यहां हम दो नमूना प्रसंस्करण तकनीकों, उच्च दबाव ठंड और माइक्रोवेव सहायता नमूना प्रसंस्करण, एक केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (FIB-SEM) के साथ डेटा प्राप्त करने के लिए ंयूनतम राल embedding द्वारा पीछा के संयोजन के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है । यह एक माउस टिबियल तंत्रिका नमूना और caenorhabditis एलिगेंसका उपयोग कर प्रदर्शित किया जाता है.
वर्णित नमूना तैयारी तकनीक एक केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (FIB-SEM), जो प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है में इमेजिंग साधन के लिए सबसे उपयुक्त विपरीत के साथ ultrastructural संरक्षण की सबसे अच्छी गुणवत्ता गठबंधन करने के लिए बनाया गया है 3 डी पुनर्निर्माण और मॉडलिंग के लिए अनुक्रमिक छवियों के ढेर । उच्च दबाव ठंड (HPF) देशी संरचनात्मक संरक्षण के लिए बंद की अनुमति देता है, लेकिन बाद में स्थिर प्रतिस्थापन अक्सर पर्याप्त विपरीत प्रदान नहीं करता है, विशेष रूप से एक बड़ा नमूना है, जो उच्च गुणवत्ता के लिए आवश्यक है के लिए 3 डी SEM में इमेजिंग पुनर्निर्माण. इसलिए, इस प्रोटोकॉल में, स्थिर प्रतिस्थापन के बाद, अतिरिक्त विषम कदम कमरे के तापमान पर किए जाते हैं । हालांकि इन चरणों एक माइक्रोवेव में प्रदर्शन कर रहे हैं, यह भी पारंपरिक बेंच प्रसंस्करण, जो अब ऊष्मायन बार की आवश्यकता का पालन करने के लिए संभव है । राल की ंयूनतम मात्रा में बाद embedding तेजी से और अधिक सटीक लक्ष्यीकरण और FIB-SEM अंदर तैयारी के लिए अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल के नमूनों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है कि एक विश्वसनीय ultrastructural संरक्षण के लिए उच्च दबाव ठंड के द्वारा तैयारी की आवश्यकता है, लेकिन मात्रा FIB-SEM का उपयोग इमेजिंग के लिए फ्रीज प्रतिस्थापन के दौरान पर्याप्त विपरीत लाभ नहीं है । न्यूनतम राल embedding के साथ संयोजन में, इस प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता वाले वॉल्यूम डेटा के अधिग्रहण के लिए एक कुशल कार्यप्रवाह प्रदान करता है ।
उच्च दबाव ठंड उच्च गुणवत्ता वाले ultrastructural संरक्षण, जो एक नमूना बहुत पारंपरिक तैयारी रासायनिक निर्धारण1का उपयोग कर तरीकों से बेहतर की देशी राज्य का प्रतिनिधित्व करता है प्राप्त करने के लिए पसंद का नमूना तैयारी विधि है । इस cryo-तैयारी विधि ऐसे myelinated माउस ऊतक2 के रूप में नमूनों के लिए उपयोगी है और मॉडल जीव Caenorहैबडाइटिस एलिगेंस3के उपयोग के लिए एक सख्त आवश्यकता है । प्रतिस्थापन और राल embedding फ्रीज के बाद, इन नमूनों आमतौर पर संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) या इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (एट) द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । यदि बड़ी मात्रा में FIB-SEM या धारावाहिक ब्लॉक-उच्च संकल्प बड़े पैमाने पर 3 डी reconstructions के लिए चेहरा इमेजिंग का उपयोग कर imaged होना चाहिए, हमारे अनुभव में SEM द्वारा उचित इमेजिंग अक्सर विपरीत की कमी से बाधित है । FIB-SEM में, छवि आमतौर पर प्राथमिक इलेक्ट्रॉन बीम से backscattered इलेक्ट्रॉनों का पता लगाने के द्वारा दर्ज की गई है । backscattered इलेक्ट्रॉनों की उपज नमूने में भारी धातुओं की सामग्री के लिए आनुपातिक है । इसलिए, प्रोटोकॉल विशेष रूप से अतिरिक्त भारी धातु impregnation द्वारा कंट्रास्ट को बढ़ाने के लिए वॉल्यूम इमेजिंग के लिए डिज़ाइन किए गए थे । इस तरह के तरीकों रासायनिक रूप से तय नमूनों पर आधारित है और आज़मियम टेट्रॉक्साइड का एक संयोजन लागू-thiocarbohydrazide-आज़मियम टेट्रॉक्साइड4, के रूप में knott एट अल.5द्वारा वर्णित है, धारावाहिक ब्लॉक के लिए-चेहरा और ध्यान केंद्रित आयन बीम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग । formamide और पाइरीगैलोल6 या सीसा aspartate7 के उपयोग सहित संशोधनों को सफलतापूर्वक अलग इमेजिंग तकनीकों के लिए लागू किया गया है ।
प्रोटोकॉल यहां उपलब्ध cryo-HPF द्वारा नमूनों की तैयारी को जोड़ती है और बाद माइक्रोवेव के साथ प्रतिस्थापन फ्रीज-सहायता प्रसंस्करण के लिए बढ़ाया विपरीत के लिए thiocarbohydrazide का उपयोग कर/ हम चूहों और Caenorहैबडाइटिस elegans, जो उच्च गुणवत्ता वाले ultrastructural संरक्षण के लिए उच्च दबाव ठंड की आवश्यकता होती है नमूनों का प्रतिनिधित्व में myelinated nervus टिबियल्स पर यह प्रदर्शित करता है । इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि कैसे, निर्जलीकरण और घुसपैठ के बाद, नमूनों के साथ संभव के रूप में छोटे राल के रूप में एंबेडेड हैं । इस ंयूनतम राल embedding8 ब्याज की संरचना के तेजी से लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति देता है और कम समय आयन बीम के साथ ब्याज के क्षेत्र को उजागर करने के लिए आवश्यक सहित नमूना प्रसंस्करण पर खर्च कम करता है । माइक्रोस्कोप के अंदर आगे नमूना तैयार करने के कदम के बाद, इमेजिंग और नमूना की मिलिंग लगातार किया जाता है एक छवियों के ढेर प्राप्त करने के लिए । 3 डी दृश्य के लिए, छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (IMOD) डेटासेट के कुछ हिस्सों का पुनर्निर्माण करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
हमारे कार्यप्रवाह का वर्णन करता है कि कैसे सबसे उपयुक्त मात्रा इमेजिंग के लिए नमूनों की विषम HPF और फ्रीज प्रतिस्थापन द्वारा सबसे अच्छा ultrastructural संरक्षण के साथ जोड़ा जा सकता है । यह कड़ाई cryo-तैयारी की आवश्यकता होती है कि नमूनों के लिए उपयोगी है । आवेदन HPF द्वारा तैयार किया जा सकता है कि छोटे नमूनों तक ही सीमित हैं । विभिन्न प्रकृति के नमूनों में, जैसे पादप सामग्री या सूक्ष्मजीवों के लिए, इस प्रोटोकोल में अनुकूलन की आवश्यकता होती है ।
प्रोटोकॉल एक FIB-SEM के साथ धारावाहिक ब्लॉक चेहरा इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए इष्टतम संरक्षण और इसके विपरीत वर्णन करने के लिए विकसित किया गया था । इसलिए, हम cryo-immobilization लागू करने के बाद के बाद धुंधला स्थिर प्रतिस्थापन और माइक्रोवेव की मदद से प्रसंस्करण का उपयोग करने का फैसला किया । इसलिए, इस प्रोटोकॉल है कि उच्च दबाव ठंड के लिए काफी छोटे है नमूनों तक ही सीमित है । चौड़ाई और ~ २०० μm की मोटाई में 3 से 6 मिमी के आकार सीमाओं नमूना वाहक है, जो ठीक से इस तकनीक के साथ जमे हुए किया जा सकता है कि नमूना आकार से मेल खाता है के आकार से स्थापित कर रहे हैं । यह माउस तंत्रिका नमूने के लिए प्रासंगिक है, के बाद से sciatic तंत्रिका व्यास में भी बड़ा है ०.२ mm वाहक है कि उचित ठंड सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है में फिट । इसलिए, इस तरह के टिबियल तंत्रिका या अन्य पतली तंत्रिका जैसे कि ऊरु तंत्रिका के रूप में एक छोटी तंत्रिका के सावधान विच्छेदन की सिफारिश की है । के बाद से myelin म्यान खींच करने के लिए संवेदनशील है, महान देखभाल ताजा और व्यवहार्य तंत्रिका के विच्छेदन के दौरान लिया जाना चाहिए कलाकृतियों से निपटने से बचें । सामान्यत इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी अध्ययनों के लिए केवल व्यवहार्य नमूनों का प्रयोग किया जाना चाहिए ।
माइक्रोवेव-असिस्टेड प्रोसेसिंग और मिनिमल रेज़िन एम्बेड तैयार करने और टार्गेटिंग प्रोसेस को तेज करने के लिए डिजाइन किए गए हैं । माइक्रोवेव सहायता प्रसंस्करण एक संशोधित OTO प्रोटोकॉल4 आवेदन कमरे के तापमान रासायनिक निर्धारण के लिए प्रयोग किया जाता है । एक घर माइक्रोवेव एक ही परिणाम नहीं निकलेगा, क्योंकि वहां माइक्रोवेव के कोई समरूप वितरण नहीं है, इसके तापमान नियंत्रित नहीं है, और कोई शूंय है कि लागू किया जा सकता है । छोटे नमूने, रसायनों की बेहतर पैठ; इसलिए, सबसे अच्छा परिणाम छोटे नमूनों द्वारा प्राप्त कर रहे हैं । overheating द्वारा नमूना को नुकसान से बचने के लिए, तापमान नियंत्रण और ंयूनतम आवश्यक माइक्रोवेव शक्ति के आवेदन महत्वपूर्ण हैं । माइक्रोवेव-सहायता प्रसंस्करण कदम बेंच पर प्रदर्शन किया जा सकता है अगर कोई माइक्रोवेव उपलब्ध है, जो अब प्रसंस्करण समय के लिए नेतृत्व करेंगे । SEM में सीधे लक्ष्य संरचनाओं के लिए, यह नमूना के शीर्ष से संभव के रूप में ज्यादा राल को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है । एक डेटासेट रिकॉर्डिंग के बाद, रॉ डेटा के बाद प्रसंस्करण फ़ाइल आकार को कम करने और सिग्नल से शोर अनुपात में सुधार करने के लिए आवश्यक है । आधुनिक मात्रा इमेजिंग तकनीकों डेटा की बड़ी मात्रा में उत्पादन । इसलिए, एक तेज़ और पर्याप्त तरीके से डेटा संसाधन निष्पादित करने के लिए, कार्यस्थान पर पर्याप्त RAM की आवश्यकता है । संरेखण कार्रवाई के लिए कम से दो बार अधिक RAM के रूप में डेटासेट आकार के रूप में आवश्यक है ।
इस प्रोटोकॉल का परीक्षण चूहे के साथ-साथ सी. एलिगेंसमें भी किया गया है । हॉल एट अल. 12 C. elegans की तैयारी के लिए बेंच पर उनके स्थिर प्रतिस्थापन के बाद एक समान वृद्धि कदम इस्तेमाल किया । ऐसे zebrafish के रूप में किसी भी अंय मॉडल जीव के लिए, प्रोटोकॉल के समायोजन की संभावना आवश्यक हैं । एक संभव संशोधन के लिए पानी के अलावा है कि इसके विपरीत वृद्धि18के लिए प्रयोग किया जाता है के रूप में फ्रीज प्रतिस्थापन कॉकटेल, की संरचना बदलने के लिए है । इसके अलावा, फ्रीज प्रतिस्थापन की अवधि के नमूने के लिए अनुकूलित किया है और काफी जल्दी फ्रीज प्रतिस्थापन प्रोटोकॉल19के अनुसार छोटा किया जा सकता है । एक संभावना है कि फ्रीज प्रतिस्थापन प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए आंदोलन का अनुप्रयोग है20. स्थिर प्रतिस्थापन के बाद, आगे संशोधन संभव है, जैसे रसायनों और आज़मियम टेट्रोक्साइड21बढ़ाने के दोहराया आवेदन के रूप में । माइक्रोवेव प्रसंस्करण के दौरान, तापमान, ऊष्मायन बार, और बिजली सेटिंग्स संबंधित नमूना के लिए परिणाम का अनुकूलन करने के लिए अलग किया जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि ऐसी वृद्धि अन्य फ्रीज प्रतिस्थापन प्रोटोकॉल और नमूने के विभिन्न प्रकार के साथ संयुक्त किया जा सकता है के रूप में हॉल12 कि एक FIB-SEM में imaged हैं या सीरियल ब्लॉक-चेहरा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा वर्णित. इन इमेजिंग तकनीकों में एंहांस्ड कंट्रास्ट की आवश्यकता होती है, जो संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए कम महत्वपूर्ण है ।
The authors have nothing to disclose.
FIB-SEM और एएस (FIB-SEM ऑपरेटर की स्थिति) उत्कृष्टता और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) अनुसंधान केंद्र नैनो माइक्रोस्कोपी और मस्तिष्क (CNMPB) के आणविक फिजियोलॉजी के क्लस्टर द्वारा वित्त पोषित कर रहे हैं । हम C. एलिगेंस नमूने प्रदान करने के लिए थॉमस müller-reichert की प्रयोगशाला धंयवाद। हम फिल्म में भाग लेने के लिए Ulrich Weikert धंयवाद ।
Instrumentation | |||
Leica HPM100 | Leica | ||
Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
EM ACE600 with gold target | Leica | ||
Crossbeam 540 | Zeiss | ||
Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
Oven | VWR | ||
Freezing | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
Forceps | FST | 11200-10 | |
Freeze substitution | |||
Acetone | science services | 10015 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
Acetone | EMS | 10015 | |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
Mounting | |||
SEM stubs | Science Services | E75200 | |
Aclar | Science Services | 50425-10 | |
Toothpicks | |||
filter paper | VWR | 512-3618 | |
conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
Software | |||
Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |