Summary
نقدم هنا بروتوكولا للجمع بين اثنين تقنيات تجهيز العينة، الضغط العالي تجميد وتجهيز عينة ساعدت الموجات الدقيقة، تليها الراتنج الدنيا التضمين للحصول على بيانات مع تركيز أيون شعاع مسح إلكتروني المجهري (التعزيز-وزارة شؤون المرأة). ويتجلى هذا باستخدام الماوس عصب ظنبوبي عينة و ايليجانس كاينورهابديتيس.
Abstract
تم تصميم تقنية إعداد وصف العينة الجمع بين أفضل نوعية للحفاظ على ultrastructural مع التباين الأكثر ملاءمة لأسلوب التصوير في أيون تركيز شعاع مسح إلكتروني المجهري (التعزيز-وزارة شؤون المرأة)، الذي يستخدم للحصول على رزمة من صور متسلسلة للإنشاء والتعمير 3D النمذجة. الضغط العالي تجميد (HPF) يسمح قريبة من المحافظة على هيكلية أصلي، ولكن وقت لاحق تجميد استبدال غالباً ما لا ينص على تباين كافي، لا سيما عينة أكبر، الذي يعتبر ضروريا لتصوير عالي الجودة في SEM المطلوبة ل 3D إعادة البناء. ولذلك، في هذا البروتوكول، بعد استبدال التجميد، الخطوات المتناقضة إضافية تجري في درجة حرارة الغرفة. على الرغم من أن يتم تنفيذ هذه الخطوات في فرن ميكروويف، من الممكن أيضا لمتابعة تجهيز البدلاء التقليدية، التي تتطلب أوقات أطول في الحضانة. تضمين اللاحقة في كميات ضئيلة من الراتنج يسمح لأسرع وأكثر دقة من استهداف وإعداد داخل التعزيز-sem. هذا البروتوكول مفيدة بشكل خاص للعينات التي تتطلب إعداد بتجميد الضغط العالي لحفظ ultrastructural موثوق بها ولكن لا كسب ما يكفي التباين خلال استبدال تجميد لتصوير حجم استخدام التعزيز-sem. في تركيبة مع تضمين الراتنج الدنيا، يوفر هذا البروتوكول سير عمل بكفاءة للحصول على بيانات وحدة تخزين عالية الجودة.
Introduction
تجميد الضغط العالي هو طريقة إعداد العينة الاختيار للحصول على الحفاظ على ultrastructural عالية الجودة، التي تمثل الدولة الأصلية أفضل بكثير من أساليب إعداد التقليدية باستخدام التثبيت الكيميائي1عينة. هذا الأسلوب cryo-إعداد مفيد لعينات مثل الماوس myelinated الأنسجة2 وشرط صارم لاستخدام نموذج الكائن الحي ايليجانس كاينورهابديتيس3. بعد استبدال التجميد وتضمينها الراتنج، عادة ما يتم تحليل هذه العينات مجهر إلكتروني (TEM) أو التصوير المقطعي الإلكترون (ET). إذا كان يجب تصويرها أحجام أكبر استخدام التعزيز-وزارة شؤون المرأة أو تصوير المسلسل من وجه كتلة لإعادة البناء 3D واسعة النطاق ذات الدقة العالية، في تجربتنا التصوير السليم بواسطة وزارة شؤون المرأة هو غالباً ما يعوق الافتقار إلى النقيض. في التعزيز-وزارة شؤون المرأة، عادة يتم تسجيل الصورة بالكشف عن الإلكترونات المستطار من شعاع الإلكترون الأولية. عائد الإلكترونات المستطار يتناسب مع محتوى المعادن الثقيلة في العينة. ولذلك، كانت بروتوكولات مصممة خصيصا لحجم التصوير لتعزيز التباين حسب التشريب إضافية من المعادن الثقيلة. هذه الأساليب تعتمد على عينات ثابتة كيميائيا وتطبيق مزيج من أكسيد أكسيد الازميوم-ثيوكاربوهيدرازيدي-أوزميوم4، كما وصفها نوت et al.5، لمواجهة كتلة المسلسل وتركز أيون شعاع المسح الضوئي المجهر الإلكتروني. التعديلات بما في ذلك استخدام ميثلامين وبيروجالول6 أو الرصاص اسبارتاتي7 قد طبقت بنجاح لتقنيات التصوير المختلفة.
يجمع بين البرد-إعداد العينات التي هبف البروتوكول المقدمة هنا وتجميد استبدال مع اللاحقة الموجات الدقيقة التي ساعدت على تجهيز لزيادة التباين باستخدام أكسيد ثيوكاربوهيدرازيدي/أوزميوم في الأسيتون في درجة حرارة الغرفة. علينا أن نظهر هذا في الظنبوبي myelinated عصب من الفئران وفي كاينورهابديتيس ايليجانس، التي تمثل العينات التي تتطلب الضغط العالي تجميد للحفاظ على ultrastructural عالية الجودة. وبالإضافة إلى ذلك، يتضح كيف، بعد الجفاف وعمليات التسلل، العينات المضمنة مع راتنج قليلة قدر الإمكان. هذا الراتنج الدنيا التضمين8 يسمح لاستهداف أسرع لهيكل للفائدة ويقلل من الوقت المستغرق في معالجة عينة، بما في ذلك أقل من الوقت المطلوب لتعريض المنطقة للاهتمام بالشعاع أيون. بعد أداء كذلك خطوات إعداد عينة داخل المجهر، التصوير وطحن العينة تتم بشكل مستمر للحصول على كومة من الصور. لرؤية 3D، يتم استخدام صورة تجهيز البرمجيات (إيمود) لإعادة بناء أجزاء من dataset.
ويصف سير العمل لدينا كيف المتناقضة أنسب من عينات لتصوير حجم يمكن دمجها مع الحفاظ على أفضل ultrastructural باستبدال هبف وتجميد. وهذا مفيد للعينات التي تتطلب دقة إعداد cryo. تطبيقات محدودة للعينات الصغيرة التي يمكن أن يعدها هبف. في عينات طبيعة مختلفة، مثل المواد النباتية أو الكائنات الدقيقة، يتطلب هذا البروتوكول التكيف.
Protocol
جميع التجارب بما في ذلك عينات من الحيوانات الموصوفة هنا موافقة رعاية الحيوان المؤسسية ومكتب الدولة لساكسونيا السفلي "حماية المستهلك" وسلامة الأغذية (لافيس).
1-الضغط العالي لتجميد وتجميد استبدال
- تشريح الظنبوبي عصب من ماوس (مثلاً، C57Bl6N، 12 أسبوعا، أنثى)9.
- تزج الظنبوبي عصب في معالجة تجميعية من 20% بوفيدون (ز 1 لحماية الأصناف النباتية في 5 مل) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وقطع قطعة طولها 2 مم. ثم ضعه في ناقل عينة معدنية (نوع A، 0.2 مم) باستخدام الملقط غرامة. إضافة الناقل شقة أخرى (نوع B) مغطاة بطبقة رقيقة من هيكساديكان كغطاء وإدراج هذه الجمعية في خرطوشة العينة.
- نقل عدة C. ايليجانس علقت في معالجة تجميعية من 20% البقري ألبومين المصل (BSA) في M9 (انظر الجدول للمواد) مع ماصة بلاستيك القابل للتصرف في الناقل المعدني (النوع A). ثم أضف حاملة ثانية كغطاء على رأس (نوع B) وتجميع الخرطوشة.
- لكل من هذه العينات، المضي قدما بما يلي: الضغط العالي تجميد الجمعيات الناقل عينة واحداً تلو الآخر بتحميلها إلى خرطوشة ثلاث قطع في محطة التحميل من الثلاجة ذات الضغط العالي. اضغط على زر العملية وفقا لتعليمات التشغيل الخاص بالشركة المصنعة.
ملاحظة: كلا النوعين من عينات يمكن معالجتها معا في الاستعاضة عن تجميد اللاحقة. - وضع العينات في كريوفيالس الذي يحتوي على 2 مل حمض التانيك 0.1% مجمدة في الأسيتون. إجراء النقل في حمام النتروجين السائل دون إراقة النتروجين السائل في القنينات. نقل كريوفيالس إلى تجميد تلقائي استبدال وحدة10 مجموعة في-90 درجة مئوية، وبدء تشغيل البرنامج.
ملاحظة: تحفظ العينات قبل استخدام أوسميفيكيشن الحرجة لزيادة امتصاص أكسيد الاوزميوم11في-90 درجة مئوية ل h. 100 حمض التانيك. - تغسل يدوياً العينات 3 x ل 30 دقيقة مع 2 مل من الأسيتون في-90 درجة مئوية في وحدة إبدال التجميد.
- ترك العينات في 2 مل أكسيد الاوزميوم 2%، تجميد خلات اليورانيل 0.1% في الأسيتون لتلطيخ المستمر في التلقائي استبدال وحدة ح 7 في-90 درجة مئوية.
تنبيه: أكسيد الاوزميوم سامة وينبغي التعامل معها تحت غطاء دخان، وينبغي ارتداء المعدات الواقية.
ملاحظة: وحدة إبدال التجميد تلقائياً يرفع درجة الحرارة إلى-20 درجة مئوية في 5 درجة مئوية/ح. وتحفظ العينات في-20 درجة مئوية ح 16 في وحدة إبدال التجميد. سيتم رفع درجة الحرارة تلقائياً إلى 4 درجات مئوية في 10 ° C/h. - تبادل الحل أكسيد الاوزميوم مع الأسيتون النقي عندما وصلت درجة الحرارة إلى 4 درجات مئوية. إزالة كريوفيالس من وحدة إبدال التجميد.
2-مساعدة الميكروويف التجهيز
ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات التالية في درجة حرارة الغرفة12 باستخدام وحدة تحكم في درجة حرارة للحفاظ على درجة حرارة مستقرة (انظر الجدول للمواد).
- ترك أغطية الأنابيب رد فعل مفتوحة أثناء المعالجة بالميكروويف.
- تأخذ الناقلين عينة معدنية من أصل كريوفيالس وإزالة العينات من الناقل المعدني باستخدام الملقط غرامة أو إبرة، مع الحفاظ على العينات التي سوبميرسيد في الأسيتون في صحن زجاج يشاهد (150 ملم).
- نقل العينات إلى 2 مل رد فعل أنابيب استخدام الملقط غرامة أو ماصة، وتغسل مع 1 مل الأسيتون أربع مرات عن 40 ثانية في 250 جورج
تنبيه: ثيوكاربوهيدرازيدي سامة وينبغي التعامل معها تحت غطاء دخان، وينبغي ارتداء المعدات الواقية. - وصمة عار عينات مع 1 مل ثيوكاربوهيدرازيدي 1% في الأسيتون لمدة 14 دقيقة في 150 W لزيادة التباين. أداء تلطيخ، "الماصة؛" الحل ثيوكاربوهيدرازيدي في أنبوب رد فعل ووضع الأنبوب في الميكروويف، وتعيين البرنامج إلى مستوى طاقة من 150 W (مع وظيفة الفراغ قيد التشغيل) لدقيقة 2/2 دقيقة قبالة، التكرار لإجمالي 14 دقيقة. بدء تشغيل الميكروويف.
ملاحظة: ثيوكاربوهيدرازيدي يتفاعل مع أكسيد الاوزميوم التي تم تطبيقها من خلال الاستعاضة عنها بالتجميد. وهي تشكل جسراً، مما يتيح المزيد من أكسيد أوزميوم تودع على مواقع أكسيد الاوزميوم الأصلي13. - تغسل العينات 4 x مع 1 مل الأسيتون ل 40 s في 250 دبليو ماصة الأسيتون في أنبوب رد فعل، وضع الأنبوب في الميكروويف، وحدد 250 ث للموجات الدقيقة 40 س. ابدأ.
- وصمة عار في 1 مل أكسيد الازميوم 2% في الأسيتون لمدة 14 دقيقة في 150 جورج ماصة حل أكسيد الاوزميوم في أنبوب رد فعل، ووضع الأنبوب في الميكروويف، وتعيين البرنامج إلى مستوى طاقة من 150 واط (مع وظيفة الفراغ قيد التشغيل) لمدة 2 دقيقة في/2 دقيقة قبالة ، التكرار لإجمالي 14 دقيقة. بدء تشغيل الميكروويف.
- تغسل العينات 4 x مع 1 مل الأسيتون عن 40 ثانية في 250 ث (كما فعلت في الخطوة 2، 5).
- التسلل مع 1 مل زيادة تركيزات راتنج في الأسيتون (انظر الجدول للمواد) 25%، 50%، 75%، 90%، 100%، و 100% 3 دقيقة على 250 دبليو ماصة الراتنج في أنبوب رد فعل، وضع الأنبوب في الميكروويف، وتعيين البرنامج إلى مستوى سلطة l 250 واط (مع وظيفة الفراغ قيد التشغيل) للحد الأدنى 3 بدء تشغيل الميكروويف.
3-الحد الأدنى من الراتنج التضمين8
- أخذ الظنبوبي عصب و C. ايليجانس خارج الأنبوب رد فعل مع مسواك ومكان لهم على قطعة من البلاستيك فيلم (انظر الجدول للمواد).
- استخدام مسواك دفع العينة بلطف على الفيلم البلاستيك حتى يتم الكشف عن لا راتنج المتبقية. استخدام مصباح هالوجين للتدفئة (انظر الجدول للمواد) حيث الراتنج يصبح أقل لزوجة، وهو قادر على إزالتها بسهولة أكبر. بإغلاق مكان مصباح هالوجين ما يكفي لتسخين الراتنج (مع الحرص على عدم حرق أيدي).
- بلمرة العينات لمالا يقل عن 48 ساعة في 60 درجة مئوية فوق الفيلم البلاستيك في الفرن.
4-التحضير للتعزيز-وزارة شؤون المرأة
- قطع عينات مبلمرة جنبا إلى جنب مع الفيلم البلاستيك باستخدام شفرة حلاقة في حجم المناسب كعب الروتين ووزارة شؤون المرأة وإرفاقها ببذرة وزارة شؤون المرأة راتنج فضة موصلة باستخدام (انظر الجدول للمواد). بلمرة مرة أخرى عند 60 درجة مئوية على الأقل 4 ح أو بين عشية وضحاها.
- معطف الرش كعب الروتين العينات في وزارة شؤون المرأة مع الذهب لمدة 1 دقيقة على 35 ماجستير استخدام المغطى الرش (يمكن أيضا استخدام البلاتين/البلاديوم؛ ويكفي بطلاء سميكة 10 نانومتر) ووضعها بداخل التعزيز-sem.
5-البيانات اقتناء داخل التعزيز-وزارة شؤون المرأة
- صورة العينات مع كاشف الإلكترونات الثانوية باستخدام البرمجيات الأساسية الدافعة المجهر (انظر الجدول للمواد). ينبغي توجيه العينة حيث تكون منطقة الفائدة (مثلاً، الجزء الأوسط من الظنبوبي عصب أو C. ايليجانس) في مجال الرؤية.
ملاحظة: لإجراء الحصول على البيانات، إمالة المرحلة إلى موضع حيث أن العينة يواجه الشعاع أيون بزاوية 90 درجة على مسافة عمل مناسبة (5 مم) في نقطة ما يسمى صدفة شعاع الأيونات والإلكترونات. استخدام اداتنا، ويتحقق ذلك في ميل مرحلة 54° والمسافة العمل 5 ملم. - لتعيين الموضع الصحيح للعينة، مركز سمة مشتركة في إمالة 0° أثناء التصوير مع كاشف الإلكترونات الثانوية. بطء ريسينتيرينج الميل إلى 54 درجة (درجة 5، 20°، 54°)، نفس الكائن عن طريق تحريك م-المحور.
- العثور على نقطة صدفة خلال توسيط ميزة أثناء التصوير مع كاشف الإلكترونات الثانوية في 54°، تليها الانتقال الميزة إلى الموقع المركزي في وضع التعزيز. تنفيذ ذلك عن طريق عرض مرمى في برنامج وزارة شؤون المرأة أن يكون مؤشرا للمركز. ثم حرك أولاً الميزة العينة المختارة إلى وسط منطقة الصورة باستخدام الدالة نقطة مركز البرمجيات ووزارة شؤون المرأة. ثم مركز الميزة على طول المحور ص بالانتقال المرحلة في زي. يتم تصحيح أي إزاحة النهائي بين التعزيز ووزارة شؤون المرأة مع تحول شعاع SEM.
- فتح البرامج المتقدمة (انظر الجدول للمواد) لتسجيل مجموعات البيانات 3D واتبع معالج البرنامج خطوة بخطوة.
- في المنطقة من الفائدة، والكربون الإيداع أو البلاتين (400 نانومتر) أعلى عائد الاستثمار باستخدام غ 3 الحالي للسماح حتى الطحن والحد من النتائج الملموسة الناجمة عن الشحن.
ملاحظة: برسم منطقة اهتمام يكون ناعم على سطح العينة المصورة مع التعزيز (العرض، الارتفاع، والعمق)، البرنامج يحسب وتطغى أحجام ميزات إعداد نماذج مختلفة، مثل الخنادق يكون ناعم أو مجال ترسيب البلاتين/الكربون. أيضا، أن تكون حذرة من التصوير على سطح العينة مع التيارات التعزيز عالية جداً، كهذا يمكن أن تلحق الضرر سطح العينة. حالية للسلطة الفلسطينية 50 كافية للتصوير. - استخدام شعاع أيون مركزة لمطحنة خندق تعريض المنطقة للفائدة (ROI) استخدام غ 15/30 الحالي.
- استخدام شعاع أيون مركزة لتلميع المقطع العرضي مع غ 7 الحالي.
- بعد الانتهاء من إعداد نموذج، قم بإعداد المعلمات التصوير التالي: أكذوبة طحن معلمات في علامة التبويب إعداد التعزيز (التعزيز الطحن الحالي)؛ التصوير معلمات في علامة التبويب إعداد، والصورة توليف معلمات في علامة التبويب AutoTune وزارة شؤون المرأة ووزارة شؤون المرأة (أداء وقت يسكن اوتوفوكس وأوتوستيجماتيون كل 60 دقيقة، 50 نانومتر حجم بكسل، 3، السطر 3 متوسط). تحسين هذا الأداء لكل عينة.
- لمنع أي العائمة الحرارية تسبب الكتلة-الوجه الانجراف أثناء التشغيل، مغادرة الغرفة ح 2 على الأقل قبل البدء في شراء.
- الحصول على مجموعة البيانات في مطحنة مستمر واكتساب وضع مع السلطة الفلسطينية 700 التعزيز الحالية. استخدام 1.5 كيلو فولت (وضع تحليلية، 900 الخامس) كشف حساب الضمان باء مع جهد شبكة 400 الخامس للحصول على صور كل منهما 5 نانومتر حجم بكسل باستخدام البرمجيات المتقدمة (انظر الجدول للمواد)، وشمال البحر الأبيض المتوسط 50 شريحة سمك. الحصول على صورة واحدة يأخذ حوالي 1.5 دقيقة مع وقت يسكن المايكروثانيه 6.
- البدء في الحصول على البيانات. يكتسب صورة التعزيز في طحن الحالية لضمان أن العينة لم يتحرك ويتم تحديد المنطقة اليمنى من الفائدة. تعديل إذا لزم الأمر.
6-البيانات التصور
- فتح الصور في فيجي بسحب مجلد يحتوي على جميع الصور في فيجي وحدد المكدس الظاهري.
- المحاصيل في منطقة اهتمام باستخدام أداة المستطيل (الصورة > المحاصيل).
- عكس البيانات لإظهار التباين الميكروسكوب الإلكتروني انتقال التقليدية مع الأغشية التي تظهر في الظلام (تحرير > عكس).
- استخدام TrackEM214 (فيجي15) للمحاذاة. تحميل البيانات إلى TrackEM2 (ملف > جديد > TrackEM2) بالنقر فوق طبقة. بعد أن يتم تحميل كافة الصور ومحاذاتها باستخدام الدالة فسيفساء متعددة الطبقات (انقر بالزر الأيمن على الصورة > محاذاة > محاذاة فسيفساء متعددة الطبقات). بعد المحاذاة، يتم تصدير الصور كملفات tiff الفردية (انقر بالزر الأيمن على الصورة > تصدير > جعل صورة مسطحة). حدد كافة الصور التي يجب تصديرها واختر حفظ إلى ملف.
- لمرحلة ما بعد المعالجة، تستخدم تمويه ضبابي (عملية > مرشحات > التمويه الضبابي؛ 2 سيغما) وتعزيز النقيض المحلية (عملية > "زيادة التباين المحلي"؛ كل: 127 حجم الكتلة، والرسم البياني سلال 256، المنحدر الأقصى 1.5)، التي يتم تطبيقها في فيجي الصورة على نحو سلس والحصول على أفضل نسبة الإشارة إلى الضجيج.
- يتم استخدام إيمود16 للقيام بتجزئة يدوي ووضع تصور لهيكل مصلحة في 3D. افتح ورقة العمل في إيمود وحدد أدوات الرسم (الخاصة > "أدوات الرسم") القيام بتجزئة اليدوي. يمكن استخدام أدوات يدوية مختلفة لتتبع الهيكل للاهتمام في جميع أنحاء الحجم (على سبيل المثال الانضمام، نحت). استخدام "مستعرض صور مجهرية" (MIB17) لتجزئة شبه الآلية.
Representative Results
يبدأ سير العمل بعينه (هنا، ماوس طازجة تشريح عصب الظنبوبي) يتم وضعها في حاملات معدنية لتجميد الضغط العالي (الشكل 1a). يتم استردادها من النتروجين السائل (الشكل 1b) الناقلين ووضعها في وحدة إبدال تجميد على رأس الكيميائية أول كوكتيل المجمدة (الشكل 1 ج). بعد فترة طويلة تجميد استبدال البروتوكول بما في ذلك 2% 0.1% وأكسيد الاوزميوم خلات اليورانيل، تتم إزالة العينات من الناقلين في درجة حرارة الغرفة (د الشكل 1). لزيادة تعزيز التباين، يتم نقل العينات إلى أنابيب بلاستيكية بحيث تتم معالجتها في الميكروويف (الشكل 1e). وحدة مراقبة درجة الحرارة وفراغ الغرفة تستخدم لتحسين العملية (الشكل 1f).
هناك حاجة لتكون قادرة على القيام بتضمين الراتنج الدنيا، المسواك وصفائح البلاستيك فيلم (الشكل 2a). بعد تسلل العينات مع الراتنج استخدام الموجات الدقيقة، وهي توضع على قطع من البلاستيك فيلم ويتنقلون حتى يتم ترك لا راتنج على سطح العينة. يتم استخدام مصباح هالوجين للمساعدة على استنزاف الراتنج المتبقية وتترك العينة الحد الأدنى مضمن (الشكل 2b) على الفيلم البلاستيك. تجدر الإشارة إلى أن أكثر راتنج إزالتها من الجزء العلوي من النموذج جيد. يجب أن تكون هناك كمية صغيرة تركت تحت عينة للحفاظ على أنها تعلق على الركازة. قص العينة يتم بلمرة على الفيلم البلاستيك والتي شنت على رأس كعب روتين وزارة شؤون المرأة مع الراتنج موصلة الفضة (الشكل 2 (ج)). كعب الروتين هو بلمرة لمالا يقل عن 4 ح عند 60 درجة مئوية (الشكل 2d). ينبغي أن تكون مختلطة المكونات تماما أو قد لا بلمرة الخليط بشكل صحيح. لتجنب فرض رسوم داخل المسح الإلكتروني المجهري، كعب الروتين الرش مطلية بالذهب أو البلاتين/البلاديوم (الشكل 2e).
العينات التي يتم وضعها في التعزيز-وزارة شؤون المرأة وتصويرها بجهاز كشف إلكترون الثانوية لاستهداف منطقة الفائدة (الشكل 3 ألف، هاء). شعاع أيون يستخدم لإزالة المواد مباشرة أمام منطقة اهتمام لفضح مقطع عرضي (الشكل 3b-د، 3f-h). البروتوكولات القياسية غالباً ما يعانون من عدم وجود تباين غشاء (الشكل 3، و)، بينما ينص البروتوكول على تعزيز النقيض غشاء قوي (الشكل 3 جيم-د، خ 3-ح).
هي تصور البيانات م (بعد مرحلة ما بعد المعالجة) باستخدام إيمود، صورة تجهيز ووضع نماذج للبرنامج. Reslicing الظاهري للبيانات يستخدم لتحقيق فهم أفضل للمعلومات 3D، (الشكل 4 أ). يتم تقسيم هياكل مختلفة لمجموعة البيانات يدوياً (الشكل 4 باء-د).
رقم 1: الضغط العالي لتجميد واستبدال تجميد وتجهيز مساعدة الميكروويف. (أ) عينة الناقل الذي يحتوي على الظنبوبي عصب الماوس، تغيير حجم شريط 3 مم. الناقل (ب) عينة تحتوي الظنبوبي عصب الماوس بعد الضغط العالي التجميد، شريط 3 مم. (ج (تلقائي تجميد استبدال (AFS) وحدة المقياس مع عينات. داخلي: حاوية معدنية مصنوعة خصيصا لتصل إلى 23 عينة القنينات وهما القوارير الكبيرة المحتوية على المواد الكيميائية في المؤسسة. (د) العينات التي يتم إزالتها من الناقلين في صحن زجاج في الأسيتون، مقياس بار 3 مم. (ﻫ) العينات في أنابيب رد فعل توضع في الميكروويف للمعالجة. (و) مراقبة الدائرة ودرجة حرارة الفراغ وحدة الموجات الدقيقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تضمين الراتنج الدنيا والتحضير للتعزيز-sem. (أ) البلاستيكية والمسواك التي يتم استخدامها لتضمين الراتنج الدنيا، مقياس بار-4 سم (ب) عصب الظنبوبي ينضب من الراتنج على رأس الفيلم البلاستيك، ومقياس بار 250 ميكرومتر. (ج) عصب الظنبوبي بلمرة في غشاء بلاستيكي، ثم قطع والتي شنت على رأس كعب الروتين ووزارة شؤون المرأة مع فضة راتنج موصلة، مقياس بار 250 ميكرومتر. (د) عينات بلمرة على رأس كعب الروتين ووزارة شؤون المرأة، مقياس بار 3 مم. (ﻫ) عينات مطلية بالذهب في كعب الروتين ووزارة شؤون المرأة، مقياس بار 3 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: إعداد العينة داخل التعزيز-sem. (وه) سطح الصورة إلكترون الثانوية داخل وزارة شؤون المرأة-التعزيز من العينة (أ) مقياس الظنبوبي عصب، بار 100 ميكرومتر. (ﻫ) C. ايليجانس، مقياس بار 2 ميكرومتر. (ب-د) وشريحة (وح) من خلال نموذج باستخدام كشف حساب الضمان باء للتصوير. (ب وج) عصب الظنبوبي، مقياس بار 2 ميكرومتر. (f و g) C. ايليجانس، مقياس بار 1 ميكرومتر و 200 نانومتر. (ب وو) يظهر هي نتائج تجميد الضغط العالي واستبدال التجميد دون تعزيز، بينما سائر صور تظهر نتائج استبدال تجميد المحسنة. (د وح) الصورة التفصيلية للعينة باستخدام كاشف ESB. (د) عصب الظنبوبي، مقياس بار 200 نانومتر. (ح) مقياس C. ايليجانس، بار 200 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 4: صورة اقتناء والتصور- (أ) م البيانات المعروضة في إيمود مع ريسليسيد تقريبا x/y/z-طائرات، و z-مقياس بار 2 ميكرومتر. (ب) Segmented محاور عصبية م البيانات (الأزرق) وريماك حزم (أحمر)، والأغماد المايلين (الأصفر والبرتقالي) والميتوكوندريا (الفيروز)، مقياس بار 2 ميكرومتر. (c و d) نموذج ثلاثي الأبعاد، ومقياس بار 2 ميكرومتر و 500 نانومتر . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
وقد وضعت البروتوكول لتوضيح المحافظة المثلى والتباين القيام بتصوير الوجه كتلة المسلسل مع التعزيز-وزارة شؤون المرأة. لذلك، اخترنا لتطبيق cryo-التثبيت متبوعاً تلطيخ بعد استخدام استبدال تجميد وتجهيز ساعدت الموجات الدقيقة. لذلك، يقتصر هذا البروتوكول إلى عينات صغيرة بما يكفي لتجميد الضغط العالي. ويحدد حجم العينة الناقل، والذي يتطابق مع حجم العينة التي يمكن أن تجمد بشكل صحيح مع هذا الأسلوب قيود حجم من 3 إلى 6 ملم في العرض وسمك ~ 200 ميكرومتر. هذا ذات الصلة للعينة العصب الماوس، نظراً للعصب الوركي كبير جداً في القطر لتنسجم مع الناقلين 0.2 مم المطلوبة لضمان تجميد السليم. ولذلك، يوصي بتشريح دقيق من العصبية أصغر مثل عصب ظنبوبي أو غيرها العصب رقيقة مثل العصب الفخذي. منذ غمد المايلين حساس للتمدد، يجب أن تكون عناية كبيرة أثناء تشريح العصب جديدة وقابلة للاستمرار لتجنب التعامل مع القطع الأثرية. وبصفة عامة، ينبغي أن تستخدم نماذج قابلة للتطبيق فقط للإلكترون الدراسات المجهرية.
تجهيز مساعدة الميكروويف وتضمينها الراتنج الدنيا مصممة للإسراع بالإعداد وتوجيه العملية. تجهيز ميكروويف-وساعد تطبيق بروتوكول أوتو معدلة4 يستخدم للتثبيت الكيميائي في درجة حرارة الغرفة. لا ميكروويف منزلية ستسفر عن نفس النتائج، حيث هناك لا توزيع متجانس للموجات الدقيقة، ولا يتم التحكم في درجة الحرارة، وهناك فراغ لا يمكن تطبيقها. أصغر عينة، اختراق أفضل للمواد الكيميائية؛ ولذلك، يتم تحقيق أفضل النتائج من عينات أصغر. لتفادي إلحاق الضرر العينة بالانهاك، التحكم في درجة الحرارة وتطبيق قوة الموجات الحد الأدنى المطلوب الحاسمة. يمكن تنفيذ خطوات المعالجة المدعومة من الموجات الدقيقة على مقاعد البدلاء إذا لم يكن هناك لا الموجات الدقيقة المتاحة، مما يؤدي إلى وقت أطول للمعالجة. لهياكل الهدف مباشرة في وزارة شؤون المرأة، من المهم لإزالة الراتنج قدر ممكن من الجزء العلوي من النموذج. بعد تسجيل مجموعة من بيانات، يتم تجهيز البيانات الأولية اللازمة لتقليل حجم الملف وتحسين نسبة الإشارة إلى الضجيج. تقنيات التصوير الحديثة حجم إنتاج كميات كبيرة من البيانات. ولذلك، يلزم القيام بمعالجة البيانات بطريقة سريعة وكافية، كافية ذاكرة الوصول العشوائي على محطة العمل. لمحاذاة عمليات مطلوب على الأقل هما إضعاف ذاكرة الوصول العشوائي كحجم مجموعة البيانات.
وقد تم اختبار هذا البروتوكول على الظنبوبي عصب الماوس كذلك كما هو الحال في C. ايليجانس. قاعة et al. تستخدم 12 خطوة تعزيز مماثلة بعد حلولها التجميد على مقاعد البدلاء لإعداد C. ايليجانس. لأي أخرى نموذج الكائن الحي مثل الزرد، هي تعديلات البروتوكول اللازم المحتمل. تعديل ممكن واحد هو تغيير التركيبة لاستبدال تجميد كوكتيل، كما هو الحال بإضافة المياه المستخدمة ل تعزيز التباين18. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييفها للعينة مدة إبدال التجميد ويمكن اختصارها إلى حد كبير وفقا للبروتوكول إبدال التجميد السريع19. أحد الاحتمالات هو تطبيق الانفعالات للتعجيل بعملية استبدال تجميد20. بعد استبدال التجميد، كذلك تكون التعديلات المحتملة، مثل التطبيق المتكرر لتعزيز المواد الكيميائية وأكسيد الاوزميوم21. أثناء معالجة الموجات الدقيقة، يمكن أن تختلف في درجة الحرارة وأوقات الاحتضان وإعدادات الطاقة تحقيق أفضل النتائج لكل عينة.
ويبين هذا البروتوكول أن تعزيزا لمثل هذه يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع تجميد استبدال البروتوكولات وأنواع مختلفة من العينات كما هو موضح في القاعة12 التي يتم تصويرها في التعزيز-وزارة شؤون المرأة أو بواسطة المجهر الإلكتروني مسح الوجه كتلة المسلسل الأخرى. وتتطلب هذه تقنيات التصوير تباين المحسنة، والتي أقل أهمية مجهر إلكتروني.
Disclosures
وأعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
التعزيز-أمانة شؤون المرأة، أ. س. (موقف عامل التعزيز-وزارة شؤون المرأة) تمول من الكتلة للتميز والبحوث الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG) مركز النانو مجهرية والفيزيولوجيا الجزيئية للدماغ (كنمبب). ونحن نشكر المختبر من توماس مولر-رايشرت لتوفير عينات C. ايليجانس . ونحن نشكر أولريش ويكيرت للمشاركة في الفيلم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Leica HPM100 | Leica | ||
| Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
| Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
| EM ACE600 with gold target | Leica | ||
| Crossbeam 540 | Zeiss | ||
| Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
| Oven | VWR | ||
| Freezing | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
| Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
| A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
| B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
| Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
| Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
| Forceps | FST | 11200-10 | |
| Freeze substitution | |||
| Acetone | science services | 10015 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
| Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
| Acetone | EMS | 10015 | |
| Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
| Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
| Mounting | |||
| SEM stubs | Science Services | E75200 | |
| Aclar | Science Services | 50425-10 | |
| Toothpicks | |||
| filter paper | VWR | 512-3618 | |
| conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
| Software | |||
| Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
| Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
| Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
| Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
References
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
- Möbius, W., Nave, K. -A., Werner, H. B. Electron microscopy of myelin: Structure preservation by high-pressure freezing. Brain Research. 1641, 92-100 (2016).
- Mancuso, J., Lich, B., McDonald, K. Three-Dimensional Reconstruction Methods for Caenorhabditis elegans Ultrastructure. Methods in Cell Biology. 96, 331-361 (2010).
- Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , Available from: https://www.ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol (2010).
- Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue. Journal of Visualized Experiments. (53), e2588 (2011).
- Eberle, A. L., et al. High-resolution, high-throughput imaging with a multibeam scanning electron microscope. Journal of Microscopy. 259 (2), 114-120 (2015).
- Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 1-7 (2015).
- Schieber, N. L., et al. Minimal resin embedding of multicellular specimens for targeted FIB-SEM imaging. Methods in Cell Biology. 140, (2017).
- Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).
- Möbius, W., et al. Electron Microscopy of the Mouse Central Nervous System. Methods in Cell Biology. 96, 475-512 (2010).
- Hayat, M. A. Stains and Cytochemical Methods. , Plenum Press. New York and London. (1993).
- Hall, T. J., Hartweig, E., Nguyen, K. C. Q. OTO Fixation for SEM and Blockface Imaging. , Available from: http://www.wormatlas.org/EMmethods/OTOFix.htm (2018).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1-13 (2016).
- Walther, P., Ziegler, A. Freeze substitution of high-pressure frozen samples: The visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water. Journal of Microscopy. 208 (1), 3-10 (2002).
- Mcdonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243 (3), 227-233 (2011).
- Reipert, S., et al. Agitation Modules: Flexible Means to Accelerate Automated Freeze Substitution. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. , (2018).
- Lešer, V., Drobne, D., Pipan, Ž, Milani, M., Tatti, F. Comparison of different preparation methods of biological samples for FIB milling and SEM investigation. Journal of Microscopy. 233 (2), 309-319 (2009).
