Summary
Divulgamos un método sencillo y versátil para realizar fluorescente live-proyección de imagen de hojas de Arabidopsis thaliana durante un período prolongado de tiempo. Utilizamos una planta Arabidopsis transgénica expresando un gen reportero fluorescente bajo el control de un promotor de inmunidad como un ejemplo para obtener comprensión espaciotemporal de inmunorespuestas de la planta.
Abstract
La respuesta inmune de planta asociada a una reprogramación transcripcional del genoma se inicia en el sitio de la infección. Por lo tanto, la respuesta inmune está regulada espacial y temporalmente. El uso de un gen fluorescente bajo el control de un promotor de relacionadas con la inmunidad en combinación con un microscopio de fluorescencia automatizada es una forma sencilla de entender la regulación espacio-temporal de la inmunidad de la planta. En contraste con los tejidos de la raíz que se han utilizado para un número de diversos experimentos de imagen fluorescentes intravital, existen algunos ejemplos de imágenes en vivo fluorescentes para los tejidos de la hoja que encontramos una gran variedad de infecciones microbianas aerotransportadas. Por lo tanto, hemos desarrollado un método simple para montar hojas de plantas de Arabidopsis thaliana para proyección de imagen de células vivas durante un período prolongado de tiempo. Utilizamos plantas transgénicas de Arabidopsis expresando la proteína fluorescente amarilla (YFP) genefused a la señal de localización nuclear (NLS) bajo el control del promotor de un gen marcador relacionadas con la defensa, () Pathogenesis-Related 1 PR1). Nos se infiltró en una hoja de transgénica con Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 (avrRpt2) (Pst_a2) la tensión y realizar proyección de imagen en vivo de Time-lapse de la señal YFP para un total de 40 h con un estereomicroscopio de fluorescencia automatizada. Este método puede ser utilizado no sólo para estudios en inmunorespuestas de la planta, sino también para el análisis de los diversos eventos del desarrollo y las respuestas ambientales que ocurren en los tejidos de la hoja.
Introduction
Respuesta inmune de las plantas implica una dinámica reprogramación transcripcional regulado por múltiples de la transcripción factores así como fitohormonas1. La acumulación de datos transcriptoma proporciona oportunidades para recoger información sobre el sistema de inmunológico de la planta: por ejemplo, la estructura de la red de señalización cascadas2. Sin embargo, nuestro conocimiento de la dinámica espacial y temporal de la inmunidad de la planta sigue siendo limitada3,4,5.
En estudios previos, Reglamento spatiotemporal de la expresión génica relacionados con la defensa ha sido mayormente analizada mediante hibridación in situ y un β-glucuronidasa (GUS) reportero ensayo6,7,8. Estos métodos nos permiten visualizar la activación transcripcional de diversos genes de interés in situ. Sin embargo, estos procedimientos requieren fijación química de las muestras y así resultan en la pérdida de toda la información temporal. Acontecimientos biológicos, como la inmunidad, progreso en el tiempo. El uso de la luciferasa como reportero ha permitido la captura de la dinámica temporal de la promotora de interés3. Sin embargo, ensayo de luciferasa requiere de un sustrato caro y detectores altamente sensibles. Para aumentar nuestra comprensión de los aspectos espacio-temporales de la respuesta inmune de planta usando un procedimiento simple, generamos transgénicas de Arabidopsis thaliana plantas que expresan la proteína fluorescente amarilla (YFP) gen fusionado a la señal de localización nuclear (NLS de YFP) bajo el control del promotor del gen marcador relacionadas con la defensa, Pathogenesis-Related 1 (PR1)9. Utilizamos la autofluorescencia de la clorofila, un marcador de células vivas, para capturar el proceso de muerte celular programada (PCD), que ocurre a menudo durante la inmunidad activada por efectores (ETI), una forma de inmunidad de la planta inducido por la infección de patógenos específicos9 , 10. monitoreo de la dinámica temporal de la intensidad de la señal de fluorescencia en libremente objetos en movimiento, tales como vida hojas de Arabidopsis , requiere una imagen compleja de procesamiento software construido en casa o disponible comercialmente. Alternativamente, evitar que ejemplares moviéndose es un método sencillo para resolver el problema. Aquí, se desarrolló un método versátil y simple para el montaje de vida hojas de una planta Arabidopsis transgénica para la observación a largo plazo bajo un estereomicroscopio de fluorescencia automatizada. El método nos permite capturar al promotor dinámica dentro de suelo cultivado intacta planta hojas durante unos días.
Protocol
Nota: Es importante para evitar el sueño movimiento de la hoja de vida de las muestras durante la proyección de imagen de Time-lapse. Para minimizar el estrés mecánico en las hojas, es necesaria fijación suave de las hojas. Sólo las muestras de hojas adecuadamente preparados producen Time-lapse imágenes adecuadas para distintos análisis de la imagen. Un protocolo de uso de plantas transgénicas de Arabidopsis expresando la fusión YFP-NLS bajo el control del promotor del gen PR1 (pPR1-YFP-NLS plantas) y Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 cepa (avrRpt2) (Pst_a2) se describe a continuación como ejemplo.
1. preparación de las plantas y los patógenos
- Rellenen una charola de plástico celular (Tabla de materiales) con suelo esterilizado.
- Siembre una semilla transgénica de Arabidopsis por célula (figura 1A).
- Transferencia de la bandeja a un cuarto de crecimiento mantenido a 23 ° C y crecen las plantas bajo luz blanca continua durante 2-3 semanas.
- Dos días antes de la inoculación del patógeno, la raya Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 avrRpt2 tensión (Pst_a2) de un stock de glicerol en NYG medio (peptona 5 g/L, extracto de levadura 3 g/L, glicerol 20 mL/L, agar bacteriológico 15 g/L, pH 7.0) que contiene 100 mg/L rifampicina y 50 mg/L de kanamicina e incubar a 28 ° C durante 48 h.
- Cosecha de las células bacterianas que aparecen en la superficie del medio con puntas de plástico, transferir a un tubo de plástico que contenía 10 mM de MgCl2y resuspender. Medir la densidad óptica (OD) de la solución a 600 nm (OD600). Ajustar la concentración celular final de células bacterianas a unidades de formación de colonias (UFC) de 108 / mL, que normalmente corresponde a OD600 = 0,211.
2. inoculación del patógeno
- Con cuidado corta un tapón de celda que contiene una planta de 2-3 semanas de edad sin dañar la planta. Encuentra la celda en una charola de celda vacía (2 x 2 células son suficientes) para mantener un buen equilibrio (figura 1B).
- Seleccione una hoja visiblemente saludable para la inoculación. En general, el tercero, cuarto y quinto deja (#3, #4 y #5, respectivamente, en la figura 1C) de la parte inferior de la planta son fáciles de manejar. Uso hojas en la misma posición en un conjunto de experimentos para mejor reproducibilidad. Agua del suelo con la planta antes de la inoculación para la proyección de imagen de lapso de tiempo a largo plazo.
- Opcionalmente, en el caso de análisis de promotores sensible al estrés como pPR1, para asegurar que las plantas no son naturalmente destacó, examinar las hojas bajo un estereomicroscopio de fluorescencia antes de la inoculación del patógeno para verificar la ausencia de señal YFP. Excluir deja señal YFP de muestra del experimento.
- Guantes desechables latex antes de la infiltración para evitar el contacto directo con el patógeno. Cuidadosamente usando una jeringa de plástico sin aguja de 1 mL, infiltrarse en el lado abaxial de la hoja con la suspensión bacteriana (108 UFC/mL)11 (figura 1D). Inoculación de una pequeña porción en la mitad de la hoja permite una buena visualización de actividad pPR1 ; el área infiltrado se hace visible como color en comparación con las restantes hojas verde más oscuro. Ser extremadamente cuidadoso para no causar daños mecánicos a la hoja durante la infiltración.
Nota: Asegúrese de que estén todos los espacios intercelulares en el área infiltrado (verticalmente) satisfecho con la suspensión del agente patógeno; de lo contrario, el dominio PCD serán difícil de visualizar bajo el estereomicroscopio fluorescente. Esto puede confirmarse simplemente por terminación de verde oscuro en la zona infiltrada. - Absorber el exceso de suspensión bacteriana de la zona que rodea la sección infiltrada de la hoja infiltrada con una toalla de papel suave.
3. montaje de la hoja inoculada
- Inmediatamente después de la inoculación, fijar un portaobjeto en la bandeja de plástico con cinta quirúrgica (Tabla de materiales) tal que la hoja infiltrada está situada en el centro de la diapositiva de cristal. Asegúrese de que la hoja inoculada es totalmente colocada en el portaobjetos de cristal (figura 2A).
- Preparar dos capas de cinta plástica (en el caso de cinta espesor de 0,2 mm, véase Tabla de materiales) y cortado en dos piezas (figura 2B, piezas 1 y 2) para adaptarse a los espacios a lo largo del pecíolo de la hoja infiltrada. Organizar la duración de estas dos piezas, indicado con una flecha de dos puntas en la figura 2B, para caber en la longitud de la flecha de dos puntas que se muestra en la figura 2A.
Nota: Cortando una esquina de cada una de las dos piezas ayuda a evitar daños a la hoja (figura 2B, puntas de flecha; véase también el paso 3.4 a continuación). Cualquier tipo de cinta de plástico con espesor similar es conveniente para hacer un puente sobre el peciolo. La rigidez de la cinta de plástico es importante para facilitar el manejo durante el procedimiento que se describe a continuación. - Usando un par de Pinzas finas, pegar piezas de cinta 1 y 2 en ambos lados del pecíolo que alineen las esquinas de corte de cada pieza con la base de la hoja (figura 2C). Asegúrese de que las piezas de la cinta no toquen la cuchilla, hoja o pecíolo.
Nota: Estas piezas de cinta de plástico de doble capa en la base de la hoja actúan como espaciadores y evitar el estrés físico en el peciolo durante el montaje. - Una pieza adicional de dos capas de cinta plástica (figura 2B, pieza 3) se preparan para ajustarse al tamaño de la flecha de dos puntas en la figura 2B y pegarlo en la parte superior las piezas de la cinta 1 y 2 para formar un puente sobre el peciolo ( Figura 2D, E). Tenga sumo cuidado de no coger la hoja pecíolo y hoja directamente entre los trozos de cinta en las posiciones indicadas con flechas en la figura 2D, E.
- Suavemente se pegan un pedazo pequeño de cinta quirúrgica (figura 2F, pieza 4) en la diapositiva de cristal encima de la punta de la hoja para que la hoja se fija muy suavemente en el portaobjetos de cristal. Sólo Presione firmemente hacia abajo la parte de la cinta quirúrgica directamente tocando el portaobjetos de cristal (figura 2F, área se indica con una línea roja discontinua), no la otra parte que cubría la hoja.
- Suavemente pegar otro trozo pequeño de cinta quirúrgica (figura 2G, pieza 5) en la frontera del pecíolo y cinta plástica piezas (1, 2 y 3) para que el peciolo se fija muy suavemente sobre el portaobjetos de vidrio y cinta de plástico piezas. Sólo Fije firmemente la pieza de la cinta quirúrgica directamente tocando el portaobjetos de vidrio portaobjetos de vidrio y piezas de plástico de la cinta (figura 2G, área se indica con una línea roja discontinua), no la otra parte que el peciolo.
- Impiden el movimiento en el campo de visión del microscopio usando puntas de pipeta de 200 μl (figura 2H) hojas vecinas. Inserte las puntas de la pipeta en el suelo para sostener suavemente las hojas vecinas de la hoja infiltrada. Tenga cuidado de no insertar las puntas demasiado profundas en el suelo para evitar daños en posible raíz.
Nota: La planta preparada está lista para la proyección de imagen de Estereomicroscopio de la fluorescencia.
4. microscopio Observación de Time-lapse
- Encender el fluorescente Estereomicroscopio.
Nota: Aquí, un estereomicroscopio automatizada equipada con una alta sensibilidad monocromo de 1,4 megapíxeles cámara digital en modo de 12 bits se utiliza (Tabla de materiales). El microscopio debe colocarse en un cuarto oscuro con una unidad de aire acondicionado o en un gabinete oscuro con ventilación adecuada para mantener la temperatura a 23 ° C durante la proyección de imagen de Time-lapse. - Establecer la planta en el espacio sobre el objetivo de Estereomicroscopio para la proyección de imagen.
- Establecer los parámetros para la proyección de imagen de Time-lapse (ver ejemplos en tabla 1). Asegúrese de que a pasos de programa por exposición a la luz durante el intervalo de Time-lapse de imágenes ya que la luz tiene un gran impacto en planta inmunidad12.
- Utilizar el filtro convencional de YFP (excitación 500-520 nm; emisión 540-580 nm) para visualizar la señal YFP.
- Utilizar el filtro rojo de Texas (TXR) (excitación 540-580 nm; pase largo de emisión 610 nm) para visualizar la autofluorescencia de la clorofila por lo que el dominio de la PCD es visible como una zona oscura (sin autofluorescencia) rodeada de YFP-positive células capas9 (figura 3 A).
- Utilice la configuración convencional campo epi-brillante para medidas de exposición a la luz adicional.
Nota: Antes del experimento, medir la potencia de la fuente de luz brillante epi y ajustar el nivel de condición del crecimiento propio de la planta.
- Ejecute el programa de lapso de tiempo. Para la observación a largo plazo durante varios días, considerar riego la planta adecuadamente, por ejemplo, durante la exposición a la luz.
- Después de la adquisición de la imagen, omitir canales extras utilizados para la exposición a la luz en los intervalos (que corresponde a los canales 3-8 en la tabla 1) desde el conjunto de datos. Analizar los datos con diversos métodos, como el análisis de regiones de interés (ROI), utilizando software de análisis de imagen diferente como Fiji9.
Representative Results
Aquí, utilizamos Pst_a2-inducida a ETI como un ejemplo para la proyección de imagen de Time-lapse. Se obtuvieron datos de lapso de tiempo como una serie de imágenes, algunas de las cuales se muestran en la figura 3By como una película Time-lapse (suplementario 1 película)9. En experimentos exitosos pPR1-YFP-NLS durante Pst_a2-ETI inducida, activación transitoria de pPR1 observó, como evidente de YFP expresando los focos, en varias capas de células que rodean el dominio PCD (figura 3B) 9. la activación de pPR1 en células que rodean el dominio PCD generalmente comienza en aproximadamente 5 horas post la inoculación (hpi), picos en aproximadamente 12 hpi y dura hasta 40 hpi (figura 3B)9. Puesto que las imágenes fueron adquiridas mediante un sistema de epi-fluorescente, las señales YFP obtenidas aquí se generaron varias capas de células adaxial, incluyendo las células mesophyll epidérmico como superior.
Figura 1 : Método utilizado para la infiltración de patógenos bacterianos en el Arabidopsis thaliana hoja de. (A) dos a tres semanas de edad Arabidopsis plantas fueron cultivadas en un alveolas. (B) una célula enchufe que contiene la planta seleccionada para inoculación y observación fue cortada y colocada en la charola de celda vacía para mantener el equilibrio. (C) El tercero, cuarto y quinto deja (#3, #4 y #5, respectivamente) son adecuados para el análisis de la imagen. (D) la infiltración de la suspensión del agente patógeno en una hoja seleccionada, utilizando una jeringa sin aguja. Se reconoce la zona infiltrada basado en su color verde más oscuro que la hoja restante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Método utilizado para el montaje de los infiltrados Arabidopsis hoja para Time-lapse de imágenes. (A) fotografía de la planta Arabidopsis con una diapositiva de cristal fijada en la hoja inoculada. La hoja infiltrada fue colocada en el centro de la diapositiva de cristal. La doble flecha indica la longitud de los separadores de plástico. (B) elaboración de separadores de cinta plástica y puente. Doble - capas de cinta plástica fue cortado en dos piezas (1 y 2) para los separadores y otra pieza (3, se indica con una línea roja discontinua) fue cortado para preparar un puente. Las longitudes de las flechas de dos puntas son casi idénticas a la longitud de la flecha de dos puntas (A). Una de las cuatro esquinas de las piezas 1 y 2, indicadas con flechas, fueron cortados. (C) dos trozos de cinta de plástico de dos capas (numerados como 1 y 2) fueron cuidadosamente pegados sobre el vidrio de corredera por el peciolo con un par de Pinzas finas, sin hacer contacto directo con la hoja pecíolo y hoja. (D) una pieza adicional de doble capa cinta plástica (numerada como 3), que fue preparada desde (B), se colocó en ambos espaciadores basals (1 y 2) para formar un puente sobre el peciolo, asegurando no para coger el pecíolo entre cintas 1 y 2 en posiciones indicadas con flechas. (E) fotografía que mostraba el peciolo con cinta. Es importante no coger tejido vegetal directamente entre las piezas de cinta de plástico en las posiciones indicadas con flechas. Funa pequeño pedazo de la cinta quirúrgica (numerado como 4) había pegado suavemente en el portaobjetos de cristal alrededor de la punta de la hoja. Solamente el área delineado por la línea roja discontinua se presionó firmemente el portaobjetos de vidrio. (G) otro pequeño pedazo de la cinta quirúrgica (numerado como 5) había pegado suavemente en la frontera entre el peciolo y pedazos de cinta de plástico. Solamente el área delineado por la línea roja discontinua se presionó para la fijación el pecíolo suavemente en el vidrio de corredera y pedazos de cinta de plástico. Puntas de pipeta desechables (H) dos fueron utilizadas para evitar que se mueva en el campo de visión de la Estereomicroscopio hojas vecinas. Las puntas de pipetas fueron insertadas directamente en el suelo en posiciones apropiadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Representante resultados con el Arabidopsis hoja de montaje método. (A) fluorescente imágenes estereoscópica de una hoja de Arabidopsis transgénica (pPR1-YFP-NLS planta). Una porción de la hoja fue infiltrada con Pst_a2 (108 UFC/mL) en su superficie abaxial, y las imágenes fueron capturadas en 22 horas post inoculación (hpi). Núcleos en que se activó el promotor pPR1 fueron detectados utilizando el filtro YFP y muerte celular programada (PCD) fue detectada basado en la pérdida de la autofluorescencia de la clorofila con el filtro rojo de Texas (TXR). Barra de escala = 2,5 mm. (B) unas imágenes de lapso de tiempo seleccionadas de una colección de 800 imágenes obtenidas utilizando el protocolo descrito aquí. Estos datos proporcionan un resumen en vivo de la dinámica espaciotemporal de actividad pPR1 para hpi 40. Se muestran imágenes combinadas de YFP y TXR imágenes. Barra de escala = Mock infiltración de 2,5 mm. (C) de una hoja transgénica (pPR1-YFP-NLS planta). En infiltración falsa, 10 mM de MgCl2 fue infiltrado en el lado abaxial de la hoja, seguido por la proyección de imagen de Time-lapse. Tratamiento simulado no causó actividad ectópica pPR1 y no interfirió con la autofluorescencia de la clorofila a hpi 13. Una flecha indica la posición de infiltración simulada. Barra de escala = 2,5 mm. Estas imágenes fueron modificadas de un anterior estudio9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Programa Time-lapse de imagen utilizada en este estudio.
Adicional 1 de la película: película Time-lapse que muestra la dinámica espacio-temporal de la pPR1 activación de un transgénico Arabidopsis hoja siguiente activada por efectores de la inmunidad (ETI) inducida por Pst_a2 inoculación. Una porción de la parte abaxial de una hoja transgénica que el constructo pPR1-YFP-NLS fue infiltrada con Pst_a2 (108 UFC/mL). Se adquirieron imágenes en intervalos de 3 minutos para un total de 40 h. La hora que se muestra está en el formato dd:hh:mm:ss.sss. Esta película fue modificada de un anterior estudio9. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Discussion
Aquí, Divulgamos un método sencillo para montar una vida hoja de Arabidopsis expresando un gen reportero fluorescente bajo el control de un promotor de interés para la observación a largo plazo mediante un estereomicroscopio fluorescente automatizado. Imágenes de Time-lapse de un reportero fluorescente se ha realizado con frecuencia en los tejidos de la raíz; sin embargo, sólo unos pocos estudios similares se han realizado en tejidos de la hoja. Esto es más probable porque las hojas son capaces de moverse libremente en el espacio, mientras que las raíces son a menudo enterradas y fija en medio de agar sólido.
En este informe, nos concentramos en la dinámica espacio-temporal de la actividad pPR1 en ETI inducida por Pst_a2. Además de la fijación suave de la hoja detallada anteriormente, es importante visualizar claramente la dinámica espacio-temporal de eventos celulares tales como activación promotor y PCD. Si la distinción entre células que muestran actividad pPR1 y PCD no es fuerte, asegúrese de que todos los espacios intercelulares en el área infiltrado están completamente llenos con la suspensión del patógeno (ver paso 2.4). Esto es crítico cuando con Estereomicroscopio de fluorescencia de campo amplio ya que estos microscopios capturan todas las señales detectables a lo largo de la misma posición vertical de la muestra. Autofluorescencia de la clorofila de las células sobrevivientes por encima o por debajo de las células en el dominio PCD enmascara fácilmente las células muertas, no exponiendo autofluorescencia. Esto también es cierto para la señal de YFP.
Condiciones para Time-lapse de imágenes necesitan ser establecidos cuidadosamente a través de varios experimentos preliminares bajo diferentes condiciones experimentales. Parámetros para Time-lapse de imágenes dependen de varios factores tales como el sistema microscópico, las plantas transgénicas y patógenos. Para obtener estos parámetros, en primer lugar analizamos diferentes tiempos de exposición de intensidad de la señal YFP en la hoja infiltrada en 7 hpi, que casi coincide con la activación inicial de pPR1. Una exposición s 5 se determinó como apropiado para la captura de señal YFP con el estereomicroscopio utilizado en este estudio. Se realizó una prueba similar para imágenes de Autofluorescencia de la clorofila. Exposición de la muestra a la luz entre intervalos de 3 minutos se programó en el lapso de tiempo programa de imagen como proyección de imagen de campo claro normal con tiempo de exposición máxima. Nuestro sistema (Tabla de materiales) nos permitió tener 2,5 min además de YFP, TXR y proyección de imagen de campo claro. Esta restricción fue la razón principal para elegir un intervalo de 3 minutos. A continuación, se confirmó que esta condición de Time-lapse no causado ningún daño aparente a las muestras de la planta y no indujo ectópica luz activación relacionada con el estrés de pPR1 (figura 3B, C). Esto condujo al desarrollo del programa utilizado en este estudio. Así, intervalos de 3 minutos de imágenes por fluorescencia se consideraron suficientes para capturar la dinámica pPR1 durante Pst_a2-mediada por ETI9.
Construcciones de promotor-reportero, especialmente con el reportero fluorescente fundido a la NLS, han sido utilizadas por muchos grupos y son fácilmente disponible de la comunidad de investigación; hemos utilizado el constructo publicado por Kubo et al. 13. así, el protocolo descrito aquí puede utilizarse en cualquier estudio de Biología de la planta examinando tejidos de la hoja, si se dispone de adecuadas plantas transgénicas. Nuestro protocolo simple y fácil ofrece una gran oportunidad para los investigadores que están dispuestos a analizar la dinámica espacio-temporal de cualquier evento biológico que ocurre en las hojas, como la respuesta inmune. Es plausible que nuestro método usando piezas de cinta induce un estrés físico leve en las muestras. Sin embargo, este problema puede controlarse mediante la inclusión de controles positivos y negativos adecuados, tales como tratamientos de simulacros, en los experimentos (figura 3C). Las condiciones experimentales pueden modificadas y optimizadas mediante el análisis de estos controles en diferentes condiciones.
En los últimos años, desarrollo rápido de imagen instrumentos y técnicas ha estimulado el interés de los investigadores en los aspectos espacio-temporales complejos de fenómenos biológicos. En cualquier análisis de proyección de imagen, montaje y fijación de muestras adecuadas son entre los temas más importantes. El método sencillo y versátil de montaje vida que hojas de Arabidopsis desarrollado en este estudio pueda ser aplicado y optimizado para varios experimentos de proyección de imagen.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Japón Agencia de ciencia y tecnología [PRESTO117665 a S.B., ERATOJPMJER1502 a N.N.] y por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (subvenciones para investigación actividad puesta en marcha [22880008 a S.B.] y [jóvenes científicos (B) 23780040 a S.B.]). Agradecemos A. Senzaki, Y. Suzuki, Y. Sugisawa y E. Betsuyaku asistencia técnica excelente, J. Parker para proporcionar la tensión de Pst_a2 y T. Demura para proporcionar el vector de pBGYN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD biosciences | 214010 | |
| Bacto Protease Peptone No. 3 | BD biosciences | 211693 | |
| Bacto Yeast Extract | BD biosciences | 212750 | |
| BM2 soil | Berger | ||
| Glycerol | nacalai tesque | 17017-35 | |
| Kanamycin sulfate | Wako | 113-00343 | |
| Leica M205FA with DFC365FX, LED_MCI and Leica EL6000 (Las X software-regulated) | Leica Microsystems | Yellow fluorescent protein (YFP) and Texas Red (TXR) filters installed | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako | 135-00165 | |
| Micro Slide Glass (Size: 76 mm × 26 mm, Thickness: 1.0–1.2 mm) | MATSUNAMI | S1112 | |
| Micropore Surgical Tape (1.25 cm × 9 m) | 3M | 1530-0 | |
| Needleless 1 ml plastic syringe | Terumo | SS-01T | |
| Plastic cell plug tray (cell size: 44 mm × 44mm × 44 mm) | Tanaka sangyo, Japan | htray-bk72 | Any tray with similar sized cells can be used |
| Rifampicin | nacalai tesque | 30259-81 | |
| Plastic Tape (0.2 mm thick × 19 mm wide × 10 m long) | Yamato | No0200-19-1 | Any plastic/vinyl tape with similar thickness can be used |
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