Summary
Qui presentiamo un protocollo per esprimere, solubilizzano e purificare diversi trasportatori eucariotiche borato con omologia alla famiglia del trasportatore del SLC4 usando lievito. Inoltre descriviamo un'analisi cross-linking chimica per valutare le proteine purificate homomeric per multimerici Assemblea. Questi protocolli possono essere adattati per altre proteine di membrana impegnativo.
Abstract
La famiglia di soluto Carrier 4 (SLC4) delle proteine è chiamata i trasportatori di bicarbonato e include la proteina archetipica dell'anione Exchanger 1 (AE1, noto anche come banda 3), la proteina più abbondante di membrana in cellule rosse del sangue. La famiglia SLC4 è omologa con i trasportatori di borato, che sono stati caratterizzati in piante e funghi. Rimane una significativa sfida tecnica per esprimere e purificare proteine di trasporto di membrana ad omogeneità in quantità adatta per studi strutturali o funzionali. Qui descriviamo le procedure dettagliate per la sovraespressione di trasportatori di borato in Saccharomyces cerevisiae, isolamento delle membrane di lievito, solubilizzazione delle proteine dal detersivo e la purificazione degli omologhi transporter borato da S. cerevisiae, Arabidopsis thalianae Oryza sativa. Dettagliamo anche un cross-linking esperimento per analizzare multimerization dei trasportatori homomeric di glutaraldeide. Le nostre procedure di generalizzato possono essere applicati a tutte e tre le proteine e sono stati ottimizzati per efficacia. Molte delle strategie sviluppate qui può essere utilizzati per lo studio di altre proteine di membrana impegnativo.
Introduction
La difficoltà di ottenere una quantità sufficiente di proteina purificata della membrana rimane un ostacolo critico nel perseguimento di studi strutturali e funzionali dei recettori, canali ionici e trasportatori. Esistono molti protocolli per condutture moderatamente elevato throughput a schermo e trovare proteine di membrana di candidato che esprimono abbastanza bene per consentire successivi in vitro studi1,2,3,4 . In genere, proteine sono contrassegnate con una proteina fluorescente N - o C-terminale verde (GFP) e i livelli di espressione sono monitorati mediante fluorescenza in gel o rilevazione di fluorescenza dimensione esclusione cromatografia (FSEC)5. Tali approcci consentono la triaging dei candidati di proteine di membrana in alti che esprimono proteine, moderate o basse che esprimono le proteine, o proteine che esprimono scarsamente o per niente. Questo approccio funziona bene quando il disegno sperimentale è quello di indagare un numero elevato di geni candidati con l'intenzione di selezionare qualsiasi proteina esprime il meglio. Tuttavia, in alcuni casi, un approccio sperimentale si basa sullo studio di una proteina di membrana particolare, che può essere difficile quando i livelli di espressione della proteina che sono nella gamma di bassa o moderata. Inoltre, a volte in questi casi, i livelli di espressione possono essere solo in minima parte aumentati alterando il costrutto tramite troncamenti, mutazioni thermostabilizing o ottimizzazione di codone. È, pertanto, a volte necessarie per ottimizzare i protocolli di espressione e purificazione di proteine della membrana per le proteine di membrana che esprimono solo moderatamente bene.
La famiglia SLC4 dei trasportatori comprende il trasportatore di bicarbonato anione Exchanger 1 (noto anche come banda 3), la proteina più abbondante di membrana in cellule di anima rosse6e un fattore chiave della respirazione cellulare. La famiglia SLC4 è omologa con i trasportatori di borato, che sono fondamentali nelle piante e sono stati indicati per esibire una struttura simile a 1 scambiatore di anioni come pure a sodio-accoppiato SLC4 trasportatori7,8,9 ,10. Qui segnaliamo i protocolli di espressione e purificazione proteina ottimizzato utilizzando S. cerevisiae per purificare tre trasportatori di borato diversi trovati in lievito ed in piante. Evidenziamo in fasi chiave dettaglio che abbiamo preso per ottimizzare il rendimento e l'efficienza delle purificazioni di omogeneità. Inoltre, segnaliamo un'analisi cross-linking chimica usando glutaraldeide per monitorare l'assembly multimeric di questi trasportatori nel contesto di un complesso proteina-detergente-lipide purificato. L'esperimento di cross-linking può aiutare a valutare l'idoneità dell'omologo e detergente valutando lo stato di multimerici dei trasportatori oligomerici dopo purificazione.
Questo protocollo si presuppone che il trasportatore desiderato è stato clonato in un plasmide di 2 µ derivato sotto controllo viscoelastica del promotore GAL1 per espressione in S. cerevisiae. Per queste procedure, il DNA è stato usato codificanti full-length selvaggio-tipo borato trasportatori Saccharomyces cerevisiae Bor1 (ScBor1)11, Arabidopsis thaliana Bor1 (AtBor1)12e Oryza sativa Bor3 (OsBor3)13 . Il C-terminus a ogni costrutto viene aggiunto con un 10-His-tag e un sito di clivaggio della trombina inserito tra il trasportatore e il 10-His-tag per consentire la sua rimozione se desiderato. Il protocollo si assume anche che il plasmide è già stato trasformato nel DSY-5 espressione ceppo di Saccharomyces cerevisiae su terreni selettivi supplementare completa (CSM) privo di istidina.
Protocol
1. preparazione dei media e importante buffer
- Preparare 500 mL di 40% galattosio aggiungendo 200 g di galattosio e acqua deionizzata per un volume totale di 500 mL. Utilizzare una piastra riscaldante o forno a microonde per aumentare il tasso di galattosio entrare in soluzione. Filtro sterile con un apparato di filtrazione sotto vuoto composto da un top di filtro 0,2 µm attaccato ad una bottiglia di vetro sterile.
Nota: Tutte le soluzioni di media sono preparate con acqua deionizzata. - Preparare 500 mL di glucosio 40% aggiungendo 200 g di glucosio e l'acqua ad un volume totale di 500 mL. Autoclave per sterilizzare.
- In ciascuno dei quattro palloni 2L, aggiungere 0,4 g di miscela integratore completo senza istidina (CSM-His), 3,35 g lievito azoto base con solfato di ammonio (YNB + azoto) e 475 mL di acqua. Sterilizzare in autoclave. Aggiungere 25 mL di glucosio 40% per ottenere una concentrazione di glucosio nel finale del 2%.
- Aggiungere, una bottiglia di vetro, peptone g 50 e 25 g di Estratto di lievito e acqua a 375 mL. Sterilizzare in autoclave. Aggiungere 125 mL di 40% galattosio a dare 5 x soluzione di lievito peptone (YP) contenente 10% galattosio.
- Aggiungere, in un pallone da 250 mL, 0,04 g CSM-His, 0,335 g YNB + azoto e acqua a 47,5 mL. Sterilizzare in autoclave. Aggiungere 2,5 mL di glucosio 40% per ottenere 50 mL di CSM-His YNB + 2% di glucosio.
- Preparare 1 L di 1M Tris pH 7.0 con 121,14 g di Tris base con 800 mL di acqua. Fino a quando raggiunge il pH 7.0, aggiungere acido cloridrico concentrato. Aggiungere acqua ad un volume finale di 1L e passare attraverso un filtro da 0,2 µm.
- Preparare 500 mL di 0,5 M Etilendiamminotetraacetico acido (EDTA), pH 8.0 73,06 g di EDTA con 400 mL di acqua. Aggiungere pellet di idrossido di sodio fino a quando l'EDTA ha dissolto e raggiunge il pH 8.0. Aggiungere acqua ad un volume finale di 500 mL e passare attraverso un filtro da 0,2 µm.
- Preparare 100 mL di fluoruro di fenilmetanosolfonil 100 mM (PMSF) 1,74 g di PMSF con etanolo prova 200. Conservare a-20 ° C.
- Preparare 225 mL di tampone di lavaggio perlina composto da Tris 50 mM a pH 7.0, NaCl 1,4 M, 20% glicerolo e 1 mM EDTA pH 8.0: 2x.
- Preparare 100 mL del buffer di cromatografia di esclusione di dimensione (S200 buffer) costituito da 20 mM 4-Morpholinoethanesulfonic acido idrato (MES) pH 6.5, NaCl 100 mM, 2% glicerolo e 0,03% n-dodecil-beta-D-Maltopyranoside (DDM).
- Preparare 100 mL di tampone di risospensione di membrana costituita da 50 mM Tris-HCl pH 7.0, 500 mM NaCl e glicerolo al 10%.
- Preparare 10 mL di un 3 x tintura di caricamento SDS-PAGE con 3 mL 20% sodio dodecil solfato (SDS), glicerolo 3ml, 2,4 mL 1M Tris-HCl pH 6.8, 0,03 g di blu di bromofenolo e 1,6 mL 2-mercaptoetanolo.
2. la sovraespressione di borato Transporter in S. cerevisiae
- Inoculare tre colonie di lievito trasformato in 50 mL di CSM-His + YNB + 2% glucosio media e agitare durante la notte a 190 giri/min a 30 ° C.
- Il giorno seguente utilizzare uno spettrofotometro per determinare la densità ottica a una lunghezza d'onda di 600 nm (OD600) e inoculare un OD600 0,01 ogni quattro palloni tarati da 2 L, ciascuna delle quali contiene 500 mL di CSM-His YNB + + 2% glucosio media.
- Agitare a 190 giri/min a 30 ° C per 30 h per consentire alle cellule di consumare tutti i glucosio e crescere fino a un'alta densità.
Nota: Un tempo più lungo di crescita rese risultati nella cella più grande, più grandi rendimenti del raccolto della membrana, e di proteina purificata in definitiva più grande. - Inducono l'espressione aggiungere 125 mL di 5 supporti x YP completati con 10% galattosio per una concentrazione finale di induzione di 2% galattosio. Agitare a 190 giri/min a 30 ° C per 16 h.
- Cellule di raccolto di filatura a 4.000 x g per 15 min. Risospendere le cellule in 100 mL di acqua fredda.
Nota: A questo punto le cellule possono essere congelate a-80 ° C a tempo indeterminato, o la preparazione può durare per tutta la lisi delle cellule e la membrana raccolta. Raccogliamo in genere 40-45 g di cellule.
3. raccolta delle membrane di lievito
- Aggiungere la risospensione delle cellule 11,25 mL di 1M Tris pH 7.0, 0,45 mL di EDTA 0.5 M e 2,25 mL di 100 mM PMSF, quest'ultimo due dei quali fungono da inibitori della proteasi. Aggiungere acqua fino ad un volume finale di 225 mL, che si traduce in un tampone di risospensione delle cellule di 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA e 1 mM PMSF.
Nota: Se utilizzando congelati cellule consentono alle cellule di scongelare completamente, circa 1 ora a temperatura ambiente, perché se rimangono parzialmente congelati, essi resisteranno Lisi tramite la battitura del tallone. - Aggiungere la risospensione delle cellule in un contenitore di metallo 450ml per bead battendo. Completano il volume residuo con perle di vetro freddo 0,5 mm.
- Montare una camera perlina-battendo con il rotore e immergere in un bagno di ghiaccio. Eseguire sei impulsi di 1 min, separati da periodi di riposo di 2 min per evitare il surriscaldamento del lisato.
- Assemblare un apparato di filtrazione sotto vuoto utilizzando una plastica usa e getta bottiglia superiore filtro avvitato in una bottiglia di vetro. Rimuovere la membrana di filtrazione, perché il dispositivo di plastica rimanente può catturare le perline consentendo lisato di passare. Separare le perle dal lisato versando il contenuto della camera di pestaggio del tallone sul gruppo durante l'applicazione del vuoto.
- Lavare la camera di pestaggio perlina con 225 mL di un tampone di lavaggio contenente 50 mM Tris-HCl pH 7.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1,4 M di NaCl e 20% glicerolo di 2x. Svuotare il contenuto della camera sulle perline per lavarli.
Nota: Il lavaggio dà un volume finale di cellule ~ 450 mL lisati e significativamente aumenta raccolto membrana produce. Le concentrazioni finali sono 50 mM Tris-HCl pH 7.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10% glicerolo e 700 mM NaCl, e lo scopo primario di elevare la concentrazione di sale è quello di aiutare a dissociare le proteine di membrana periferici. - Rotazione verso il basso la cella lysata per 15 min a 15.000 x g. Versare il supernatante in bottiglie in policarbonato e spin per 1 h a 135.000 x g in un'ultracentrifuga per raccogliere le membrane.
Nota: Se non è disponibile un'ultracentrifuga, membrane possono essere raccolti da spinning per 3 h a 53.000 x g, una forza che è realizzabile in centrifughe di modello di piano. - Scartare il surnatante e pesare le bottiglie con le palline di membrana. Risospendere il pellet di membrana in circa 35 mL membrana tampone di risospensione contenente 50 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl e 10% glicerolo e aggiungere un douncer di vetro. Pesare le provette da centrifuga vuoto per determinare la massa delle membrane raccolte.
Nota: In un raccolto di membrana efficiente, il peso delle membrane sarà pari a circa il 20% il peso delle cellule utilizzato per tale raccolto di membrana. Questo protocollo dà rendimenti tipici delle cellule di 40-45 g, e quindi ci aspettiamo similarmente una resa delle membrane di 8-9 g. - Lisata omogeneizzare le membrane e aliquota in provette coniche da 50 mL che ora possono essere conservate a tempo indeterminato a-80 ° C.
Nota: Per questo esperimento, in genere due aliquote sono fatte, per consentire due purificazioni di proteina separato essere eseguita da una originale preparazione delle cellule.
4. solubilizzazione e purificazione della proteina
- In un recipiente aggiungere un ancoretta e 150 mg di n-dodecil-β-D-Maltopyranoside (DDM) a membrana g utilizzata. Tenere proteina sul ghiaccio o a 4 ° C in ogni momento.
Nota: DDM è igroscopico e deve essere conservato in un barattolo di vetro con essiccante a-20 ° C quando non in uso. Inoltre, è tipico da utilizzare tra 4-5 g di membrane in una purificazione per ottenere una quantità apprezzabile di proteina pura. - Scongelare le membrane e portare ad un volume finale di 15 mL / g membrana in tampone di risospensione di membrana completati con 1 mM PMSF e 20 mM imidazolo pH 8.0. Aggiungere il becher con DDM membrane e mescolare per 1 h a 4 ° C.
Nota: La concentrazione di DDM sarà 1% w/v, ma per la solubilizzazione delle proteine di membrana che è più importante essere consapevoli della massa del detergente aggiunto a membrana g. - Spin per 25 min a 135.000 x g a 4 ° C a pellet materiale non solubilizzato. Filtrare il surnatante attraverso un filtro per siringa 5 µm.
- Carico il campione dalla pompa peristaltica impostato con una portata di 1 mL/min su una colonna di affinità immobilizzata nichel 1ml equilibrato in 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, 10% glicerolo, 20 mM imidazolo pH 8.0 e 0.05% DDM.
Nota: Per le proteine che esprimono inferiore, rendimenti e purezza migliorata sono stati osservati utilizzando un 1 mL invece di 5ml colonna e nichel invece gli ioni cobalto per cromatografia di affinità. - Lavare la colonna con 10 volumi di colonna di un tampone di lavaggio contenente 20 mM Tris-HCl pH 7.0, 500 mM NaCl, 10% glicerolo, 80 mM imidazolo pH 8.0 e 0.05% DDM.
Nota: La concentrazione di imidazolo che può essere utilizzata durante i lavaggi per una proteina 10-His-tag è superiore a quella comunemente è apprezzato e si traduce in una migliore purezza. - Eluire la proteina nel buffer contenente 20 mM Tris-HCl pH 7.0, 200 mM NaCl, 10% glicerolo, 300 mM imidazolo pH 8.0 e 0.05% DDM. Raccogliere l'eluato in dieci frazioni di 1 mL e correre su un gel di Tris-glicina SDS-PAGE 4-20% insieme a frazioni di lisato e lavare solubilizzate.
- Frazioni di picco di piscina, di solito circa 5-6 mL e concentrato a 500 µ l o meno volume in un concentratore di cut-off di 50 kDa in una centrifuga da banco refrigerato a 4 ° C.
Nota: 500 µ l è un tipico massimo volume iniettato in colonne cromatografiche (SEC) di dimensioni esclusione. A questo punto la proteina possono essere conservati a tempo indeterminato a-80 ° C oppure continuare sulla SEC. - La proteina di filtrare attraverso un filtro di colonna spin 0,2 µm e iniettare su una colonna esclusione dimensioni (ad es., Superdex-200) equilibrata in tampone S200: 20mm Mes pH 6.5, NaCl 100 mM, 2% glicerolo e 0,03% DDM.
Nota: Per la glutaraldeide successive analisi di cross-linking, agente tampone non deve contenere un'ammina primaria. SEC è un'occasione di scambio buffer se necessario, come fatto qui durante lo scambio di Tris per Mes. - Eseguire che le frazioni di picco su una 4-20% Tris-glicina SDS-PAGE gel. Macchiare il gel, raccogliere le frazioni picco puro e concentrato in un concentratore di 50 kDa-taglio a 4 ° C.
- Determinare la concentrazione di proteina misurando l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 280 nm e a tempo indeterminato a-80 ° C.
5. glutaraldeide cross-linking Assay
- Preparare una reazione µ l 10 con 3 µ l di proteina di 0,5 mg/mL in tampone S200, 5 µ l di tampone di S200, 1 µ l di acqua o 20% sodio dodecil solfato (SDS), seguita da 1 µ l di 1,5% glutaraldeide.
Nota: Questo vi darà una reazione di 1 x di glutaraldeide proteina e 0,15% 0,15 mg/mL. Campioni contenenti un pre-trattamento di SDS sono importanti controlli negativi e dovrebbero essere misto e incubati a temperatura ambiente per 5 minuti prima di aggiungere la glutaraldeide. - Incubare la reazione a temperatura ambiente per 30 minuti. Terminare la reazione aggiungendo 5 µ l di colorante, che contiene un eccesso di tampone Tris che estigue la glutaraldeide di caricamento del gel di SDS-PAGE: 3x.
- Caricare tutti i 15 µ l in gel di Tris-glicina SDS-PAGE 4-20%, che caricherà 1,5 µ g di proteine per corsia. Esegua il gel a 200 V per 30 min. macchia e determinare l'entità del dimero cross-linking da prove di una band che viene eseguito al doppio della dimensione del monomero denaturato.
Nota: Una titolazione di glutaraldeide e il corso di tempo può essere eseguite in primo luogo per trovare le migliori condizioni per un trasportatore homomeric.
Representative Results
Tipico gel per le frazioni eluite dalla esecuzione di cromatografia di affinità di nichel mostrano tutte le tre proteine parzialmente purificate (Figura 1A). A destra della scala è il lisato, che in ogni caso non mostra una significativa fascia corrispondente al trasportatore borato che è tipico per le proteine che non iperesprimono bene. La corsia di lavaggio 80mm Mostra una perdita minima di proteina 10-His-Tag nonostante la concentrazione relativamente alta di imidazolo. Bande corrispondenti ai trasportatori borato sono prontamente apparenti nelle frazioni eluite e frazioni ritenute per contenere la maggior parte delle proteine eluite sono concentrate prima di iniettare sulla colonna di filtrazione gel S200. In questa fase, le proteine sono sufficientemente purificate per molte applicazioni a valle, come indicato da bande supplementare del campione concentrato prima dell'iniezione sulla colonna S200 (Figura 1B). Tuttavia, iniettando il campione sulla colonna di esclusione di dimensione rivela le frazioni eluite di elevata purezza (Figura 1B-C). Cromatogrammi e loro gel corrispondente per ciascuno dei trasportatori borato sono presentati. Nonostante la purezza moderata dei campioni all'eluizione da cromatografia di affinità, la proteina è altamente pura all'eluizione dalla colonna di gel filtrazione. Criticamente, i cromatogrammi rivelano ogni proteina migrare principalmente come picco singolo monodispersi con proteine mantenute nel volume vuoto. Una proteina stabile e piegata dà generalmente un monodisperse e picco simmetrico, mentre proteine instabili, misfolded o aggregate darà generalmente picchi multipli asimmetriche o un grande picco nel volume sub. È tipico per ottenere una resa finale di circa 2 mg purificato di proteina per L di coltura di lievito per ScBor1 e circa 1 mg ciascuna di purificato AtBor1 e OsBor3 per la cultura L. Questi numeri sono la quantità di proteina purificata da un'aliquota di 4-5 g di membrane, che proviene da una metà della nostra preparazione cella originale.
Il cross-linking esperimento mostra che i trasportatori homomeric purificata possono avere loro assemblaggio in soluzione prontamente valutati (Figura 2). Lo scopo dei campioni contenenti un pre-trattamento di SDS è di mostrare che il cross-linking è dipendente da un ripiegamento in soluzione e che cross-linking di conseguenza non si verifica quando multimerization viene interrotto da un detergente duro. I risultati mostrati distinguono che uno dei tre trasportatori borato, ScBor1, non è dimerized quando purificati in DDM in queste condizioni, mentre gli altri due, AtBor1 e OsBor3, cross-link e visualizza la dimerizzazione. È possibile vedere che non tutte le proteine possono cross-link. In questo esempio, tracce di OsBor3 monomero sono visibili, mentre AtBor1 legami incrociati fino al completamento. La misura del cross-linking dipenderà il numero di residui di lisina in vicinanza l'uno a altro, ed è possibile che altri reagenti di cross-linking possono in modo efficiente legame incrociato di proteine di membrana diversi.
Figura 1 . Affinità e dimensione purificazione di cromatografia di esclusione per tre trasportatori di borato di nichel. Ogni pannello verticale (A), (B), e (C) contiene i dati per ScBor1, AtBor1 e OsBor3. (A) colonna di affinità di nichel. M è una scaletta di marker di peso molecolare con i pesi in kDa specificato a sinistra. L è il greggio lisato, e W è il lavaggio di imidazolo di 80 mM. Tutte le altre corsie numerate corrispondono a frazioni di 1 mL eluite con imidazolo di 300 mM. Barre sopra le frazioni indicano che sono stati selezionati per essere combinati e concentrato per iniezioni sulla colonna. (B) P indica proteine concentrate prima dell'iniezione sulla colonna di S200. Le frazioni eluite di SEC sono a destra, con staffe utilizzati per la corrispondenza gel corsie con loro frazioni di cromatogramma in (C). Il volume vuoto è solo dopo 8 mL. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Cross-linking test valuta purificati trasportatori per assembly multimerici. Una scala con i pesi molecolari è indicata sulla sinistra. Soprattutto altre corsie è dimostrato che la proteina è presente e se il campione ha avuto glutaraldeide aggiunto o un pre-trattamento di SDS prima dell'aggiunta di glutaraldeide. Le frecce indicano le posizioni del monomero e dimero per AtBor1 e OsBor3. ScBor1 è una proteina più piccola rispetto a AtBor1 e OsBor3 e viene eseguito come previsto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Qui abbiamo condiviso protocolli dettagliati che si traducono nella purificazione per omogeneità di tre trasportatori di borato eucariotici distinti. I protocolli presentati qui sono derivati da altri protocolli per l'espressione di proteine integrali di membrana in S. cerevisiae1,14e il nostro risultato di ottimizzazioni a purezza migliorata e rendimenti migliori. I parametri ottimizzati qui includono volumi di crescita di coltura delle cellule e volte, picchia la perlina Lisi procedure, composizione del buffer durante la lisi cellulare e purificazione della proteina, quantità di detersivo utilizzato per ogni grammo della membrana, ioni metallici identificare nella purificazione di affinità, volume della colonna di affinità e l'implementazione di un'analisi cross-linking per valutare l'idoneità dell'omologo e detergente valutando lo stato di multimerici dei trasportatori oligomerici. I protocolli sono riusciti per più SLC4 omologhi dalla pianta e specie fungine. Una limitazione di tutte le strategie per la purificazione delle proteine integrali di membrana è che non esiste alcun metodo di purificazione di proteine membrana universale che è garantito per funzionare. È possibile che i nostri protocolli sono più probabili essere successo per proteine più vicino nell'identità di sequenza e struttura ai trasportatori di SLC4 e così i membri delle famiglie SLC4, SLC23 e SLC26 potrebbero essere promettente destinato a15. Allo stesso modo, il più evolutivamente distanti dai trasportatori di borato un trasportatore di membrana potrebbe essere, più è probabile che il protocollo dovrà essere diverso, come ad esempio variando il sistema di espressione, detergente o altri parametri chiave4.
Il protocollo si avvale del tag affinità più comunemente usati nella purificazione della proteina, il suo cartellino. Nonostante la presenza di impurità nelle frazioni eluite iniziale, le combinazioni di nichel affinità, vasto lavaggio e purificazione successiva SEC provoca la proteina altamente purificata. Un 10-His-tag permette le più rigorosa imidazolo lava e quindi può rimuovere più proteine leganti di sfondo che può essere rimosso in lavaggi consentiti da 8-His - o 6-His-tag. Le nostre selezioni per frazioni pure sbagliare sul lato conservatore delle frazioni più altamente puro gel, che corrispondono a delle frazioni di SEC di picco. Finale di proteine rendimenti possono essere aumentati di pooling e concentrando più frazioni, seppur con il trade-off di proteina leggermente meno pura. I metodi presentati qui abilitato la purificazione di AtBor1 in quantità che hanno portato alla determinazione della sua struttura di cristallo7, con differenze di depurazione composto da tagliare il His-tag e lo scambio del trasportatore in un diverso detergente per migliorare cristallo diffrazione7.
Il nostro protocollo solleva importanti considerazioni per la selezione di omologhi e il detersivo usato per solubilizzare e purificarle. DDM è una comune prima scelta per il detersivo perché è relativamente mite, spesso successo presso solubilizzanti ed è stato utilizzato negli studi strutturali e funzionali di un'ampia varietà di proteine di membrana. Nel determinare se un detersivo è una scarsa scelta per una membrana, un metodo comune di valutazione è se la proteina dà un picco singolo monodispersi su un cromatogramma SEC, piuttosto che un grande picco in volume vuoto o un intervallo di polidispersi picchi, che indicare proteine misfolded o instabile. Una considerazione più sottile viene generata dalla nostra purificazione di ScBor1. Purifica in grandi quantità e sguardi favorevole e monodisperse su un cromatogramma SEC, che suggerisce che potrebbe essere un obiettivo attraente per studi strutturali. Tuttavia, la nostra analisi cross-linking rivela che è un monomero quando purificato. Mentre è possibile che ScBor1 potrebbe esistere in modo nativo come monomero nella cella, gli studi indicano che i trasportatori SLC4 e loro omologhi sono suscettibili di essere dimeri7,8,9,10. Nostro sviluppo del cross-linking dosaggio si è verificato dopo la cristallizzazione e risolvere la struttura del AtBor1. Tuttavia, siamo stati in grado di valutare ScBor1 rispetto a AtBor1 con il dosaggio di cross-linking, gli sforzi di ricerca e tempo preziosi potrebbero sono stati reindirizzati al perseguimento di AtBor1 invece di ScBor1, l'ultimo dei quali, in definitiva, non riusciva a esperimenti di cristallizzazione e di diffrazione. Questo test può così aiutare i ricercatori a distinguere tra omologhi o detergenti da utilizzare per perseguire gli studi strutturali al fine di assegnare priorità alle condizioni in cui la proteina mantiene la sua conformazione nativa sospetta. Inoltre, l'analisi può essere usata per sondare quali aminoacidi sono critici per multimerization, al fine di trovare le sostituzioni dell'amminoacido che destabilizzano l'interfaccia multimerization e piombo per obbligare i monomeri. Tale approccio è stato utilizzato per sondare il significato funzionale dell'Assemblea homomeric in membrana trasportatori16,17,18.
Un vantaggio generale del nostro metodo è che il lievito è stato indicato per attivare l'espressione di molte proteine di membrana impegnativo di funzione diversi1. Inoltre, il suoi basso costo e crescita volte promuovono sua accessibilità per molti sforzi di ricerca che può essere meno in grado di utilizzare strategie di espressione che richiedono coltura tissutale o costoso crescita media. Le procedure presentate qui sono relativamente poco costosa e possono essere eseguite in una settimana che sottolinea la fattibilità dell'approccio. L'implementazione di questi protocolli consentono di attivare studi strutturali e funzionali di altre proteine di membrana impegnativo.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dai fondi di avvio al Davidson College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES) | Acros | 172591000 | |
| Äkta Pure 25 L FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC905024 | for concentrating nickel column fractions |
| Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC805024 | for concentrating S200 fractions |
| Bacto Peptone | BD Diagnostics | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD Diagnostics | 288620 | |
| Glass Erlenmeyer flask, 2L | Sigma-Aldrich | CLS44442L | |
| Benchtop centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Bottle top filter | Nalgene | 595-4520 | the membrane is removed and used to filter glass beads |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Complete supplement mixture without histidine | Sunrise Science | 1006-100 | |
| D-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
| Ethanol, 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| Gel tank SDS-PAGE system | Bio-Rad | 1658004 | |
| Glass bead-beating cell disruptor | BioSpec | 1107900 | |
| Glass beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105 | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | sent as an 8% solution under nitrogen |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| HiTrap IMAC FF column, 1 mL | GE Healthcare | 17-0921-02 | charged with nickel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imidazole | Acros | 12202 | |
| Instant Blue gel stain | Expedeon | ISB1L | |
| JA-10 rotor | Beckman | 369687 | |
| JA-14 rotor | Beckman | 339247 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Thermo Scientific | 3451 | |
| Microcentrifuge, refrigerated | Fisher | 13-100-676 | |
| Mini-Protean Tris-glycine gels, 4-20% | Bio-Rad | 456-1096 | |
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | F155005 | used for loading lysate onto affinity column |
| n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM) | Inalco | 1758-1350 | |
| Nickel(II) Sulfate Hexahydrate | Sigma-Aldrich | 227676 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick | C24 | |
| p423 GAL1 plasmid with borate transporter insert | available from authors | ||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Acros | 215740050 | |
| Polycarbonate ultracentrifuge tubes | Beckman | 355618 | |
| Polypropylene bottles, 250mL | Beckman | 356011 | |
| Polypropylene bottles, 500mL | Beckman | 355607 | |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | Bio-Rad | 1610375 | |
| S. cerevisiae expression strain DSY-5 | available from authors | ||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Spin column with 0.2 µm filter, 0.5mL | Millipore | UFC30GV0S | for filtering protein before injecting onto S200 column |
| Sterile Falcon tubes, 15mL | Lab Depot | TLD431696 | |
| Sterile Falcon tubes, 50mL | Lab Depot | TLD431698 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | used for SEC purification |
| Syringe filter, 5µm | Pall | 4650 | for filtering lysate before loading affinity column |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman | 337922 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-70M | |
| YNB+Nitrogen without amino acids | Sunrise Science | 1501-500 |
References
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Andréll, J., Tate, C. G. Overexpression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Molecular Membrane Biology. 30 (1), 52-63 (2013).
- Lyons, J. A., Shahsavar, A., Paulsen, P. A., Pedersen, B. P., Nissen, P. Expression strategies for structural studies of eukaryotic membrane proteins. Current Opinion in Structural Biology. 38, 137-144 (2016).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).
- Thurtle-Schmidt, B. H., Stroud, R. M. Structure of Bor1 supports an elevator transport mechanism for SLC4 anion exchangers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10542-10546 (2016).
- Coudray, N., et al. Structure of the SLC4 transporter Bor1p in an inward-facing conformation. Protein Science. 26 (1), 130-145 (2016).
- Arakawa, T., et al. Crystal structure of the anion exchanger domain of human erythrocyte band 3. Science. 350 (6261), 680-684 (2015).
- Huynh, K. W., et al. CryoEM structure of the human SLC4A4 sodium-coupled acid-base transporter NBCe1. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Zhao, R., Reithmeier, R. A. Expression and characterization of the anion transporter homologue YNL275w in Saccharomyces cerevisiae. American Journal of Physiology Cell Physiology. 281 (1), 33-45 (2001).
- Takano, J., et al. Arabidopsis boron transporter for xylem loading. Nature. 420, 337-340 (2002).
- Nakagawa, Y., et al. Cell-type specificity of the expression of Os BOR1, a rice efflux boron transporter gene, is regulated in response to boron availability for efficient boron uptake and xylem loading. Plant Cell. 19 (8), 2624-2635 (2007).
- Hays, F. A., Roe-Zurz, Z., Stroud, R. M. Overexpression and purification of integral membrane proteins in yeast. Methods in Enzymology. 470, Issue C (2010).
- Chang, Y. -N., Geertsma, E. R. The novel class of seven transmembrane segment inverted repeat carriers. Biological Chemistry. 398 (2), 165-174 (2017).
- Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Design, function and structure of a monomeric ClC transporter. Nature. 468 (7325), 844-847 (2010).
- Last, N. B., Miller, C. Functional Monomerization of a ClC-Type Fluoride Transporter. Journal of Molecular Biology. 427 (22), 3607-3612 (2015).
- Yu, X., et al. Dimeric structure of the uracil:proton symporter UraA provides mechanistic insights into the SLC4/23/26 transporters. Cell Research. 27 (8), 1020-1033 (2017).
