सिंहावलोकन में प्रदान करते हैं । YFP और TXR छवियों की मर्ज की गई छवियां दिखाई जाती हैं । स्केल बार = २.५ mm. (C) एक ट्रांसजेनिक पत्ती (pPR1-YFP-एनएलएस plant) की मॉक घुसपैठ । नकली घुसपैठ में, 10 मिमी MgCl2 पत्ती के abaxial पक्ष में घुसपैठ की थी, समय-चूक इमेजिंग के बाद । नकली उपचार अस्थानिक pPR1 गतिविधि का कारण नहीं था और 13 hpi में क्लोरोफिल autofluorescence के साथ हस्तक्षेप नहीं किया । एक तीर नकली घुसपैठ की स्थिति को इंगित करता है । स्केल बार = २.५ mm। इन छवियों को पिछले एक अध्ययन से संशोधित किया गया9। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
तालिका 1: समय चूक इमेजिंग कार्यक्रम इस अध्ययन में इस्तेमाल किया ।
पूरक फिल्म 1: समय चूक फिल्म के spatiotemporal गतिशीलता दिखा pPR1 किसी ट्रांसजेनिक में सक्रियण Arabidopsis पत्ती निंनलिखित प्रभाव-ट्रिगर प्रतिरक्षा (एति) द्वारा प्रेरित Pst_a2 टीका । pPR1-YFP-एनएलएस के निर्माण को लेकर ट्रांसजेनिक पत्ती के abaxial पक्ष के एक हिस्से ने Pst_a2 (108 CFU/एमएल) के साथ घुसपैठ की थी । छवियां ४० h की कुल के लिए 3-ंयूनतम अंतराल पर अधिग्रहीत की गईं । दिखाए गए समय स्टांप dd स्वरूप में है: hh: mm: ss. sss । यह फिल्म पिछले एक अध्ययन9से संशोधित किया गया था । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
Discussion
यहां, हम एक सरल विधि की रिपोर्ट के लिए एक जीवित Arabidopsis पत्ती लंबी अवधि के लिए एक स्वचालित फ्लोरोसेंट stereomicroscope का उपयोग कर अवलोकन के लिए ब्याज की एक प्रमोटर के नियंत्रण में एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन व्यक्त माउंट । एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की समय-चूक इमेजिंग अक्सर रूट ऊतकों में प्रदर्शन किया गया है; हालांकि, केवल कुछ इसी तरह के अध्ययन पत्ती के ऊतकों में आयोजित किया गया है । यह सबसे अधिक संभावना है क्योंकि पत्तियां स्वतंत्र रूप से अंतरिक्ष में ले जाने में सक्षम हैं, जबकि जड़ें अक्सर दफन होती हैं और ठोस आगार माध्यम में तय होती हैं ।
इस रिपोर्ट में, हम Pst_a2द्वारा प्रेरित एति के दौरान pPR1 गतिविधि की spatiotemporal गतिशीलता पर ध्यान केंद्रित किया । इसके बाद के संस्करण विस्तृत पत्ती के कोमल निर्धारण के अलावा, यह स्पष्ट रूप से इस तरह के प्रमोटर सक्रियण और PCD के रूप में सेलुलर घटनाओं की spatiotemporal गतिशीलता कल्पना करने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि pPR1 गतिविधि और PCD दिखाने कोशिकाओं के बीच अंतर तेज नहीं है, सुनिश्चित करें कि घुसपैठ क्षेत्र में सेलुलर रिक्त स्थान के सभी पूरी तरह से रोगज़नक़ निलंबन (२.४ कदम देखें) के साथ भर रहे हैं । यह महत्वपूर्ण है जब व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति stereomicroscopes का उपयोग कर के बाद से इन सूक्ष्मदर्शी नमूना के एक ही ऊर्ध्वाधर स्थिति के साथ सभी जासूसी संकेतों पर कब्जा । क्लोरोफिल ऊपर या PCD डोमेन में कोशिकाओं के नीचे जीवित कोशिकाओं से autofluorescence को आसानी से मृत कोशिकाओं को प्रदर्शित नहीं autofluorescence मास्क । यह भी YFP संकेत के लिए सच है ।
समय के लिए शर्तों-चूक इमेजिंग विभिंन प्रायोगिक शर्तों के तहत कई प्रारंभिक प्रयोगों के माध्यम से ध्यान से स्थापित करने की आवश्यकता है । समय के लिए पैरामीटर-चूक इमेजिंग सूक्ष्म प्रणाली, ट्रांसजेनिक पौधों, और रोगजनकों जैसे कई कारकों पर निर्भर करतेहैं । इन मापदंडों को प्राप्त करने के लिए, हम पहले घुसपैठ की पत्ती में 7 hpi, जो लगभग pPR1के प्रारंभिक सक्रियण के साथ मेल खाता है में YFP संकेत तीव्रता के लिए विभिंन जोखिम बार विश्लेषण किया । एक 5 एस एक्सपोजर इस अध्ययन में इस्तेमाल किया stereomicroscope के साथ YFP संकेत पर कब्जा करने के लिए उपयुक्त के रूप में निर्धारित किया गया था । इसी तरह का परीक्षण इमेजिंग क्लोरोफिल autofluorescence के लिए किया गया था । 3 मिनट के अंतराल के बीच प्रकाश करने के लिए नमूना के एक्सपोजर अधिकतम जोखिम समय के साथ सामान्य उज्ज्वल फील्ड इमेजिंग के रूप में समय चूक इमेजिंग कार्यक्रम में क्रमादेशित किया गया था. हमारी प्रणाली (सामग्री की मेज) हमें YFP, TXR, और उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के अलावा २.५ मिनट के लिए अनुमति दी । यह बाधा एक 3 मिनट के अंतराल को चुनने के लिए प्राथमिक कारण था । अगले, हम पुष्टि की है कि इस समय चूक हालत संयंत्र नमूनों के लिए कोई स्पष्ट नुकसान का कारण बना है, और अस्थानिक प्रकाश तनाव से संबंधित सक्रियकरण pPR1 (चित्रा 3बी, सी) के प्रेरित नहीं किया । इस अध्ययन में इस्तेमाल कार्यक्रम के विकास के लिए नेतृत्व किया । इस प्रकार, प्रतिदीप्ति इमेजिंग के 3-ंयूनतम अंतराल Pst_a2मध्यस्थता एति9के दौरान pPR1 गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त समझा गया ।
प्रमोटर-रिपोर्टर, विशेष रूप से एनएलएस से जुड़े फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के साथ constructs, कई समूहों द्वारा उपयोग किया गया है, और अनुसंधान समुदाय से आसानी से उपलब्ध हैं; हम क्युबो एट अल द्वारा प्रकाशित निर्माण करते थे । 13. इस प्रकार, यहां वर्णित प्रोटोकॉल किसी भी संयंत्र जीव विज्ञान अध्ययन पत्ती ऊतकों की जांच में इस्तेमाल किया जा सकता है, अगर उचित ट्रांसजेनिक संयंत्रों उपलब्ध हैं । हमारे सरल और आसान प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं के लिए एक महान अवसर प्रदान करता है जो किसी भी जैविक ऐसी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में पत्तियों में होने वाली घटना की spatiotemporal गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए उत्सुक हैं । यह प्रशंसनीय है कि हमारे विधि टेप टुकड़े का उपयोग नमूनों पर एक मामूली शारीरिक तनाव लाती है । हालांकि, इस मुद्दे को उचित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सहित द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है, जैसे कि नकली उपचार, प्रयोगों में (चित्रा 3सी). प्रयोगात्मक शर्तों और संशोधित किया जा सकता है और विभिंन परिस्थितियों में इन नियंत्रणों का विश्लेषण द्वारा अनुकूलित ।
हाल के वर्षों में, इमेजिंग उपकरणों और तकनीकों के तीव्र विकास ने जैविक घटनाओं के जटिल spatiotemporal पहलुओं में शोधकर्ताओं के हित को उत्तेजित किया है । किसी भी इमेजिंग विश्लेषण में, उचित बढ़ते और नमूनों की फिक्सिंग सबसे महत्वपूर्ण मुद्दों में से एक हैं । बढ़ते रहने Arabidopsis इस अध्ययन में विकसित पत्तियों की सरल और बहुमुखी विधि लागू किया जा सकता है और विभिंन इमेजिंग प्रयोगों के लिए अनुकूलित ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम जापान के विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी द्वारा समर्थित किया गया था [PRESTO117665 to S.B., ERATOJPMJER1502 to N.N.] और विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी द्वारा (अनुदान-में अनुसंधान गतिविधि शुरू करने के लिए सहायता [२२८८०००८ के लिए S.B.] और युवा वैज्ञानिकों के लिए (ख) [ २३७८००४० से S.B.]) । हम Pst_a2 तनाव प्रदान करने के लिए उत्कृष्ट तकनीकी सहायता, जे पार्कर के लिए ए Senzaki, वाई सुजुकी, वाई Sugisawa और ई. Betsuyaku धंयवाद, और धेमुरा वेक्टर प्रदान करने के लिए टी. pBGYN ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD biosciences | 214010 | |
| Bacto Protease Peptone No. 3 | BD biosciences | 211693 | |
| Bacto Yeast Extract | BD biosciences | 212750 | |
| BM2 soil | Berger | ||
| Glycerol | nacalai tesque | 17017-35 | |
| Kanamycin sulfate | Wako | 113-00343 | |
| Leica M205FA with DFC365FX, LED_MCI and Leica EL6000 (Las X software-regulated) | Leica Microsystems | Yellow fluorescent protein (YFP) and Texas Red (TXR) filters installed | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako | 135-00165 | |
| Micro Slide Glass (Size: 76 mm × 26 mm, Thickness: 1.0–1.2 mm) | MATSUNAMI | S1112 | |
| Micropore Surgical Tape (1.25 cm × 9 m) | 3M | 1530-0 | |
| Needleless 1 ml plastic syringe | Terumo | SS-01T | |
| Plastic cell plug tray (cell size: 44 mm × 44mm × 44 mm) | Tanaka sangyo, Japan | htray-bk72 | Any tray with similar sized cells can be used |
| Rifampicin | nacalai tesque | 30259-81 | |
| Plastic Tape (0.2 mm thick × 19 mm wide × 10 m long) | Yamato | No0200-19-1 | Any plastic/vinyl tape with similar thickness can be used |
References
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