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Biology

उच्च दबाव ठंड, माइक्रोवेव की सहायता के विपरीत वृद्धि, और मात्रा इमेजिंग के लिए ंयूनतम राल Embedding द्वारा जैविक नमूना तैयारी

Published: March 19, 2019 doi: 10.3791/59156
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Electron Microscopy Core Unit, Max Planck Institute of Experimental Medicine, 2Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (CNMPB)

Summary

यहां हम दो नमूना प्रसंस्करण तकनीकों, उच्च दबाव ठंड और माइक्रोवेव सहायता नमूना प्रसंस्करण, एक केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (FIB-SEM) के साथ डेटा प्राप्त करने के लिए ंयूनतम राल embedding द्वारा पीछा के संयोजन के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है । यह एक माउस टिबियल तंत्रिका नमूना और caenorhabditis एलिगेंसका उपयोग कर प्रदर्शित किया जाता है.

Abstract

वर्णित नमूना तैयारी तकनीक एक केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (FIB-SEM), जो प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है में इमेजिंग साधन के लिए सबसे उपयुक्त विपरीत के साथ ultrastructural संरक्षण की सबसे अच्छी गुणवत्ता गठबंधन करने के लिए बनाया गया है 3 डी पुनर्निर्माण और मॉडलिंग के लिए अनुक्रमिक छवियों के ढेर । उच्च दबाव ठंड (HPF) देशी संरचनात्मक संरक्षण के लिए बंद की अनुमति देता है, लेकिन बाद में स्थिर प्रतिस्थापन अक्सर पर्याप्त विपरीत प्रदान नहीं करता है, विशेष रूप से एक बड़ा नमूना है, जो उच्च गुणवत्ता के लिए आवश्यक है के लिए 3 डी SEM में इमेजिंग पुनर्निर्माण. इसलिए, इस प्रोटोकॉल में, स्थिर प्रतिस्थापन के बाद, अतिरिक्त विषम कदम कमरे के तापमान पर किए जाते हैं । हालांकि इन चरणों एक माइक्रोवेव में प्रदर्शन कर रहे हैं, यह भी पारंपरिक बेंच प्रसंस्करण, जो अब ऊष्मायन बार की आवश्यकता का पालन करने के लिए संभव है । राल की ंयूनतम मात्रा में बाद embedding तेजी से और अधिक सटीक लक्ष्यीकरण और FIB-SEM अंदर तैयारी के लिए अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल के नमूनों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है कि एक विश्वसनीय ultrastructural संरक्षण के लिए उच्च दबाव ठंड के द्वारा तैयारी की आवश्यकता है, लेकिन मात्रा FIB-SEM का उपयोग इमेजिंग के लिए फ्रीज प्रतिस्थापन के दौरान पर्याप्त विपरीत लाभ नहीं है । न्यूनतम राल embedding के साथ संयोजन में, इस प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता वाले वॉल्यूम डेटा के अधिग्रहण के लिए एक कुशल कार्यप्रवाह प्रदान करता है ।

Introduction

उच्च दबाव ठंड उच्च गुणवत्ता वाले ultrastructural संरक्षण, जो एक नमूना बहुत पारंपरिक तैयारी रासायनिक निर्धारण1का उपयोग कर तरीकों से बेहतर की देशी राज्य का प्रतिनिधित्व करता है प्राप्त करने के लिए पसंद का नमूना तैयारी विधि है । इस cryo-तैयारी विधि ऐसे myelinated माउस ऊतक2 के रूप में नमूनों के लिए उपयोगी है और मॉडल जीव Caenorहैबडाइटिस एलिगेंस3के उपयोग के लिए एक सख्त आवश्यकता है । प्रतिस्थापन और राल embedding फ्रीज के बाद, इन नमूनों आमतौर पर संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) या इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (एट) द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । यदि बड़ी मात्रा में FIB-SEM या धारावाहिक ब्लॉक-उच्च संकल्प बड़े पैमाने पर 3 डी reconstructions के लिए चेहरा इमेजिंग का उपयोग कर imaged होना चाहिए, हमारे अनुभव में SEM द्वारा उचित इमेजिंग अक्सर विपरीत की कमी से बाधित है । FIB-SEM में, छवि आमतौर पर प्राथमिक इलेक्ट्रॉन बीम से backscattered इलेक्ट्रॉनों का पता लगाने के द्वारा दर्ज की गई है । backscattered इलेक्ट्रॉनों की उपज नमूने में भारी धातुओं की सामग्री के लिए आनुपातिक है । इसलिए, प्रोटोकॉल विशेष रूप से अतिरिक्त भारी धातु impregnation द्वारा कंट्रास्ट को बढ़ाने के लिए वॉल्यूम इमेजिंग के लिए डिज़ाइन किए गए थे । इस तरह के तरीकों रासायनिक रूप से तय नमूनों पर आधारित है और आज़मियम टेट्रॉक्साइड का एक संयोजन लागू-thiocarbohydrazide-आज़मियम टेट्रॉक्साइड4, के रूप में knott एट अल.5द्वारा वर्णित है, धारावाहिक ब्लॉक के लिए-चेहरा और ध्यान केंद्रित आयन बीम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग । formamide और पाइरीगैलोल6 या सीसा aspartate7 के उपयोग सहित संशोधनों को सफलतापूर्वक अलग इमेजिंग तकनीकों के लिए लागू किया गया है ।

प्रोटोकॉल यहां उपलब्ध cryo-HPF द्वारा नमूनों की तैयारी को जोड़ती है और बाद माइक्रोवेव के साथ प्रतिस्थापन फ्रीज-सहायता प्रसंस्करण के लिए बढ़ाया विपरीत के लिए thiocarbohydrazide का उपयोग कर/ हम चूहों और Caenorहैबडाइटिस elegans, जो उच्च गुणवत्ता वाले ultrastructural संरक्षण के लिए उच्च दबाव ठंड की आवश्यकता होती है नमूनों का प्रतिनिधित्व में myelinated nervus टिबियल्स पर यह प्रदर्शित करता है । इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि कैसे, निर्जलीकरण और घुसपैठ के बाद, नमूनों के साथ संभव के रूप में छोटे राल के रूप में एंबेडेड हैं । इस ंयूनतम राल embedding8 ब्याज की संरचना के तेजी से लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति देता है और कम समय आयन बीम के साथ ब्याज के क्षेत्र को उजागर करने के लिए आवश्यक सहित नमूना प्रसंस्करण पर खर्च कम करता है । माइक्रोस्कोप के अंदर आगे नमूना तैयार करने के कदम के बाद, इमेजिंग और नमूना की मिलिंग लगातार किया जाता है एक छवियों के ढेर प्राप्त करने के लिए । 3 डी दृश्य के लिए, छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (IMOD) डेटासेट के कुछ हिस्सों का पुनर्निर्माण करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

हमारे कार्यप्रवाह का वर्णन करता है कि कैसे सबसे उपयुक्त मात्रा इमेजिंग के लिए नमूनों की विषम HPF और फ्रीज प्रतिस्थापन द्वारा सबसे अच्छा ultrastructural संरक्षण के साथ जोड़ा जा सकता है । यह कड़ाई cryo-तैयारी की आवश्यकता होती है कि नमूनों के लिए उपयोगी है । आवेदन HPF द्वारा तैयार किया जा सकता है कि छोटे नमूनों तक ही सीमित हैं । विभिन्न प्रकृति के नमूनों में, जैसे पादप सामग्री या सूक्ष्मजीवों के लिए, इस प्रोटोकोल में अनुकूलन की आवश्यकता होती है ।

Protocol

यहां वर्णित पशुओं के नमूनों सहित सभी प्रयोगों को संस्थागत पशु परिचर्या और ग्राहक संरक्षण और खाद्य सुरक्षा (लेवएस) के लिए लोअर सैसेनी राज्य कार्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. उच्च दबाव ठंड और स्थिर प्रतिस्थापन

  1. एक चूहे (जैसे, C57Bl6N, 12 सप्ताह, महिला)9से nervus टिबियल्स काटना ।
  2. फॉस्फेट buffered खारा (PBS) और 2 मिमी लंबाई के टुकड़ों में कटौती (5 मिलीलीटर में PVP के 1 जी) 20% पॉलीविनिलपाइररोलिडोन की एक छोटी बूंद में nervus टिबियल्स विसर्जित कर दिया । फिर, यह एक धातु नमूना वाहक में जगह (एक, ०.२ मिमी गहराई) ठीक forceps का उपयोग कर । एक और फ्लैट वाहक जोड़ें (प्रकार बी) एक ढक्कन के रूप में hexadecane की एक पतली परत के साथ लेपित और नमूना कारतूस में इस विधानसभा डालें ।
  3. स्थानांतरण एम९ में 20% गोजातीय सीरम एल्ब्युन (bsa) के एक छोटी बूंद में निलंबित कई C. एलिगेंस ( सामग्री की तालिकादेखें) धातु वाहक में एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक पिपेट के साथ (प्रकार एक). फिर, शीर्ष (प्रकार बी) पर ढक्कन के रूप में एक दूसरे वाहक जोड़ें और कारतूस इकट्ठा ।
  4. दोनों नमूनों के लिए, निम्न के साथ आगे बढ़ें: उच्च दबाव के एक-एक करके एक-एक करके उन्हें उच्च दबाव फ्रीजर के लोडिंग स्टेशन में तीन टुकड़ा कारतूस में लोड करके नमूना वाहक असेंबलियों फ्रीज । निर्माता के ऑपरेटिंग निर्देशों के अनुसार प्रक्रिया बटन दबाएँ.
    नोट: दोनों प्रकार के नमूनों को अनुवर्ती फ्रीज़ प्रतिस्थापन में एक साथ संसाधित किया जा सकता है ।
  5. एसीटोन में जमे हुए ०.१% टैनिक एसिड की 2 मिलीलीटर युक्त cryovials में नमूनों प्लेस । तरल नाइट्रोजन के एक स्नान में स्थानांतरित करने के लिए विल्स में द्रव नाइट्रोजन spilling के बिना । एक स्वत: फ्रीज प्रतिस्थापन इकाई में10 सेट-९० डिग्री सेल्सियस में cryovials स्थानांतरण और कार्यक्रम शुरू करते हैं ।
    नोट: नमूनों को १०० एच के लिए-९० डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है । ओस्मीफिकेशन के लिए ओस्मीयम टेट्रोक्साइड11की वृद्धि को बढ़ाने के लिए मोडैन्ट के रूप में प्रयोग किया जाता है इससे पहले कि टैनिक अम्ल
  6. मैन्युअल रूप से नमूने 3x 30 मिनट के लिए-९० ° c फ्रीज प्रतिस्थापन इकाई में एसीटोन के 2 मिलीलीटर के साथ धोने ।
  7. 7 एच में-९० डिग्री सेल्सियस के लिए स्वत: फ्रीज प्रतिस्थापन इकाई में जारी धुंधला के लिए एसीटोन में 2% आज़मियम टेट्रोक्साइड, ०.१% यूरेनिल एसीटेट के 2 एमएल में नमूनों को छोड़ दें ।
    चेतावनी: osmium टेट्रॉक्साइड विषाक्त है और एक धूआं हुड के नीचे संभाला जाना चाहिए, और सुरक्षात्मक उपकरणों पहना जाना चाहिए ।
    नोट: स्थिर प्रतिस्थापन इकाई तापमान को स्वचालित रूप से उठाती है-20 ° c पर 5 ° c/ नमूने फ्रीज प्रतिस्थापन इकाई में 16 एच के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है । तापमान को स्वचालित रूप से 4 डिग्री सेल्सियस से 10 डिग्री सेल्सियस/ज पर उठाया जाएगा ।
  8. तापमान 4 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच गया है जब शुद्ध एसीटोन के साथ आज़मियम टेट्रोक्साइड समाधान विनिमय. क्रियोविल्स को फ्रीज प्रतिस्थापन इकाई से निकालें ।

2. माइक्रोवेव-असिस्टेड प्रोसेसिंग

नोट: तापमान स्थिर रखने के लिए एक तापमान नियंत्रण इकाई का उपयोग12 कमरे के तापमान पर निम्नलिखित चरणों के सभी प्रदर्शन ( सामग्री की मेजदेखें).

  1. रिएक्शन ट्यूब की टोपियां माइक्रोवेव में प्रोसेसिंग के दौरान ओपन कर दें ।
  2. एक घड़ी ग्लास डिश (१५० मिमी) में एसीटोन में जलमग्न नमूनों को रखते हुए, धातु नमूना वाहक क्रायोविल्स से बाहर ले लो और ठीक संदंश या एक सुई का उपयोग कर धातु वाहक से नमूनों को हटा दें ।
  3. नमूने को 2 मिलीलीटर रिएक्शन ट्यूबों में ठीक संदंश या एक पिपेट का उपयोग कर स्थानांतरित करें और २५० W पर ४० s के लिए चार बार एसीटोन के 1 मिलीलीटर के साथ धो लें ।
    चेतावनी: थियोक्सरबोहाइड्रेज़ाइड विषाक्त है और एक धूआं हुड के तहत संभाला जाना चाहिए, सुरक्षात्मक उपकरणों पहना जाना चाहिए ।
  4. १५० डब्ल्यू में 14 मिनट के लिए एसीटोन में 1% थायोक्सरबोहाइड्रेज़ाइड के 1 एमएल के साथ इसके विपरीत वृद्धि के नमूने दाग । धुंधला प्रदर्शन करने के लिए, रिएक्शन ट्यूब में thiocarbohydrazide समाधान पिपेट, माइक्रोवेव में ट्यूब जगह है, और १५० W के एक शक्ति के स्तर पर कार्यक्रम सेट (वैक्यूम समारोह के साथ चालू) 2 मिनट के लिए पर/2 मिनट बंद, 14 मिनट के लिए iterating कुल । माइक्रोवेव शुरू करें ।
    नोट: थायोक्सरबोहाइड्रेज़ाइड फ्रीज प्रतिस्थापन के दौरान लागू किया गया था कि आज़मियम टेट्रॉक्साइड के साथ प्रतिक्रिया करता है । यह एक पुल रूपों, और अधिक आज़मियम टेट्रॉक्साइड मूल आज़मियम टेट्रोक्साइड13साइटों पर जमा किया जा करने की अनुमति ।
  5. ४० एस के लिए एसीटोन के 1 एमएल के साथ नमूने 4x धोने २५० डब्ल्यू में एसीटोन एक रिएक्शन ट्यूब, माइक्रोवेव में ट्यूब जगह, और ४० एस के लिए २५० डब्ल्यू का चयन करें । माइक्रोवेव शुरू करो ।
  6. १५० डब्ल्यू में 14 मिनट के लिए एसीटोन में 2% आज़मियम टेट्रोक्साइड के 1 मिलीलीटर में दाग एक प्रतिक्रिया ट्यूब में आज़मियम टेट्रोक्साइड समाधान, माइक्रोवेव में ट्यूब प्लेस, और १५० डब्ल्यू के एक शक्ति के स्तर पर कार्यक्रम सेट (वैक्यूम समारोह के साथ चालू) 2 मिनट के लिए/ , 14 मिनट के लिए iterating कुल । माइक्रोवेव शुरू करें ।
  7. २५० W में ४० s के लिए एसीटोन के 1 मिलीलीटर के साथ नमूने 4x धो (के रूप में २.५ कदम में किया) ।
  8. एसीटोन में राल की सांद्रता में 1 मिलीलीटर की वृद्धि के साथ घुसपैठ ( सामग्री की तालिकादेखें) 25%, ५०%, ७५%, ९०%, १००%, और १००% के लिए 3 मिनट प्रत्येक के लिए एक प्रतिक्रिया ट्यूब में राल पिपेट, माइक्रोवेव में ट्यूब जगह, और एक शक्ति लेवे करने के लिए कार्यक्रम निर्धारित २५० W के एल (वैक्यूम समारोह के साथ) 3 मिनट के लिए चालू कर दिया । माइक्रोवेव शुरू करें ।

3. ंयूनतम राल embedding8

  1. एक दंतखोदनी के साथ रिएक्शन ट्यूब से बाहर और उंहें प्लास्टिक की फिल्म के एक टुकड़े पर जगह ( सामग्री की मेजदेखें) nervus टिबियालिस और सी एलिगेंस ले लो ।
  2. टूथपिक का प्रयोग धीरे से प्लास्टिक की फिल्म पर चारों ओर नमूना धक्का जब तक कोई शेष राल का पता चला है । हीटिंग के लिए एक हलोजन लैंप का प्रयोग करें ( सामग्री की मेजदेखें) तो राल कम चिपचिपा हो जाता है और अधिक आसानी से हटाया जा करने में सक्षम है । हैलोजन लैंप के पास पर्याप्त राल गर्मी के लिए जगह (सावधान किया जा रहा है हाथ जला नहीं) ।
  3. पॉलीमेरीज के नमूनों को ओवन में प्लास्टिक फिल्म के शीर्ष पर ६० डिग्री सेल्सियस पर कम से ४८ एच के लिए ।

4. FIB-SEM के लिए तैयारी

  1. बाहर polymerized नमूने एक साथ प्लास्टिक की फिल्म के साथ एक आकार में एक रेवर ब्लेड का उपयोग कर sem डिटेल फिटिंग और उंहें sem एक प्रवाहकीय चांदी राल का उपयोग कर डिटेल संलग्न ( सामग्री की मेजदेखें) । ६० डिग्री सेल्सियस पर फिर से Polymerize कम से 4 एच या रात भर के लिए ।
  2. स्पुटर कोट ३५ पर 1 मिनट के लिए सोने के साथ SEM डिटेल पर नमूने एक धूम टारगे विलेपक का उपयोग कर (प्लैटिनम/पैलेडियम भी इस्तेमाल किया जा सकता है; एक 10 एनएम मोटी कोटिंग पर्याप्त है) और उंहें fib-SEM के अंदर जगह है ।

5. FIB-SEM के अंदर डेटा अधिग्रहण

  1. मूल माइक्रोस्कोप ड्राइविंग सॉफ्टवेयर का उपयोग द्वितीयक इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर के साथ नमूने छवि ( सामग्री की मेजदेखें). इसका नमूना उन्मुखी होना चाहिए ताकि रूचि का क्षेत्र (जैसे, नर्जस टिबियल्स का मध्य भाग अथवा सी. एलिगेंस) देखने के क्षेत्र में हो.
    नोट: डेटा प्राप्ति को निष्पादित करने के लिए, चरण को एक स्थिति में झुकाएं ताकि नमूना आयन बीम को ९० ° कोण पर एक उपयुक्त कार्यशील दूरी पर (5 मिमी) के रूप में आयनों और इलेक्ट्रॉन बीम के तथाकथित संयोग बिंदु में ले जाए । हमारे उपकरण का उपयोग करना, यह ५४ ° और 5 मिमी काम कर दूरी के एक चरण झुकाव पर हासिल की है ।
  2. नमूना की सही स्थिति को सेट करने के लिए, माध्यमिक इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर के साथ इमेजिंग, जबकि एक 0 ° झुकाव पर एक आम सुविधा केंद्र. धीरे से ५४ ° करने के लिए झुकाव (5 °, 20 °, ५४ °), मीटर अक्ष हिल द्वारा एक ही वस्तु recentering.
  3. ५४ ° पर द्वितीयक इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर के साथ इमेजिंग, जबकि fib मोड में केंद्रीय स्थिति के लिए सुविधा ले जाने के बाद एक सुविधा केंद्रित द्वारा संयोग बिंदु का पता लगाएं । केंद्र का एक संकेत है करने के लिए SEM सॉफ्टवेयर में क्रॉसहेयर प्रदर्शित करके इस प्रदर्शन । फिर पहले चयनित नमूना सुविधा SEM सॉफ़्टवेयर के केंद्र बिंदु फ़ंक्शन का उपयोग करके छवि क्षेत्र के केंद्र के लिए ले जाएँ । फिर z में मंच ले जाकर y-अक्ष के साथ सुविधा केंद्र । FIB और SEM के बीच किसी भी अंतिम ऑफसेट SEM बीम शिफ्ट के साथ सही है ।
  4. 3D डेटासेट रिकॉर्ड करने के लिए उंनत सॉफ़्टवेयर ( सामग्री तालिकादेखें) खोलें और सॉफ़्टवेयर विज़ार्ड चरण-दर-चरण का पालन करें ।
  5. ब्याज के क्षेत्र में, जमा कार्बन या प्लेटिनम (४०० एनएम) रॉय के शीर्ष पर एक 3 nA वर्तमान का उपयोग करने की अनुमति भी मिलिंग और कम चार्ज द्वारा प्रेरित कलाकृतियों ।
    नोट: ब्याज के क्षेत्र ड्राइंग द्वारा नमूना सतह FIB (चौड़ाई, ऊंचाई, गहराई) के साथ imaged पर milled किया जा करने के लिए, सॉफ्टवेयर की गणना करता है और विभिन्न नमूना तैयारी सुविधाओं के आकार superimposes है, ऐसे खाइयों के रूप में करने के लिए milled या क्षेत्र के लिए प्लैटिनम/कार्बन जमाव । इसके अलावा, इमेजिंग भी-उच्च FIB धाराओं के साथ नमूना सतह के सतर्क हो, के रूप में यह नमूना सतह को नुकसान पहुंचा सकता है । ५० pA के एक मौजूदा इमेजिंग के लिए पर्याप्त है ।
  6. एक 15/30 nA वर्तमान का उपयोग कर ब्याज के क्षेत्र (ROI) का पर्दाफाश करने के लिए एक खाई मिल करने के लिए ध्यान केंद्रित आयन बीम का प्रयोग करें ।
  7. एक 7 एनए वर्तमान के साथ पार अनुभाग पॉलिश करने के लिए ध्यान केंद्रित आयन बीम का प्रयोग करें ।
  8. नमूना तैयारी समाप्त करने के बाद, निम्न इमेजिंग पैरामीटर सेट करें: fib मिलिंग पैरामीटर मिथ्या सेटअप टैब में (FIB मिलिंग वर्तमान); SEM इमेजिंग पैरामीटर में सेटअप टैब और छवि ट्यूनिंग पैरामीटर SEM AutoTune टैब में (प्रदर्शन autotune और autostigmation हर ६० मिनट, ५० एनएम पिक्सेल आकार, समय 3, लाइन औसत 3) । हर नमूने के लिए यह ऑप्टिमाइज़ करें ।
  9. ब्लॉक-फेस चलाने के दौरान बहाव के कारण होने वाले किसी भी थर्मल बहाव को रोकने के लिए, अधिग्रहण शुरू करने से पहले कम से 2 h के लिए कमरे को छोड़ दें ।
  10. एक सतत मिल में डेटासेट प्राप्त करने और एक ७०० फिलीस्तीनी अथॉरिटी FIB वर्तमान के साथ मोड प्राप्त । का प्रयोग करें १.५ केवी (विश्लेषणात्मक मोड, ९०० V) ESB डिटेक्टर ४०० वी की एक ग्रिड वोल्टेज के साथ छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रत्येक 5 एनएम पिक्सेल आकार के साथ उंनत सॉफ्टवेयर का उपयोग ( सामग्री की मेजदेखें) और ५० एनएम स्लाइस मोटाई । एक छवि अधिग्रहण के बारे में १.५ मिनट लगते 6 μs के एक समय के साथ ।
  11. डेटा प्राप्ति प्रारंभ करें । यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना नहीं लिया गया और रुचि के सही क्षेत्र का चयन किया गया है, मिलिंग वर्तमान में एक मिथ्या छवि प्राप्त की जाती है । यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें ।

6. डेटा विज़ुअलाइज़ेशन

  1. फिजी में सभी छवियों वाले फ़ोल्डर को खींचकर फ़िजी में छवियाँ खोलें और वर्चुअल स्टैकका चयन करें.
  2. आयत उपकरण (छवि ≫ फसल) का उपयोग कर ब्याज के क्षेत्र फसल ।
  3. अंधेरे में दिखा झिल्ली के साथ पारंपरिक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विपरीत दिखाने के लिए डेटा उलटा (संपादित ≫ उलटा).
  4. संरेखण के लिए TrackEM214 (फिजी15) का उपयोग करें । TrackEM2 में डेटा लोड (फ़ाइल ≫ नई ≫ TrackEM2) परतपर क्लिक करके । सभी छवियों को लोड कर रहे हैं के बाद, उन्हें बहु परत मोज़ेक समारोह का उपयोग कर संरेखित करें (> छवि पर राइट-क्लिक ≫ संरेखित बहु परत मोज़ेक संरेखित). संरेखण के बाद, छवियाँ व्यक्तिगत tiff के रूप में निर्यात की जाती हैं-फ़ाइलें (छवि पर राइट-क्लिक करें ≫ निर्यात > सपाट छवि बनानेके लिए). निर्यात की जाने वाली सभी छवियों का चयन करें और फ़ाइल में सहेजेंचुनें.
  5. बाद प्रसंस्करण के लिए, एक गाऊसी धुंधला (प्रक्रिया ≫ फिल्टर ≫ गाऊसी धुंधला; सिग्मा 2) और स्थानीय विपरीत वृद्धि (प्रक्रिया > स्थानीय कंट्रास्ट बढ़ानेका उपयोग करें; क्लाउड: blocksize १२७, हिस्टोग्राम डिब्बे २५६, अधिकतम ढलान १.५), जो छवि को सुचारू करने और एक बेहतर सिग्नल-से-शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए फिजी में लागू किए जाते हैं.
  6. IMOD16 एक मैनुअल विभाजन प्रदर्शन और 3 डी में ब्याज की संरचना कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । IMOD में dataset खोलें और मैन्युअल विभाजन करने के लिए आरेखण उपकरण (विशेष > आरेखण उपकरण) का चयन करें । विभिन्न मैनुअल उपकरणों की मात्रा में ब्याज की संरचना का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए शामिल होने, नकाशी). अर्ध स्वचालित विभाजन के लिए माइक्रोस्कोपी छवि ब्राउज़र (MIB17) का प्रयोग करें ।

Representative Results

कार्यप्रवाह एक नमूने के साथ शुरू होता है (यहाँ, एक हौसले से विच्छेद माउस nervus टिबियल्स) उच्च दबाव ठंड के लिए धातु वाहक में रखा जा रहा है (चित्रा 1a). वाहक द्रव नाइट्रोजन (चित्र 1b) से प्राप्त किए जाते हैं और जमे हुए पहले रासायनिक कॉकटेल (चित्र 1c) के शीर्ष पर एक फ्रीज प्रतिस्थापन इकाई में रखा जाता है । 2% ओस्मियम टेट्रोक्साइड और ०.१% यूरेनल एसीटेट सहित एक लंबे फ्रीज प्रतिस्थापन प्रोटोकॉल के बाद, नमूनों को कमरे के तापमान पर वाहकों से हटा दिया जाता है (चित्रा 1 डी) । इसके विपरीत बढ़ाने के लिए, नमूनों प्लास्टिक ट्यूबों के लिए स्थानांतरित कर रहे है माइक्रोवेव में संसाधित किया जा (चित्रा 1e) । वैक्यूम चैंबर और तापमान नियंत्रण इकाई (चित्रा 1f) प्रक्रिया को अनुकूलित करने के लिए उपयोग किया जाता है ।

करने के लिए ंयूनतम राल embedding प्रदर्शन करने में सक्षम हो, टूथपिक और प्लास्टिक की फिल्म की चादरें (चित्रा 2a) की जरूरत है । माइक्रोवेव का उपयोग कर राल के साथ नमूनों घुसपैठ के बाद, वे प्लास्टिक की फिल्म के टुकड़े पर रखा जाता है और कोई राल नमूना सतह पर छोड़ दिया है जब तक चारों ओर ले जाया जाता है । एक हैलोजन लैंप में मदद करने के लिए शेष राल नाली और नमूना ंयूनतम एंबेडेड (चित्रा 2b) प्लास्टिक की फिल्म पर छोड़ किया जाता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अधिक राल नमूने के ऊपर से हटा दिया गया है अच्छा है । वहां अभी भी एक छोटी राशि के नमूने के नीचे छोड़ दिया यह सब्सट्रेट से जुड़ी रखने के लिए किया जाना चाहिए । नमूना प्लास्टिक की फिल्म पर polymerized जा रहा है कट और चांदी प्रवाहकीय राल के साथ SEM ठूंठ के शीर्ष पर घुड़सवार (चित्र 2c) । ठूंठ ६० डिग्री सेल्सियस (चित्र 2 डी) में कम 4 एच के लिए polymerized है । घटक अच्छी तरह से मिलाया जाना चाहिए या मिश्रण सही ढंग से polymerize नहीं हो सकता है. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के अंदर चार्ज करने से बचने के लिए, ठूंठ सोने या प्लैटिनम/पैलेडियम (चित्रा 2e) के साथ लेपित है ।

नमूने FIB-SEM में रखा जाता है और एक द्वितीयक इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर के साथ imaged ब्याज के क्षेत्र को लक्षित करने के लिए (चित्रा 3a, ई) । एक आयन बीम एक क्रॉस सेक्शन को बेनकाब करने के लिए ब्याज के क्षेत्र के सामने सीधे सामग्री को हटाने के लिए प्रयोग किया जाता है (चित्रा 3b-d, 3b-h). मानक प्रोटोकॉल अक्सर झिल्ली के विपरीत की कमी से पीड़ित (चित्रा 3 बी, एफ), जबकि बढ़ाया प्रोटोकॉल एक मजबूत झिल्ली के विपरीत प्रदान करता है (चित्रा 3 सी-डी, 3 जी एच) ।

EM डेटा (पोस्ट-प्रोसेसिंग के बाद) imod, एक छवि प्रसंस्करण और मॉडलिंग कार्यक्रम का उपयोग कर कल्पना हैं । 3 डी जानकारी की एक बेहतर समझ प्राप्त करने के लिए, डेटा के आभासी reslicing इस्तेमाल किया जाता है (चित्र 4a) । डेटासेट के विभिंन संरचनाओं मैंयुअल रूप से खंडित (चित्रा 4b-d) हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: उच्च दबाव ठंड, फ्रीज-प्रतिस्थापन, और माइक्रोवेव की मदद से प्रसंस्करण । (क) नमूना वाहक जिसमें माउस तंत्रिका टिबिएलिस, स्केल बार 3 मिमी होती है । (ख) उच्च दाब जमने के बाद माउस नर्जस टिबियल्स युक्त नमूना वाहक, स्केल बार 3 मिमी । (ग) नमूनों के साथ आटोमेटिक फ्रीज प्रतिस्थापन (एएफस) यूनिट । इनसेट: कस्टम निर्मित धातु कंटेनर के लिए अप करने के लिए 23 नमूना विल्स और दो बड़े विल्स रसायन युक्त एएफस में । (घ) एसीटोन, स्केल बार 3 मिमी में कांच के पकवान में वाहकों से नमूने निकाले जा रहे हैं । (ङ) अभिक्रिया में नमूनों को माइक्रोवेव में संसाधित करने के लिए रखा जाएगा । (च) माइक्रोवेव के निर्वात चैम्बर और तापमान नियंत्रण एकक कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ंयूनतम राल embedding और FIB-SEM के लिए तैयारी । (क) प्लास्टिक की फिल्म और टूथपिक है कि ंयूनतम राल embedding, स्केल बार 4 सेमी के लिए इस्तेमाल किया जाता है । (ख) प्लास्टिक फिल्म, स्केल बार २५० μm के शीर्ष पर राल का सूखा तंत्रिका तंत्रिका । (ग) प्लास्टिक की फिल्म पर नेवरी टिबियल्स पॉलीमराइज्ड हैं, फिर इसे काटकर और ऊपर की ओर चढ़कर SEM डिटेल के साथ चांदी प्रवाहकीय राल, स्केल बार २५० μm । (घ) नमूने SEM डिटेल, स्केल बार 3 मिमी के शीर्ष पर polymerized । (ङ) सोने के साथ लेपित नमूने SEM डिटेल, स्केल बार 3 मिमी पर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: FIB-SEM के अंदर नमूने की तैयारी । (ए और ई) नमूना सतह के fib-SEM के अंदर द्वितीयक इलेक्ट्रॉन छवि (क) तंत्रिका टिबियल्स, स्केल बार १०० μm. (ई) सी. एलिगेंस, स्केल बार 2 μm (बी-डी) और (एफ एच) नमूना के माध्यम से क्रॉस-सेक्शन इमेजिंग के लिए esb डिटेक्टर का उपयोग कर । (ख और ग) तंत्रिका टिबिआलिस, स्केल बार 2 μm (एफ और जी) सी. एलिगेंस, स्केल बार 1 μm और २०० एनएम । (ख और च) दिखाया उच्च दबाव ठंड और वृद्धि के बिना प्रतिस्थापन फ्रीज के परिणाम हैं, जबकि अंय सभी छवियों बढ़ाया फ्रीज प्रतिस्थापन के परिणाम दिखाते हैं । (डी एण्ड एच) ESB डिटेक्टर का उपयोग कर नमूना की विस्तृत छवि । (घ) तंत्रिका टिबिअल्स, स्केल बार २०० एनएम । (ज) सी. एलिगेंस, स्केल बार २०० एनएम । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: छवि अधिग्रहण और विज़ुअलाइज़ेशन । (क) आईएमओडी में दर्शाए गए आंकड़ों के अनुसार लगभग रेलीकेटेड एक्स/जेड और वाई/जेड-विमानों के साथ स्केल बार 2 μm । (ख) एम डाटा (नीला), रिबेक बंडलों (लाल), माइलिन शीथ (पीला और नारंगी), और माइटोकॉन्ड्रिया (फ़िरोज़ा), स्केल बार 2 μm पर विभाजित axons (ग और घ) 3 डी मॉडल, स्केल बार 2 μm और ५०० एनएम . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

प्रोटोकॉल एक FIB-SEM के साथ धारावाहिक ब्लॉक चेहरा इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए इष्टतम संरक्षण और इसके विपरीत वर्णन करने के लिए विकसित किया गया था । इसलिए, हम cryo-immobilization लागू करने के बाद के बाद धुंधला स्थिर प्रतिस्थापन और माइक्रोवेव की मदद से प्रसंस्करण का उपयोग करने का फैसला किया । इसलिए, इस प्रोटोकॉल है कि उच्च दबाव ठंड के लिए काफी छोटे है नमूनों तक ही सीमित है । चौड़ाई और ~ २०० μm की मोटाई में 3 से 6 मिमी के आकार सीमाओं नमूना वाहक है, जो ठीक से इस तकनीक के साथ जमे हुए किया जा सकता है कि नमूना आकार से मेल खाता है के आकार से स्थापित कर रहे हैं । यह माउस तंत्रिका नमूने के लिए प्रासंगिक है, के बाद से sciatic तंत्रिका व्यास में भी बड़ा है ०.२ mm वाहक है कि उचित ठंड सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है में फिट । इसलिए, इस तरह के टिबियल तंत्रिका या अन्य पतली तंत्रिका जैसे कि ऊरु तंत्रिका के रूप में एक छोटी तंत्रिका के सावधान विच्छेदन की सिफारिश की है । के बाद से myelin म्यान खींच करने के लिए संवेदनशील है, महान देखभाल ताजा और व्यवहार्य तंत्रिका के विच्छेदन के दौरान लिया जाना चाहिए कलाकृतियों से निपटने से बचें । सामान्यत इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी अध्ययनों के लिए केवल व्यवहार्य नमूनों का प्रयोग किया जाना चाहिए ।

माइक्रोवेव-असिस्टेड प्रोसेसिंग और मिनिमल रेज़िन एम्बेड तैयार करने और टार्गेटिंग प्रोसेस को तेज करने के लिए डिजाइन किए गए हैं । माइक्रोवेव सहायता प्रसंस्करण एक संशोधित OTO प्रोटोकॉल4 आवेदन कमरे के तापमान रासायनिक निर्धारण के लिए प्रयोग किया जाता है । एक घर माइक्रोवेव एक ही परिणाम नहीं निकलेगा, क्योंकि वहां माइक्रोवेव के कोई समरूप वितरण नहीं है, इसके तापमान नियंत्रित नहीं है, और कोई शूंय है कि लागू किया जा सकता है । छोटे नमूने, रसायनों की बेहतर पैठ; इसलिए, सबसे अच्छा परिणाम छोटे नमूनों द्वारा प्राप्त कर रहे हैं । overheating द्वारा नमूना को नुकसान से बचने के लिए, तापमान नियंत्रण और ंयूनतम आवश्यक माइक्रोवेव शक्ति के आवेदन महत्वपूर्ण हैं । माइक्रोवेव-सहायता प्रसंस्करण कदम बेंच पर प्रदर्शन किया जा सकता है अगर कोई माइक्रोवेव उपलब्ध है, जो अब प्रसंस्करण समय के लिए नेतृत्व करेंगे । SEM में सीधे लक्ष्य संरचनाओं के लिए, यह नमूना के शीर्ष से संभव के रूप में ज्यादा राल को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है । एक डेटासेट रिकॉर्डिंग के बाद, रॉ डेटा के बाद प्रसंस्करण फ़ाइल आकार को कम करने और सिग्नल से शोर अनुपात में सुधार करने के लिए आवश्यक है । आधुनिक मात्रा इमेजिंग तकनीकों डेटा की बड़ी मात्रा में उत्पादन । इसलिए, एक तेज़ और पर्याप्त तरीके से डेटा संसाधन निष्पादित करने के लिए, कार्यस्थान पर पर्याप्त RAM की आवश्यकता है । संरेखण कार्रवाई के लिए कम से दो बार अधिक RAM के रूप में डेटासेट आकार के रूप में आवश्यक है ।

इस प्रोटोकॉल का परीक्षण चूहे के साथ-साथ सी. एलिगेंसमें भी किया गया है । हॉल एट अल. 12 C. elegans की तैयारी के लिए बेंच पर उनके स्थिर प्रतिस्थापन के बाद एक समान वृद्धि कदम इस्तेमाल किया । ऐसे zebrafish के रूप में किसी भी अंय मॉडल जीव के लिए, प्रोटोकॉल के समायोजन की संभावना आवश्यक हैं । एक संभव संशोधन के लिए पानी के अलावा है कि इसके विपरीत वृद्धि18के लिए प्रयोग किया जाता है के रूप में फ्रीज प्रतिस्थापन कॉकटेल, की संरचना बदलने के लिए है । इसके अलावा, फ्रीज प्रतिस्थापन की अवधि के नमूने के लिए अनुकूलित किया है और काफी जल्दी फ्रीज प्रतिस्थापन प्रोटोकॉल19के अनुसार छोटा किया जा सकता है । एक संभावना है कि फ्रीज प्रतिस्थापन प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए आंदोलन का अनुप्रयोग है20. स्थिर प्रतिस्थापन के बाद, आगे संशोधन संभव है, जैसे रसायनों और आज़मियम टेट्रोक्साइड21बढ़ाने के दोहराया आवेदन के रूप में । माइक्रोवेव प्रसंस्करण के दौरान, तापमान, ऊष्मायन बार, और बिजली सेटिंग्स संबंधित नमूना के लिए परिणाम का अनुकूलन करने के लिए अलग किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि ऐसी वृद्धि अन्य फ्रीज प्रतिस्थापन प्रोटोकॉल और नमूने के विभिन्न प्रकार के साथ संयुक्त किया जा सकता है के रूप में हॉल12 कि एक FIB-SEM में imaged हैं या सीरियल ब्लॉक-चेहरा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा वर्णित. इन इमेजिंग तकनीकों में एंहांस्ड कंट्रास्ट की आवश्यकता होती है, जो संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए कम महत्वपूर्ण है ।

Disclosures

हितों का टकराव नहीं घोषित ।

Acknowledgments

FIB-SEM और एएस (FIB-SEM ऑपरेटर की स्थिति) उत्कृष्टता और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) अनुसंधान केंद्र नैनो माइक्रोस्कोपी और मस्तिष्क (CNMPB) के आणविक फिजियोलॉजी के क्लस्टर द्वारा वित्त पोषित कर रहे हैं । हम C. एलिगेंस नमूने प्रदान करने के लिए थॉमस müller-reichert की प्रयोगशाला धंयवाद। हम फिल्म में भाग लेने के लिए Ulrich Weikert धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instrumentation
Leica HPM100 Leica
Automatic Freeze Substitution Leica
Laboratory microwave with temperature control unit Ted Pella
EM ACE600 with gold target Leica
Crossbeam 540 Zeiss
Halogen lamp 12 V/ 20 W Osram
Oven VWR
Freezing
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2153
M9 Homemade According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope
Hexadecene Sigma-Aldrich 52276
Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich P2307
A type carrier Wohlwend GmbH #241
B type carrier Wohlwend GmbH #242
Slit carrier Wohlwend GmbH #446
Plastic Pasteur pipettes VWR 612-1684
Forceps FST 11200-10
Freeze substitution
Acetone science services 10015
Tannic acid Sigma-Aldrich 403040
Osmium tetroxide EMS 19100
Uranyl acetate SPI-Chem 02624-AB
Acetone EMS 10015
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich 223220
Nunc CryoTubes Sigma-Aldrich V7884-450EA
Watch glass dishes, 150 mm VWR 216-2189H
Eppendorf tubes Eppendorf 0030 120.094
Durcupan resin Sigma-Aldrich 44610
Mounting
SEM stubs Science Services E75200
Aclar Science Services 50425-10
Toothpicks
filter paper VWR 512-3618
conductive silver resin EMS 12670-EE EPO-TEK EE 129-4
Software
Image acquisition Zeiss SmartSEM
Image acquisition Zeiss Atlas5 A3D
Image processing Open source Fiji http://fiji.sc/#download
Image visualization Open source IMOD http://bio3d.colorado.edu/imod/

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References

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जीव विज्ञान अंक १४५ तंत्रिका विज्ञान ध्यान केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी FIB-SEM ंयूनतम राल embedding उच्च दबाव ठंड माइक्रोवेव सहायता प्रसंस्करण नमूना प्रसंस्करण 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 3 डी पुनर्निर्माण
उच्च दबाव ठंड, माइक्रोवेव की सहायता के विपरीत वृद्धि, और मात्रा इमेजिंग के लिए ंयूनतम राल Embedding द्वारा जैविक नमूना तैयारी
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Steyer, A. M., Ruhwedel, T.,… More

Steyer, A. M., Ruhwedel, T., Möbius, W. Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging. J. Vis. Exp. (145), e59156, doi:10.3791/59156 (2019).

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