Qui presentiamo un protocollo per la combinazione di due tecniche di elaborazione del campione, ad alta pressione congelamento e trattamento dei campioni assistita da microonde, seguita da minima resina incorporamento per l’acquisizione di dati con un microscopio elettronico a scansione di fascio ionico focalizzato (FIB-SEM). Questo è dimostrato utilizzando un mouse del nervo tibial campione e Caenorhabditis elegans.
La tecnica di preparazione del campione descritto è stata progettata per combinare le migliori qualità di conservazione ultrastrutturale con il contrasto più adatto per le modalità di formazione immagine in ionico focalizzato fascio microscopio elettronico a scansione (FIB-SEM), che viene utilizzato per ottenere pile di immagini sequenziali per la ricostruzione 3D e modellazione. Ad alta pressione di congelamento (HPF) permette vicino nativo conservazione strutturale, ma il successivo congelamento sostituzione spesso non fornisce sufficiente contrasto, soprattutto per un esemplare più grande, che è necessaria per l’imaging di alta qualità nel SEM richiesto per 3D ricostruzione. Pertanto, nel presente protocollo, dopo la sostituzione di congelare, a contrasto eseguite ulteriori operazioni sono a temperatura ambiente. Anche se queste operazioni vengono eseguite in un forno a microonde, è anche possibile seguire la lavorazione tradizionale panca, che richiede tempi di incubazione più lunghi. L’incorporamento successive in minime quantità di resina permette più veloce e precisa di targeting e di preparazione all’interno FIB-SEM. Questo protocollo è particolarmente utile per gli esempi che richiedono una preparazione di congelamento ad alta pressione per una conservazione ultrastrutturale affidabile ma non ottengono abbastanza contrasto durante la sostituzione di congelare per imaging con volumi utilizzando FIB-SEM In combinazione con l’incorporamento di resina minima, questo protocollo fornisce un flusso di lavoro efficiente per l’acquisizione dei dati del volume di alta qualità.
Il congelamento ad alta pressione è il metodo di preparazione del campione di scelta per l’ottenimento di conservazione ultrastrutturale di alta qualità, che rappresenta lo stato nativo di un campione molto meglio rispetto ai metodi convenzionali di preparazione mediante fissazione chimica1. Questo metodo di cryo-preparazione è utile per i campioni quali mouse myelinated tessuto2 e un requisito indispensabile per l’utilizzo dell’organismo modello Caenorhabditis elegans3. Dopo la sostituzione di congelamento e l’incorporamento di resina, questi campioni vengono analizzati solitamente di microscopia elettronica a trasmissione (TEM) o tomografia elettronica (ET). Se più grandi volumi devono essere imaged con FIB-SEM o formazione immagine seriale blocco-viso per ricostruzioni 3D su larga scala ad alta risoluzione, nella nostra esperienza adeguata formazione immagine di SEM è spesso ostacolata dalla mancanza di contrasto. Nel FIB-SEM, l’immagine è registrata solitamente tramite la rilevazione di backscattered gli elettroni dal fascio primario dell’elettrone. La resa di backscattered gli elettroni è proporzionale al contenuto di metalli pesanti nel campione. Pertanto, protocolli sono stati progettati specialmente per volume di imaging per migliorare il contrasto da impregnazione metalli pesanti supplementari. Tali metodi si basano su campioni fissati chimicamente e applicano una combinazione di tetrossido di osmio-thiocarbohydrazide-osmio tetrossido4, come descritto da Knott et al.5, per seriale blocco-face e concentra il fascio di ioni, microscopia elettronica a scansione. Modifiche tra le quali l’uso di formammide e pirogallolo aspartato a6 o piombo7 sono state applicate con successo per diverse tecniche di imaging.
Il protocollo fornito qui combina la cryo-preparazione dei campioni di HPF e congelare sostituzione con successiva elaborazione per contrasto migliorato utilizzando thiocarbohydrazide/OsO4 in acetone a temperatura ambiente assistita da microonde. Dimostriamo questa sul tibiale di nervus myelinated dei topi e in Caenorhabditis elegans, che rappresentano esempi che richiedono alta pressione congelamento per conservazione ultrastrutturale di alta qualità. Inoltre, è indicato come, dopo la disidratazione e l’infiltrazione, i campioni sono incorporati con come poco resina come possibile. Questa resina minimal incorporamento8 permette per il targeting più veloce della struttura di interesse e riduce il tempo dedicato all’elaborazione del campione, compreso meno tempo di esporre l’area di interesse con il fascio di ioni. Dopo l’esecuzione di ulteriori passaggi di preparazione del campione all’interno del microscopio, imaging e macinazione del campione avviene continuamente di acquisire una serie di immagini. Per la visualizzazione 3D, software (IMOD) elaborazione delle immagini viene utilizzata per ricostruire parti del dataset.
Il nostro flusso di lavoro viene descritto come il più adatto a contrasto dei campioni per imaging con volumi possa essere combinato con la migliore conservazione ultrastrutturale di sostituzione HPF e congelare. Questo è utile per i campioni che richiedono rigorosamente cryo-preparazione. Le applicazioni sono limitate a piccoli campioni che possono essere preparati da HPF. Nei campioni di diversa natura, come materiale vegetale o microrganismi, questo protocollo richiede adattamento.
Il protocollo è stato sviluppato per illustrare la conservazione ottimale e il contrasto per eseguire imaging seriale blocco-faccia con un FIB-SEM Pertanto, abbiamo scelto di applicare cryo-immobilizzazione seguita da post-colorazione mediante sostituzione di congelare ed elaborazione assistita da microonde. Di conseguenza, questo protocollo è limitato ai campioni che sono abbastanza piccoli per congelamento ad alta pressione. Le limitazioni delle dimensioni di 3-6 mm di larghezza e spessore di ~ 200 µm sono stabiliti dalla dimensione del vettore campione, cui corrisponde la dimensione del campione che può essere opportunamente congelata con questa tecnica. Ciò è rilevante per il campione del nervo del mouse, poiché il nervo sciatico è troppo grande in diametro per adattarsi i vettori di 0,2 mm che sono tenuti a garantire il corretto congelamento. Pertanto, si raccomanda un’attenta dissezione di un nervo più piccolo come il nervo tibial o altro nervo sottile come il nervo femorale. Poiché la guaina mielinica è sensibile allo stiramento, si deve prestare attenzione grande durante la dissezione del nervo fresca e vitale per evitare di gestire artefatti. In generale, solo praticabili campioni devono essere utilizzati per studi al microscopio elettronico.
Elaborazione assistita da microonde e l’incorporamento di resina minimal sono progettati per accelerare la preparazione e il processo di targeting. L’elaborazione assistita da microonde, l’applicazione di un protocollo di modificate OTO4 viene utilizzato per la fissazione chimica temperatura ambiente. Forno a microonde domestico non produrrà gli stessi risultati, poiché non c’è nessuna distribuzione omogenea delle microonde, la temperatura non è controllata e non c’è nessun vuoto che può essere applicato. Il più piccolo un campione, la migliore penetrazione delle sostanze chimiche; di conseguenza, i risultati migliori si ottengono dai campioni più piccoli. Per evitare danni al campione di surriscaldamento, controllo della temperatura e applicazione della potenza microonde minimamente richiesto sono fondamentali. Le fasi di lavorazione assistita da microonde possono essere eseguite in panchina se non c’è nessun forno a microonde disponibile, che porterà a tempi di elaborazione più lunghi. A direttamente strutture bersaglio nel SEM, è fondamentale per rimuovere quanto più resina come possibile dalla parte superiore del campione. Dopo aver registrato un set di dati, post-elaborazione dei dati grezzi è necessario ridurre la dimensione del file e migliorare il rapporto segnale-rumore. Tecniche di imaging volume moderno di produrre grandi quantità di dati. Pertanto, per eseguire l’elaborazione di dati in modo rapido e sufficiente, è necessario sufficiente RAM sulla workstation. Per le operazioni di allineamento è necessaria almeno due volte tanto RAM come la dimensione del dataset.
Questo protocollo è stato testato sul nervus tibiale del mouse anche come in c. elegans. Hall et al.. un simile passo di valorizzazione utilizzato 12 dopo la loro sostituzione di congelare in panchina per la preparazione di elegans del c. Per qualsiasi altro organismo di modello come zebrafish, regolazioni del protocollo sono probabilmente necessarie. Una eventuale modifica è quello di cambiare la composizione della sostituzione congelamento cocktail, come ad esempio tramite l’aggiunta di acqua che è usata per contrasto valorizzazione18. Inoltre, la durata della sostituzione di congelamento deve essere adattata al campione e può essere accorciata considerevolmente secondo il congelamento rapido sostituzione protocollo19. Una possibilità è l’applicazione di agitazione per accelerare il processo di sostituzione congelare20. Dopo la sostituzione di congelare, ulteriori modifiche sono possibili, come ad esempio l’applicazione ripetuta di valorizzare prodotti chimici e tetrossido di osmio21. Durante l’elaborazione del forno a microonde, la temperatura, tempi di incubazione e le impostazioni di alimentazione possono essere variate per ottimizzare i risultati per il rispettivo campione.
Questo protocollo viene illustrato che un simile rafforzamento possa essere combinato con altri protocolli di sostituzione di congelare e diversi tipi di campioni come descritto da padiglione12 che sono imaged in un FIB-SEM o di microscopia elettronica a scansione seriale blocco-faccia. Queste tecniche di imaging richiedono maggiore contrasto, che è meno importante per microscopia elettronica di trasmissione.
The authors have nothing to disclose.
Il FIB-SEM e A.S. (la posizione dell’operatore FIB-SEM) sono finanziate con il Cluster di eccellenza e Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Center su scala nanometrica microscopia e fisiologia molecolare del cervello (CNMPB). Ringraziamo il laboratorio di Thomas Müller-Reichert per fornire i campioni di c. elegans . Ringraziamo Ulrich Weikert per la partecipazione nel film.
Instrumentation | |||
Leica HPM100 | Leica | ||
Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
EM ACE600 with gold target | Leica | ||
Crossbeam 540 | Zeiss | ||
Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
Oven | VWR | ||
Freezing | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
Forceps | FST | 11200-10 | |
Freeze substitution | |||
Acetone | science services | 10015 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
Acetone | EMS | 10015 | |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
Mounting | |||
SEM stubs | Science Services | E75200 | |
Aclar | Science Services | 50425-10 | |
Toothpicks | |||
filter paper | VWR | 512-3618 | |
conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
Software | |||
Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |