Summary
Hier presenteren we een protocol voor het combineren van twee monster verwerkingstechnieken, hogedruk bevriezing en magnetron-bijgewoonde monster verwerking, gevolgd door minimaal hars inbedding voor het verkrijgen van gegevens met een gerichte ion beam scannende elektronen microscoop (FIB-SEM). Dit is aangetoond door middel van een muis nervus monster en Caenorhabditis elegans.
Abstract
De beschreven monster voorbereiding techniek is ontworpen om het combineren van de beste kwaliteit van ultrastructurele behoud met het meest geschikte contrast voor de beeldvorming modaliteit in een gerichte ion beam scannende elektronen microscoop (FIB-SEM), die wordt gebruikt voor het verkrijgen stapels van opeenvolgende beelden voor 3D reconstructie en modellering. Hogedruk bevriezen (HPF) kunt dicht bij inheemse structurele behoud, maar de daaropvolgende bevriezen vervanging vaak voorziet niet in voldoende contrast, vooral een groter exemplaar die nodig is voor kwalitatief hoogwaardige beeldvorming in de SEM vereist voor 3D reconstructie. Daarom in dit protocol, worden na de bevriezing vervanging, extra contrasterende stappen uitgevoerd bij kamertemperatuur. Hoewel deze stappen zijn uitgevoerd in een magnetron, is het ook mogelijk te volgen van de traditionele bank verwerking, waarvoor een langere incubatietijd tijden. De daaropvolgende inbedding in minimale hoeveelheden hars zorgt voor sneller en nauwkeuriger richten en voorbereiding binnen de FIB-SEM. Dit protocol is vooral handig voor monsters die vereisen voorbereiding door hogedruk invriezen voor een betrouwbare ultrastructurele behoud, maar niet genoeg contrast winnen tijdens de bevriezing vervanging voor volume imaging met behulp van FIB-SEM. In combinatie met de minimale hars inbedding, biedt dit protocol een efficiënte workflow voor de aanschaf van kwalitatief hoogwaardige volumegegevens.
Introduction
Hogedruk bevriezing is de sample voorbereiding methode van keuze voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige ultrastructurele behoud, waarmee de geboortestaat van een veel beter dan conventionele bereidingswijzen met behulp van chemische fixatie1monster. Deze cryo-voorbereiding methode is nuttig voor monsters zoals myelinated muis weefsel2 en een strikte voorwaarde voor gebruik van het modelorganisme Caenorhabditis elegans3. Na vervanging van de bevriezing en hars inbedding, zijn meestal deze monsters geanalyseerd door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) of Elektronentomografie (ET). Als grotere volumes moeten worden beeld met behulp van FIB-SEM of seriële blok-gezicht imaging voor hoge resolutie grootschalige 3D-reconstructies, in onze ervaring goede beeldvorming door SEM wordt vaak gehinderd door het gebrek aan contrast. In de FIB-SEM, is het beeld meestal opgenomen door de detectie van terugverstrooide elektronen uit de primaire elektronenbundel. Het rendement van terugverstrooide elektronen is evenredig aan de hoeveelheid zware metalen in de steekproef. Daarom werden protocollen speciaal ontworpen voor volume imaging ter verbetering van het contrast door extra heavy metal impregneren. Dergelijke methoden zijn gebaseerd op chemisch vaste monsters en toepassing van een combinatie van osmium-tetroxide-thiocarbohydrazide-osmium tetroxide4, zoals beschreven door Knott et al.5, voor seriële blok-gezicht en ion beam scanning elektronen microscopie gericht. Wijzigingen met inbegrip van het gebruik van formamide en pyrogallol6 of lood aspartaat7 zijn met succes toegepast voor verschillende beeldvormingstechnieken.
Het protocol hier combineert de cryo-voorbereiding van specimens door HPF en bevriezen van substitutie met latere magnetron-bijgewoonde verwerking voor verbeterde contrast thiocarbohydrazide/osmium tetroxide met aceton bij kamertemperatuur. We laten dit zien op de myelinated van de nervus tibialis van muizen en in Caenorhabditis elegans, die monsters waarvoor hogedruk bevriezing voor kwalitatief hoogwaardige ultrastructurele behoud vertegenwoordigen. Daarnaast wordt aangetoond hoe, na uitdroging en infiltratie, de monsters zijn ingebed met als weinig hars mogelijk. Deze minimale hars inbedding8 zorgt voor snellere afstemming van de structuur van belang en vermindert de tijd besteed aan monster verwerking, met inbegrip van minder tijd nodig is voor de regio van belang met de ion beam bloot. Na het uitvoeren van verdere monster voorbereiding stappen binnen de Microscoop, wordt imaging en frezen van het monster uitgevoerd voortdurend te verwerven van een stapel van beelden. Voor 3D-visualisatie, wordt beeld processing software (IMOD) gebruikt om delen van de dataset te reconstrueren.
Onze workflow wordt beschreven hoe de meest geschikte contrasterende van monsters voor volume imaging kan worden gecombineerd met de beste ultrastructurele behoud door HPF en bevriezing substitutie. Dit is handig voor monsters die strikt cryo-voorbereiding vereisen. Toepassingen zijn beperkt tot kleine steekproeven dat kunnen worden bereid door HPF. In monsters van verschillende aard, zoals plantaardig materiaal of micro-organismen, vereist dit protocol aanpassing.
Protocol
Alle experimenten, met inbegrip van monsters van dieren die hier beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en de lagere Saksen staat Office voor bescherming van de afnemer en voedsel veiligheid (LAVES).
1. aansluiting van bevriezing en bevriezen van substitutie
- Het ontleden van de nervus tibialis van een muis (bijvoorbeeld, C57Bl6N, 12 weken, vrouwtje)9.
- Onderdompelen van de nervus tibialis in een druppel van 20% Polyvinylpyrrolidon (1 g PVP in 5 mL) in een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en gesneden stukken van 2 mm lengte. Dan, plaats deze in een metalen monster drager (Type A, 0,2 mm diepte) met behulp van fijne pincet. Voeg een andere vlakke vervoerder (Type B) bedekt met een dun laagje hexadecaan als een deksel en deze vergadering in de cartridge specimen invoegen.
- Overdracht van verschillende C. elegans opgeschort in een druppel van 20% bovien serumalbumine (BSA) in M9 (Zie Tabel van materialen) met een disposable plastic pipet in de metalen vervoerder (Type A). Vervolgens een tweede vervoerder als deksel bovenop (Type B) toevoegen en monteren van de cassette.
- Voor beide monsters, gaat u verder met de volgende: hogedruk de assembly's van monster, vervoerder één-voor-één door het laden van hen in de driedelige cartridge in het station van het laden van de hogedruk vriezer bevriezen. Druk op de knop proces volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant.
Opmerking: Beide soorten monsters kunnen samen verwerkt worden in de daaropvolgende bevriezing substitutie. - Plaats de monsters in cryovials met 2 mL bevroren 0,1% looizuur in aceton. De overdracht in een bad van vloeibare stikstof zonder morsen van vloeibare stikstof in de flesjes presteren. Breng de cryovials in een automatische bevriezing vervanging eenheid10 set bij-90 ° C en start het programma.
Opmerking: De monsters worden bewaard bij-90 ° C voor 100 h. looizuur voordat osmification wordt gebruikt als mordant om de opname van osmium tetroxide11. - Handmatig wassen de monsters 3 x 30 min met 2 mL aceton bij-90 ° C in de eenheid van de substitutie bevriezen.
- Laat de monsters in 2 mL zuiver 2% osmium tetroxide, 0,1% uranyl acetaat in aceton voor blijvende vlekken in de automatische bevriezen vervanging eenheid gedurende 7 uur bij-90 ° C.
Let op: Osmium tetroxide is giftig en moeten worden behandeld in een zuurkast en beschermingsmiddelen gedragen moet worden.
Opmerking: De eenheid van de substitutie bevriezen verhoogt automatisch de temperatuur tot-20 ° C bij 5 ° C/h. De monsters worden bewaard bij-20 ° C voor 16 h in de eenheid van de substitutie bevriezen. De temperatuur wordt automatisch tot 4 ° C bij 10 ° C/h verhoogd. - Wisselen van de osmium tetroxide oplossing met pure aceton wanneer de temperatuur heeft bereikt 4 ° C. Verwijder de cryovials uit de bevriezing vervanging eenheid.
2. magnetron-bijgewoonde verwerking
Opmerking: Alle van de volgende stappen uit bij kamertemperatuur12 met behulp van een temperatuur controle-eenheid om de temperatuur stabiel uitvoeren (Zie Tabel van materialen).
- Laat de doppen van de buizen reactie open tijdens de verwerking in de magnetron.
- Neem de metalen monster vervoerders uit de cryovials en verwijder de monsters uit de metalen vervoerder gebruik van fijne pincet of een naald, terwijl de monsters onderdompelen in aceton in een horlogeglas schotel (150 mm).
- Breng de monsters in 2 mL reactie buizen met fijne pincet of een pipet en wassen met 1 mL aceton viermaal voor 40 s bij 250 W.
Let op: Thiocarbohydrazide is giftig en moeten worden behandeld in een zuurkast, beschermingsmiddelen gedragen moet worden. - Vlek monsters met 1 mL van de 1% thiocarbohydrazide in aceton voor 14 min op 150 W te verhogen van het contrast. Voor het uitvoeren van de kleuring, de thiocarbohydrazide oplossing Pipetteer in de reactiebuis, plaats de buis in de magnetron, en stel het programma naar een energieniveau van 150 W (met de vacuüm functie ingeschakeld) voor 2 min op/2 min uit, doorlopen gedurende 14 minuten totale. Start de magnetron.
Opmerking: Thiocarbohydrazide reageert met de osmium-tetroxide die tijdens de bevriezing vervanging werd toegepast. Het vormt een brug, zodat meer osmium tetroxide worden gedeponeerd op de oorspronkelijke osmium tetroxide sites13. - Wassen van de monsters 4 x met 1 mL aceton voor 40 s bij 250 W. Pipet de aceton in een reactiebuis, plaatst u de buis in de magnetron, en selecteer 250 W voor 40 s. Start de magnetron.
- Vlek in 1 mL 2% osmium-tetroxide in aceton voor 14 min op 150 W. Pipet de osmium tetroxide-oplossing in een reactiebuis, plaatst u de buis in de magnetron, en stel het programma naar een energieniveau van 150 W (met de vacuüm functie ingeschakeld) voor 2 min op/2 min uit , doorlopen gedurende 14 minuten totaal. Start de magnetron.
- Wassen van de monsters 4 x met 1 mL aceton voor 40 s bij 250 W (zoals gedaan in stap 2.5).
- Infiltreren met 1 mL toenemende concentraties van hars in aceton (Zie Tabel van materialen) van 25%, 50%, 75%, 90%, 100% en 100% voor 3 min op 250 W. Pipet de hars in een reactiebuis, plaatst u de buis in de magnetron, en het programma ingesteld op een macht leve l van 250 W (met de vacuüm functie ingeschakeld) Start de magnetron voor 3 minuten.
3. minimale hars inbedding van8
- Neem de nervus tibialis en C. elegans uit de reactiebuis met een tandenstoker en plaats ze op een stukje plastic film (Zie Tabel van materialen).
- Gebruik de tandenstoker zachtjes duwen het monster rond op de plastic folie tot geen resterende hars wordt gedetecteerd. Gebruik een halogeenlamp voor verwarming (Zie Tabel van materialen) zodat de hars minder viskeuze wordt en vermag meer gemakkelijk worden verwijderd. Plaats de halogeenlamp dicht genoeg bij het opwarmen van de hars (voorzichtig niet te branden van de handen).
- De monsters gedurende ten minste 48 uur bij 60 ° C op de top van de plastic folie in de oven te polymeriseren.
4. voorbereiding van FIB-SEM
- De gepolymeriseerde monsters samen met de plastic folie met een scheermesje in een formaat dat past de SEM-stub uitknippen en deze koppelen aan de categorie van de SEM: met behulp van een geleidende zilveren hars (Zie Tabel van materialen). Polymeriseren weer bij 60 ° C gedurende ten minste 4 uur of 's nachts.
- Sputter jas de monsters op de SEM stub met goud voor 1 min op 35 mA met behulp van een sputter coater (platina/palladium kan ook worden gebruikt, een 10 nm dikke coating is voldoende) en plaats deze binnen de FIB-SEM.
5. data-acquisitie binnen de FIB-SEM
- Afbeelding van de monsters met de detector van de secundaire elektron met behulp van de basissoftware rijden de Microscoop (Zie Tabel van materialen). Het monster moet gericht zijn, zodat de regio van belang (b.v., middelste deel van de nervus tibialis of de C. elegans) in het gezichtsveld is.
Opmerking: Voor het uitvoeren van de data-acquisitie, kantel het werkgebied naar een positie zodat het monster wordt geconfronteerd met de ion beam in een hoek van 90° op de juiste afstand van de werken (5 mm) in het zogenaamde toeval-punt van de ion en elektron lichtbundel. Onze instrument gebruikt, wordt dit bereikt bij een stadium tilt van 54° en 5 mm werkende afstand. - Voor het instellen van de juiste positie van het monster, centreert u een gemeenschappelijk kenmerk bij een 0° tilt terwijl imaging met de secundaire electron detector. Langzaam deed tilt tot 54° (5°, 20°, 54°), hetzelfde object door de M-as te verplaatsen.
- Het toeval punt vinden door te centreren van een eigenschap terwijl imaging met de secundaire electron detector op 54°, gevolgd door de functie verplaatsen naar de centrale positie in de FIB-modus. Voer dit door het dradenkruis weer te geven in de SEM-software te hebben een indicatie van het centrum. Vervolgens verplaatst u eerst de functie geselecteerde monster naar het midden van het afbeeldingsgebied met behulp van de functie midden punt van de SEM-software. Vervolgens center de functie langs de y-as door het bewegen van het werkgebied in z. Een definitieve verschuiving tussen FIB en SEM is gecorrigeerd met behulp van de SEM lichtbundel verschuiving.
- Open de geavanceerde software (Zie Tabel of Materials) voor het opnemen van 3D datasets en volg de stapsgewijze wizard van de software.
- Op het gebied van belang, storting koolstof of platina (400 nm) op de top van de ROI met behulp van een huidige 3 nb te maken zelfs frezen en artefacten verminderen geïnduceerd door opladen.
Opmerking: Door de regio van belang zijn voor de op het oppervlak van de specimen beeld met de FIB (hoogte, breedte, diepte) worden gemalen, de software berekent en de grootte van de verschillende monster voorbereiding functies, zoals de loopgraven te worden gefreesd of gebied voor superimposes platina/carbon afzetting. Ook wees voorzichtig met de beeldvorming van het monster oppervlak met te hoge FIB stromingen, aangezien dit het monster oppervlak kan beschadigen. Een stroom van 50 pA is voldoende voor imaging. - Hiermee kunt u dat de gerichte ion beam molen een loopgraaf om de regio van belang (ROI) met behulp van een huidige 15/30-nA bloot te stellen.
- Gebruik de gerichte ion beam te poetsen dwarsdoorsnede met een 7 nA huidige.
- Na het beëindigen van de bereiding van de monsters, de volgende imaging parameters instellen: FIB frezen van parameters in het tabblad setup FIB (FIB frezen stroom); SEM imaging parameters in het tabblad setup en het beeld tuning parameters in het tabblad SEM AutoTune (uitvoeren van autofocus en autostigmation elke 60 min, 50 nm pixelgrootte, nadruktijd 3, gemiddelde 3 lijn). Optimaliseer deze voor elk monster.
- Om te voorkomen dat alle thermische drift waardoor het blok-gezicht op drift tijdens de run, de ruimte laten voor ten minste 2 uur voordat de overname.
- Verwerven van de dataset in een continue molen en het verwerven van modus met een 700 pA FIB huidige. Gebruik 1,5 kV (analytische wijze, 900 V) ESB detector met een raster spanning van 400 V te verwerven beelden elk met 5 nm pixelgrootte met behulp van de geavanceerde software (Zie Tabel van materialen) en 50 nm segment dikte. Één Beeldacquisitie duurt ongeveer 1.5 min met een Nadruktijd 6 µs.
- Start de data-acquisitie. Een afbeelding van de FIB op het huidige frezen is verworven om ervoor te zorgen dat het monster niet bewoog en de juiste regio van belang is geselecteerd. Pas indien nodig.
6. data visualization
- Open beelden in Fiji door te slepen van de map met alle beelden in Fiji en selecteer Virtuele stapel.
- Bijsnijden van de regio van belang met het rechthoekgereedschap (Afbeelding > Uitsnijden).
- Omkeren van de gegevens om aan te tonen van de traditionele Transmissie Electronenmicroscopie contrast met membranen verschijnen in donker (Bewerken > omkeren).
- TrackEM214 (Fiji15) gebruiken voor het uitlijnen. Laden van de gegevens in TrackEM2 (File > New > TrackEM2) door te klikken op de laag. Nadat alle afbeeldingen zijn geladen, ze uitlijnen met multi-layer mozaïek functie (Klik met de rechtermuisknop op Afbeelding > uitlijnen > Uitlijnen Multi-Layer mozaïek). Na de uitlijning, de afbeeldingen worden geëxporteerd als afzonderlijke tiff-bestanden (met de rechtermuisknop op Afbeelding > exporteren > Make installatiekopieën). Selecteer alle afbeeldingen die moeten worden geëxporteerd en kies opslaan in bestand.
- Voor post-processing, gebruiken een Gaussian blur (proces > Filters > Gaussiaans; sigma 2) en lokaal contrast enhancement (proces > Lokaal Contrast verbeteren; CLAHE: blocksize 127, histogram opslaglocaties 256, maximale helling 1.5), die worden toegepast in Fiji glad het beeld te verkrijgen van een beter signaal-/ ruisverhouding.
- IMOD16 wordt gebruikt voor het uitvoeren van een handmatige segmentatie en visualiseren de structuur van belang in 3D. Open de dataset IMOD en selecteer hulpmiddelen voor tekenen (speciale > hulpmiddelen voor tekenen) uit te voeren van de handmatige segmentatie. Verschillende handmatige hulpmiddelen kunnen worden gebruikt om de structuur van belang op het gehele het volume (bijvoorbeeld Join, Sculpt) volgen. Gebruik microscopie afbeeldingsbrowser (MIB17) voor semi-automatische segmentatie.
Representative Results
De werkstroom wordt gestart met een steekproef (hier, een vers ontleed muis nervus tibialis) in metalen dragers voor hogedruk bevriezing (Figuur 1a) wordt geplaatst. De dragers zijn hersteld van vloeibare stikstof (Figuur 1b) en geplaatst in een bevriezing vervanging eenheid op de top van de bevroren eerste chemische cocktail (Figuur 1 c). Na een lange bevriezen vervanging protocol, met inbegrip van 2% osmium tetroxide en 0,1% uranyl-acetaat, worden de monsters verwijderd uit de vervoerders bij kamertemperatuur (Figuur 1 d). Ter verdere verhoging van het contrast, worden de monsters overgedragen aan de kunststof buizen te verwerken in de magnetron (Figuur 1e). De Vacuuemcel en temperatuur controle-eenheid worden gebruikt voor het optimaliseren van het proces (Figuur 1f).
Om te kunnen uitvoeren de minimale hars inbedding, tandenstokers en vellen kunststoffolie nodig zijn (Figuur 2a). Na het infiltreren de monsters met hars met behulp van de magnetron, zijn ze geplaatst op stukjes plastic folie en verplaatst totdat geen hars niet op het oppervlak van de steekproef. Een halogeenlamp wordt gebruikt om te helpen de resterende hars afvoer en laat het monster minimaal ingesloten (Figuur 2b) op de plastic folie. Opgemerkt moet worden dat meer hars verwijderd uit de bovenkant van het monster goed is. Er moet nog een kleine hoeveelheid links onder het monster te houden gekoppeld aan de ondergrond. Het monster wordt polymeervorm op de plastic folie is gesneden en gemonteerd op de top van SEM beginnetje met zilveren geleidende hars (Figuur 2 c). De stub is polymeervorm gedurende ten minste 4 uur bij 60 ° C (figuur 2d). De componenten moeten grondig worden gemengd, of het mengsel niet correct kan polymeriseren. Om te voorkomen dat binnen de Scannende Elektronen Microscoop opladen, is de stub sputter bekleed met goud of platina/palladium (2e figuur).
De monsters worden geplaatst in de FIB-SEM en beeld met een secundaire electron detector te richten op de regio van belang (Figuur 3ae). Een ion lichtbundel wordt gebruikt voor het verwijderen van materiaal direct voor de regio van belang zijn voor het blootstellen van een dwarsdoorsnede (Figuur 3b-d, 3f-h). Standaardprotocollen lijden vaak aan een gebrek aan contrast van de membraan (Figuur 3bf), overwegende dat de verbeterde protocol een sterke membraan contrast (Figuur 3 c-d, 3 g-h biedt).
De EM-gegevens (na post-processing) worden gevisualiseerd met behulp van de IMOD, een afbeelding verwerking en modellering programma. Om een beter begrip van de 3D-informatie, virtuele reslicing van de gegevens wordt gebruikt (figuur 4a). Verschillende structuren van de dataset zijn gesegmenteerd handmatig (figuur 4b-d).
Figuur 1: aansluiting bevriezing, freeze-vervanging en magnetron-bijgewoonde verwerking. a sample vervoerder met de muis nervus tibialis, bar (b) monster vervoerder 3 mm. met de muis nervus tibialis na hogedruk bevriezing, bar 3 mm. (c) automatische bevriezing vervanging (AFS) schaaleenheid met monsters schalen. Inzet: op maat gemaakte metalen container voor maximaal 23 monster flesjes en twee grote flesjes die chemische stoffen bevatten in de AFS. (d) wordt verwijderd van de vervoerders in een glazen schaaltje in aceton, monsters schalen bar 3 mm. (e) monsters in reactie buizen worden gebracht in de magnetron voor verwerking. (f) vacuüm kamer en temperatuur controle-eenheid van de magnetron. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: minimale hars inbedding en voorbereiding voor de FIB-SEM. (a) plastic folie en tandenstokers die worden gebruikt voor de minimale hars inbedding, schaal bar 4 cm. (b) de Nervus tibialis ontdaan van hars op de top van de plastic folie, schaal bar 250 µm. (c) de Nervus tibialis polymeervorm op plastic folie, dan knippen en gemonteerd op de top van de SEM-stub met Zilveren geleidende hars, schaal bar 250 µm. (d) monsters polymeervorm op de top van de SEM-stub, schaal bar 3 mm. bar 3 mm. de (e) steekproeven bekleed met goud op de SEM stub, schaal Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: bereiding van het monster in de FIB-SEM. (een en e) Secundaire electron afbeelding binnen de FIB-SEM van het monster oppervlak (a) schaal van de Nervus tibialis, bar 100 µm. (e) C. elegans, schaal bar 2 µm. (b-d) en (f-h) doorsnede door monster met behulp van ESB detector voor imaging. (b en c) De schaal van de nervus tibialis, bar 2 µm. (f en g) C. elegans, schaal bar 1 µm en 200 nm. (b en f) Komt te staan, zijn de resultaten van hogedruk invriezen en bevriezing vervanging zonder verhoging, overwegende dat alle andere beelden van verbeterde bevriezen substitutie Showresultaten. (d en h) Gedetailleerd beeld van het monster met behulp van de ESB-detector. (d) Nervus tibialis, schaal bar 200 nm. (h) C. elegans, schaal bar 200 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Image verwerving en visualisatie. (a) EM gegevensset die wordt getoond in de IMOD met vrijwel resliced x / y/z-vliegtuigen, z- en schalen bar 2 µm. (b) Segmented axonen op EM gegevens (blauw), Remak bundels (rood), myeline omhulsels (geel en oranje)- en mitochondriën (turkoois), schaal bar 2 µm. (c en d) 3D-model, schaal bar 2 µm en 500 nm . Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Het protocol werd ontwikkeld om te illustreren de optimale conservering en het contrast voor het uitvoeren van seriële blok-gezicht beeldbewerking met een FIB-SEM. Daarom kozen we voor toe te passen cryo-immobilisatie gevolgd door na kleuring met behulp van bevriezing substitutie en magnetron-bijgewoonde verwerking. Dit protocol is daarom beperkt tot monsters die klein genoeg om hogedruk bevriezing zijn. De groottebeperkingen van 3 tot en met 6 mm in de breedte en de dikte van ~ 200 µm worden vastgesteld door de grootte van de steekproef vervoerder, die overeenkomt met de grootte van de steekproef, dat met deze techniek goed ingevroren worden kan. Dit is relevant voor de muis zenuw steekproef, aangezien ook groot in diameter te passen in de 0,2 mm vervoerders die nodig zijn om de juiste bevriezing is de nervus ischiadicus. Zorgvuldige dissectie van een kleinere zenuw zoals de nervus of andere dunne zenuwen zoals de femorale zenuw wordt daarom aangeraden. Aangezien de myelineschede gevoelig is aan zich het uitrekken, moet zorgvuldig tijdens dissectie van de verse en levensvatbare zenuw worden genomen om te voorkomen dat de behandeling van artefacten. In het algemeen moeten alleen levensvatbaar monsters worden gebruikt voor elektronen microscopische studies.
Magnetron-bijgewoonde verwerking en minimale hars inbedding zijn ontworpen voor het versnellen van de voorbereiding en targeting proces. De magnetron-bijgewoonde verwerking toepassen van een gewijzigde OTO protocol4 wordt gebruikt voor chemische fixatie van de kamertemperatuur. Huishoudelijke magnetron zal niet de dezelfde resultaten opleveren, aangezien er geen homogene verdeling van microgolven, de temperatuur is niet gecontroleerd, en er is geen vacuüm die kan worden toegepast. De kleinere per monster, de betere penetratie van de chemische stoffen; Daarom is de beste resultaten worden bereikt door kleinere monsters. Om te voorkomen dat schade aan het monster door oververhitting, zijn temperatuurcontrole en toepassing van de minimaal vereiste magnetron macht kritisch. De magnetron-bijgewoonde verwerking stappen kunnen worden uitgevoerd op de Bank, als er geen magnetron beschikbaar, die tot langere doorlooptijden leiden zal. Direct doel structuren in de SEM is het van cruciaal belang voor het verwijderen van zo veel hars mogelijk vanaf de bovenkant van het monster. Na het opnemen van een dataset, na verwerking van de ruwe gegevens is noodzakelijk ter bestandsgrootte verkleinen en verbeteren van de signaal-ruisverhouding. Moderne volume beeldvormingstechnieken produceren grote hoeveelheden gegevens. Dus, voor het uitvoeren van de verwerking van gegevens op een snelle en voldoende manier, voldoende RAM op het werkstation nodig is. Voor uitlijning operaties is ten minste twee keer zo veel RAM als de grootte van de dataset vereist.
Dit protocol is getest op de nervus tibialis van de muis zo goed zoals in C. elegans. Hall et al.. 12 een vergelijkbare verhoging stap na hun bevriezen substitutie op de Bank gebruikt voor bereiding van C. elegans. Voor elke andere modelorganisme zoals de zebravis zijn aanpassingen van het protocol waarschijnlijk noodzakelijk. Een eventuele wijziging is het wijzigen van de samenstelling van de bevriezing vervanging cocktail, zoals door de toevoeging van water dat wordt gebruikt voor contrast enhancement18. Bovendien, de duur van de bevriezing vervanging moet worden aangepast aan het monster en kan aanzienlijk worden verkort volgens de bevriezing van de snelle vervanging protocol19. Eén mogelijkheid is de toepassing van de agitatie voor een versnelling van de bevriezing vervanging proces20. Na de vervanging van bevriezing, verdere zijn wijzigingen mogelijk, zoals herhaalde toediening chemicaliën en osmium tetroxide21te verbeteren. Tijdens de verwerking van de magnetron, kunnen de temperatuur, incubatie tijden en energie-instellingen voor het optimaliseren van de resultaten voor de respectieve steekproef worden gevarieerd.
Dit protocol laat zien dat een dergelijke verhoging kan worden gecombineerd met andere bevriezen vervanging protocollen en verschillende soorten monsters zoals beschreven door Hal12 die zijn beeld in een FIB-SEM of door seriële blok-face scanning elektronen microscopie. Deze beeldvormende technieken vereisen verbeterde contrast, die minder belangrijk voor transmissie-elektronenmicroscopie is.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De FIB-SEM en A.S. (de positie van de exploitant FIB-SEM) worden gefinancierd door het Cluster van Excellence en Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Center Nanoscale microscopie en moleculaire fysiologie van de hersenen (CNMPB). Wij danken het lab van Thomas Müller-Reichert voor het verstrekken van de monsters C. elegans . Wij danken Ulrich Weikert voor deelname aan de film.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Leica HPM100 | Leica | ||
| Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
| Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
| EM ACE600 with gold target | Leica | ||
| Crossbeam 540 | Zeiss | ||
| Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
| Oven | VWR | ||
| Freezing | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
| Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
| A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
| B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
| Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
| Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
| Forceps | FST | 11200-10 | |
| Freeze substitution | |||
| Acetone | science services | 10015 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
| Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
| Acetone | EMS | 10015 | |
| Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
| Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
| Mounting | |||
| SEM stubs | Science Services | E75200 | |
| Aclar | Science Services | 50425-10 | |
| Toothpicks | |||
| filter paper | VWR | 512-3618 | |
| conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
| Software | |||
| Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
| Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
| Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
| Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
References
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
- Möbius, W., Nave, K. -A., Werner, H. B. Electron microscopy of myelin: Structure preservation by high-pressure freezing. Brain Research. 1641, 92-100 (2016).
- Mancuso, J., Lich, B., McDonald, K. Three-Dimensional Reconstruction Methods for Caenorhabditis elegans Ultrastructure. Methods in Cell Biology. 96, 331-361 (2010).
- Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , Available from: https://www.ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol (2010).
- Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue. Journal of Visualized Experiments. (53), e2588 (2011).
- Eberle, A. L., et al. High-resolution, high-throughput imaging with a multibeam scanning electron microscope. Journal of Microscopy. 259 (2), 114-120 (2015).
- Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 1-7 (2015).
- Schieber, N. L., et al. Minimal resin embedding of multicellular specimens for targeted FIB-SEM imaging. Methods in Cell Biology. 140, (2017).
- Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).
- Möbius, W., et al. Electron Microscopy of the Mouse Central Nervous System. Methods in Cell Biology. 96, 475-512 (2010).
- Hayat, M. A. Stains and Cytochemical Methods. , Plenum Press. New York and London. (1993).
- Hall, T. J., Hartweig, E., Nguyen, K. C. Q. OTO Fixation for SEM and Blockface Imaging. , Available from: http://www.wormatlas.org/EMmethods/OTOFix.htm (2018).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1-13 (2016).
- Walther, P., Ziegler, A. Freeze substitution of high-pressure frozen samples: The visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water. Journal of Microscopy. 208 (1), 3-10 (2002).
- Mcdonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243 (3), 227-233 (2011).
- Reipert, S., et al. Agitation Modules: Flexible Means to Accelerate Automated Freeze Substitution. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. , (2018).
- Lešer, V., Drobne, D., Pipan, Ž, Milani, M., Tatti, F. Comparison of different preparation methods of biological samples for FIB milling and SEM investigation. Journal of Microscopy. 233 (2), 309-319 (2009).
