Her præsenterer vi en protokol til at kombinere to prøve behandling teknikker, højtryks frysning og mikrobølgeovn-assisteret prøve behandling, efterfulgt af minimal harpiks indlejring for at opnå data med en fokuseret ion beam scanning elektron mikroskop (FIB-SEM). Dette er påvist ved hjælp af en mus tibial nerve prøve og Caenorhabditis elegans.
Den beskrevne prøve forberedelse teknik er designet til at kombinere de bedste kvalitet hvor de bedst egnede kontrasten for imaging modalitet i fokuseret ion beam scanning elektron mikroskop (FIB-SEM), som bruges til at opnå stakke af sekventielle billeder til 3D rekonstruktion og modellering. Højtryks frysning (HPF) giver mulighed for tæt på native strukturel bevarelse, men den efterfølgende fryse substitution ofte giver ikke tilstrækkelig kontrast, især for en større model, der er nødvendig for høj kvalitet billeddannelse i SEM kræves for 3D genopbygning. Derfor, i denne protokol, efter substitution fryse yderligere kontrasterende trin udføres ved stuetemperatur. Selv om disse trin er udført i en mikroovn, er det også muligt at følge traditionel bænk behandling, som kræver længere inkuberingstider. Den efterfølgende integrering i minimale mængder af harpiks giver mulighed for hurtigere og mere præcis målretning og forberedelse inde FIB-SEM. Denne protokol er især nyttig for prøver, der kræver forberedelse af højtryks frysning for en pålidelig ultrastrukturelle bevarelse, men ikke få nok kontrast under fryse substitution for volumen imaging ved hjælp af FIB-SEM. I kombination med minimal harpiks indlejring, giver denne protokol en effektiv arbejdsgang for erhvervelse af høj kvalitet mængde data.
Højtryks nedfrysning er metoden prøve forberedelse af valg for at opnå høj kvalitet ultrastrukturelle konservering, som repræsenterer den native tilstand af en meget bedre end konventionelle forberedelse metoder ved hjælp af kemisk fiksering1prøve. Denne cryo-forberedelse metode er nyttig for prøver som myelinerede mus væv2 og strenge krav til brug af model organisme Caenorhabditis elegans3. Efter fryse substitution og harpiks indlejring analyseres disse prøver normalt af transmissions elektronmikroskopi (TEM) eller electron tomografi (ET). Hvis større mængder skal være afbildet ved hjælp af FIB-SEM eller seriel blok-ansigt imaging for høj opløsning storstilede 3D rekonstruktioner, er vores erfaring, ordentlig billeddannelse af SEM hæmmes ofte af manglen på kontrast. I FIB-SEM, er billedet normalt optaget af påvisning af backscattered elektroner fra den primære elektronstråle. Udbyttet af backscattered elektroner er proportional med indhold af tungmetaller i prøven. Derfor var protokoller specielt designet til volumen imaging for at forbedre kontrasten af ekstra heavy metal imprægnering. Sådanne metoder er baseret på kemisk faste prøver og anvende en kombination af osmium dinitrogentetraoxid-thiocarbohydrazide-osmium dinitrogentetraoxid4, som beskrevet af Knott et al.5, for serielle blok-ansigt og fokuseret ion beam scanning Elektron Mikroskopi. Ændringer, herunder brugen af formamid og pyrogallol6 eller bly aspartat7 har været anvendt med succes til forskellige Billeddannende teknikker.
Protokollen i henhold her kombinerer cryo-forberedelse af prøver af HPF og fryse substitution med efterfølgende mikrobølgeovn-assisteret behandling for øget kontrast ved hjælp af thiocarbohydrazide/osmium dinitrogentetraoxid i acetone ved stuetemperatur. Vi demonstrere det på myelinerede nervus tibialis af mus og i Caenorhabditis elegans, som repræsenterer prøver, der kræver højtryks frysning for høj kvalitet ultrastrukturelle bevarelse. Desuden er det vist hvordan, efter dehydrering og infiltration, prøverne er integreret med som lille harpiks som muligt. Denne minimale harpiks indlejring8 giver mulighed for hurtigere målretning af strukturen af interesse og reducerer den tid brugt på prøve behandling, herunder mindre tidsforbrug for udsætter region af interesse med ion stråle. Efter at have udført yderligere prøve forberedelsestrin inde i mikroskopet, imaging og fræsning af prøven udføres kontinuerligt for at erhverve en stak billeder. For 3D-visualisering bruges billedbehandling software (IMOD) til at rekonstruere dele af datasættet.
Vores arbejdsproces beskriver, hvordan de bedst egnede kontrasterende prøver for volumen imaging kan kombineres med de bedste ultrastrukturelle bevarelse af HPF og fryse substitution. Dette er nyttigt for prøver, der strengt kræver cryo-forberedelse. Programmer er begrænset til små prøver, der kan forberedes ved HPF. I prøver af forskellige karakter, såsom plantemateriale eller mikroorganismer, kræver denne protokol tilpasning.
Protokollen blev udviklet for at illustrere den optimal bevarelse og kontrast til at udføre seriel blok-ansigt imaging med en FIB-SEM. Derfor valgte vi at anvende cryo-immobilisering efterfulgt af post farvning bruge fryse substitution og mikrobølgeovn-assisteret behandling. Denne protokol er derfor begrænset til prøver, der er lille nok til højtryks nedfrysning. Størrelsesbegrænsninger på 3 til 6 mm i bredde og tykkelse af ~ 200 µm er etableret af størrelsen af stikprøven transportøren, som svarer til prøvestørrelse, der kan fryses korrekt med denne teknik. Dette er relevant for musen nerve prøve, da iskiasnerven er for stor i diameter til at passe ind i de 0,2 mm luftfartsselskaber, der er nødvendige for at sikre korrekt frysning. Derfor anbefales omhyggelig dissektion af en mindre nerve som den tibial nerve eller andre tynde nerve som den femorale nerve. Da myelinskeden er følsomme over for stretching, skal stor omhu tages under dissektion af den friske og rentabel nerve at undgå håndtering artefakter. Generelt bør kun levedygtige prøver anvendes til elektron mikroskopiske undersøgelser.
Mikrobølgeovn-assisteret forarbejdning og minimal harpiks indlejring er designet til fremskyndelse af forberedelsen og målrettet proces. Mikrobølgeovn-assisteret behandling anvender en modificeret OTO protokol4 bruges til stuetemperatur kemisk fiksering. En husstand mikrobølgeovn vil ikke give de samme resultater, da der er nogen homogen fordeling af mikrobølger, dens temperatur kontrolleres ikke, og der er ingen vakuum, der kan anvendes. De mindre en prøve, bedre penetration af kemikalier; Derfor, de bedste resultater er opnået ved mindre prøver. For at undgå beskadigelse af prøven ved overophedning, er temperaturkontrol og anvendelse af minimalt kræves mikrobølgeovn magt kritisk. Mikrobølgeovn-assisteret behandlingstrin kan udføres på bænken, hvis der er ingen mikroovn tilgængelige, som vil føre til længere sagsbehandlingstider. Direkte mål strukturer i SEM er det vigtigt at fjerne så meget harpiks som muligt fra toppen af prøven. Efter optagelse af et datasæt, er efterbehandling af de rå data nødvendige for at reducere filstørrelsen og forbedre signal-støj-forhold. Moderne volumen Billeddannende teknikker producere store mængder data. Derfor, for at udføre databehandling i en hurtig og fyldestgørende måde, tilstrækkelig RAM på arbejdsstationen er nødvendig. For justering operationer kræves mindst to gange så meget RAM som datasæt størrelse.
Denne protokol er blevet testet på nervus tibialis musen så godt som i C. elegans. Hall et al. 12 anvendes en lignende ekstraudstyr skridt efter deres fryse substitution på bænken til forberedelse af C. elegans. For enhver anden model organisme som zebrafisk er justeringer af protokollen sandsynligvis nødvendigt. En mulig ændring er at ændre sammensætningen af fryse substitution cocktail, som ved tilsætning af vand, der bruges til kontrast enhancement18. Derudover varigheden af fryse substitution har tilpasses til prøven og kan forkortes betydeligt efter hurtig fryse substitution protokol19. En mulighed er anvendelsen af agitation for fremskyndelse fryse substitution proces20. Efter fryse substitution, yderligere er ændringer mulige, såsom gentagen anvendelse af kemikalier og osmium dinitrogentetraoxid21. I løbet af mikrobølgeovn behandling, kan temperatur, inkuberingstider og strømstyringsindstillinger varieres for at optimere resultaterne for de respektive prøve.
Denne protokol viser, at sådanne ekstraudstyr kan kombineres med andre fryse substitution protokoller og forskellige typer af prøver som beskrevet af Hal12 , der er afbildet i en FIB-SEM eller af serielle blok-ansigt scanning Elektron Mikroskopi. Disse billeddannelse teknikker kræver øget kontrast, som er mindre vigtigt for transmissions Elektron Mikroskopi.
The authors have nothing to disclose.
FIB-SEM og A.S. (placeringen af operatoren FIB-SEM) er finansieret af Cluster of Excellence og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Center nanoskala mikroskopi og molekylær fysiologi af hjernen (CNMPB). Vi takker lab af Thomas Müller-Reichert for at levere C. elegans prøver. Vi takke Ulrich Weikert for at deltage i filmen.
Instrumentation | |||
Leica HPM100 | Leica | ||
Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
EM ACE600 with gold target | Leica | ||
Crossbeam 540 | Zeiss | ||
Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
Oven | VWR | ||
Freezing | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
Forceps | FST | 11200-10 | |
Freeze substitution | |||
Acetone | science services | 10015 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
Acetone | EMS | 10015 | |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
Mounting | |||
SEM stubs | Science Services | E75200 | |
Aclar | Science Services | 50425-10 | |
Toothpicks | |||
filter paper | VWR | 512-3618 | |
conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
Software | |||
Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |