Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para expressar, solubilizar e purificar vários transportadores de borato eucarióticas com homologia à família de transportador de SLC4 usando o fermento. Também descrevemos um ensaio químico do cross-linking para avaliar as proteínas homomeric purificado para assembly multiméricas. Esses protocolos podem ser adaptados para outras proteínas de membrana desafiador.
Abstract
A família de soluto transportadora 4 (SLC4) de proteínas é chamada os transportadores de bicarbonato e inclui a proteína arquetípica da 1 trocador de ânion (AE1, também conhecido como banda 3), a proteína de membrana mais abundante em células vermelhas do sangue. A família SLC4 é homóloga com transportadores de borato, que foram caracterizados em plantas e fungos. Continua a ser um desafio técnico significativo para expressar e purificar as proteínas de transporte de membrana de homogeneidade em quantidades adequadas para estudos estruturais ou funcionais. Aqui descrevemos os procedimentos detalhados para a superexpressão de transportadores de borato em Saccharomyces cerevisiae, isolamento das membranas de levedura, solubilização de proteína por detergente e purificação de homologs do transportador borato de S. cerevisiae, Arabidopsis thalianae Oryza sativa. Também detalhamos um experimento para ensaio de multimerization de homomeric transportadores do cross-linking de glutaraldeído. Nossos procedimentos generalizados podem ser aplicados a todas as três proteínas e foram otimizados para eficácia. Muitas das estratégias desenvolvidas aqui podem ser utilizadas para o estudo de outras proteínas de membrana desafiador.
Introduction
A dificuldade em obter quantidades suficientes de proteína purificada membrana permanece um gargalo fundamental na prossecução de estudos estruturais e funcionais de receptores, canais iônicos e transportadores. Muitos protocolos existem para gasodutos moderadamente alto throughput para tela e encontrar proteínas de membrana de candidato que expressam bem o suficiente para permitir a posterior em vitro estudos1,2,3,4 . Normalmente, as proteínas são marcadas com uma proteína de N - ou C-terminal verde fluorescente (GFP) e níveis de expressão são monitorados por fluorescência em-gel ou por fluorescência-deteção tamanho exclusão cromatografia (FSEC)5. Essas abordagens permitem a separação dos candidatos de proteína de membrana em altas expressando proteínas, moderadas ou baixas expressando proteínas, ou proteínas que expressam mal ou não em todos. Esta abordagem funciona bem quando o delineamento experimental é para investigar um grande número de genes candidatos com a intenção de selecionar qualquer proteína expressa o melhor. No entanto, em alguns casos, uma abordagem experimental baseia-se em estudar uma proteína de membrana, que pode ser um desafio quando os níveis de expressão da proteína que estão na faixa moderada ou baixa. Além disso, às vezes nestes casos, os níveis de expressão podem ser apenas minimamente aumentados alterando a construção via truncamentos, mutações thermostabilizing ou otimização de códon. É, portanto, às vezes necessárias para otimizar a membrana protocolos da proteína expressão e purificação de proteínas de membrana que expressam apenas moderadamente bem.
A família de SLC4 de transportadores inclui o transporte de bicarbonato 1 de trocador de ânion (também conhecido como banda 3), a proteína de membrana mais abundante em células vermelhas do sangue6e um motor essencial da respiração celular. A família SLC4 é homóloga com transportadores de borato, que são fundamentais para as plantas e foram mostrados para exibir uma estrutura semelhante ao ânion trocador de 1 bem como sódio acoplados SLC4 transportadores7,8,9 ,10. Aqui nós relatamos protocolos de expressão e purificação de proteína otimizado usando S. cerevisiae para purificar três transportadores de borato diferentes encontrados em plantas e leveduras. Destaca-se em detalhe as etapas-chave que levamos para otimizar o rendimento e a eficiência das purificações de homogeneidade. Além disso, nós relatamos um ensaio do cross-linking químico usando glutaraldeído para monitorar na Assembleia multiméricas estes transportadores no contexto de um complexo proteína-detergente-lipídico purificado. A experiência do cross-linking pode ajudar a avaliar a adequação do homólogo e detergente, avaliando o estado multiméricas de transportadores oligoméricos depois da purificação.
Este protocolo assume que o transportador desejado foi clonado em um plasmídeo 2 µ derivado sob controlo inducible do promotor GAL1 para expressão em S. cerevisiae. Para esses procedimentos, DNA foi utilizada a codificação transportadores completos borato do selvagem-tipo Bor1 de Saccharomyces cerevisiae (ScBor1)11, Bor1 de Arabidopsis thaliana (AtBor1)12e Oryza sativa Bor3 (OsBor3)13 . O C-terminal em cada construção é anexado com um 10-His-tag e um local de clivagem de trombina inserido entre o transportador e o 10-His-tag para permitir a sua remoção, se desejado. O protocolo também assumirá que o plasmídeo já foi transformado a DSY-5 expressão cepa de S. cerevisiae em meios selectivos suplementares completas (CSM) falta de histidina.
Protocol
1. preparação de mídia e importantes buffers
- Prepare 500 mL de galactose 40% adicionando-se 200 g de água desionizada e galactose para um volume total de 500 mL. Use uma placa quente ou microondas para aumentar a taxa de galactose entrar em solução. Filtro estéril com um aparelho de filtração de vácuo consiste em um filtro de 0,2 µm top ligado a um frasco de vidro estéril.
Nota: Todas as soluções de mídia são preparadas com água desionizada. - Prepare 500 mL de glicose 40% adicionando-se 200 g de glicose e água para um volume total de 500 mL. Autoclave para esterilizar.
- Em cada um dos quatro frascos 2L, adicione 0,4 g de mistura completa suplemento sem histidina (CSM-His), 3,35 g fermento nitrogênio base com sulfato de amônio (YNB + nitrogênio) e 475 mL de água. Autoclave. Adicione 25 mL de 40% de glicose para obter uma concentração final de glicose 2%.
- Adicionar, para um frasco de vidro, peptona de 50 g e 25 g de extrato de levedura e de 375 mL de água. Autoclave. Adicione 125 mL de galactose 40% dar 5 x solução de levedura peptona (YP) contendo 10% de galactose.
- Adicionar, para um balão de 250 mL, 0,04 g CSM-His, g 0,335 YNB + nitrogênio e água a 47,5 mL. Autoclave. Adicionar 2,5 mL de 40% de glicose para obter 50 mL do CSM-sua YNB + 2% de glicose.
- Prepare 1 L de 1M Tris pH 7.0 misturando 121,14 g de Tris base com 800 mL de água. Adicione ácido clorídrico concentrado até pH 7,0. Adicionar água até um volume final de 1 L e passar por um filtro de 0,2 µm.
- Prepare 500 mL de 0,5 M pH de ácido (EDTA) etilenodiaminotetracético 8.0 misturando 73,06 g de EDTA com 400 mL de água. Adicione hidróxido de sódio até dissolver o EDTA e o pH atinge 8.0. Adicionar água até um volume final de 500 mL e passar por um filtro de 0,2 µm.
- Prepare 100 mL de fluoreto de phenylmethanesulfonyl de 100 mM (PMSF) misturando 1,74 g de PMSF com etanol prova 200. Loja a-20 ° C.
- Prepare a 225 mL de tampão de lavagem do grânulo, consistindo de pH 7.0 do Tris de 50 milímetros 1,4 M NaCl, glicerol 20% e pH de 1 mM EDTA 8.0 de 2x.
- Prepare 100 mL do buffer de cromatografia de exclusão de tamanho (S200 tampão) consistindo de 20 mM 4-Morpholinoethanesulfonic ácido hidratado (MES) pH 6,5, 100 mM NaCl, 2% de glicerol e 0,03% n-dodecil-beta-D-Maltopyranoside (DDM).
- Prepare 100 mL de tampão de ressuspensão de membrana consistindo de 50 mM Tris pH 7.0, 500 mM de NaCl e 10% de glicerol.
- Prepare-se 10 mL de uma tintura do carregamento SDS-PAGE de 3x misturando 3 mL 20% Dodecil sulfato de sódio (SDS), glicerol 3 mL, 2,4 mL 1M Tris pH 6,8, 0,03 g de azul de bromofenol e 1,6 mL 2-Mercaptoetanol.
2. a superexpressão do transportador de borato em S. cerevisiae
- Inocular três colônias de fermento transformado em 50 mL de CSM-His + YNB + 2% de glicose media e agitar durante a noite a 190 rpm a 30 ° C.
- No dia seguinte usar um espectrofotômetro para determinar a densidade óptica em um comprimento de onda de 600 nm (OD600) e inocular a uma OD600 de 0,01 cada de quatro frascos de 2 L, que cada um contém 500 mL do CSM-sua mídia de glicose 2% + YNB.
- Agite a 190 rpm a 30 ° C para 30 h permitir que as células consumir todos glicose e crescer para um high-density.
Nota: Um tempo de crescimento resulta em maior célula produz, maiores rendimentos colhidos da membrana, e, finalmente, a maior proteína purificada produz. - Induzi a expressão adicionando 125ml de 5 x YP mídia, suplementado com 10% de galactose para uma concentração final de indução de galactose de 2%. Agite a 190 rpm a 30 ° C, durante 16 h.
- Colheita de células por fiação a 4.000 x g durante 15 min. Ressuspender as células em 100 mL de água fria.
Nota: neste ponto as células podem ser congeladas a-80 ° C indefinidamente ou continua a preparação para lise celular e a membrana da colheita. Nós colhemos normalmente 40-45 g de células.
3. a colheita das membranas de levedura
- Adicione a ressuspensão de célula 11,25 mL de 1M Tris pH 7.0, 0,45 mL de EDTA 0,5 M e 2,25 mL de 100 mM PMSF, este último, dois dos quais atuam como inibidores de protease. Adicione água até um volume final de 225 mL, o que resulta em um buffer de ressuspensão de célula de 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA e 1 mM PMSF.
Nota: Se usar congelados células permitem que células descongelar completamente, cerca de 1h à temperatura ambiente, porque se eles permanecem parcialmente congelados, eles resistirão lise pelo espancamento do grânulo. - Adicione a ressuspensão de célula em uma vasilha de metal 450 mL para grânulo batendo. Acima do volume restante com contas de vidro frio 0,5 mm.
- Montar uma câmara do grânulo batendo com o rotor e mergulhe em um banho de gelo. Realize seis pulsos de 1 min, separados por períodos de repouso de 2 min para evitar o superaquecimento do lisado.
- Monte um aparelho de filtração de vácuo usando um plástico garrafa descartável filtro superior parafusado dentro de uma garrafa de vidro. Remova a membrana de filtração, porque o dispositivo de plástico restante pode capturar os grânulos permitindo lisado para passar. Separe as contas o lisado derramando o conteúdo da câmara de espancamento do grânulo em assembleia durante a aplicação do vácuo.
- Lave a câmara de espancamento do grânulo com 225 mL de um tampão de lavagem que contém 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA, 1mm PMSF, 1.4 M NaCl e 20% de glicerol de 2x. Esvazie o conteúdo da câmara sobre as contas de lavá-las.
Nota: A lavagem dá um volume final de células ~ 450 mL lysed e significativamente produz aumentos membrana colhidos. As concentrações finais são 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA, 1mm PMSF, 10% de glicerol e 700 mM de NaCl, e o objetivo principal de elevar a concentração de sal é ajudar se dissociam proteínas periféricas da membrana. - Spin para baixo a célula lisada por 15 min a 15.000 x g. Despeje o líquido sobrenadante garrafões de policarbonato e rotação por 1h a 135.000 x g em um se coletar membranas.
Nota: Se um se não estiver disponível, as membranas podem ser recolhidas por fiação para 3h a 53.000 x g, uma força que é realizável em centrífugas de andar modelo. - Desprezar o sobrenadante e pesar as garrafas com as pelotas de membrana. Resuspenda as pelotas de membrana em aproximadamente 35 mL membrana ressuspensão tampão contendo Tris pH 7.0, 500 mM de NaCl e 10% glicerol de 50mm e adicionar a um douncer de vidro. Pese os tubos de centrífuga vazio para determinar a massa das membranas colhidas.
Nota: Em uma colheita eficiente da membrana, o peso das membranas será igual a aproximadamente 20% do peso de células usado para essa colheita de membrana. Este protocolo dá rendimentos de célula típica de 40-45 g, e, assim, da mesma forma esperamos um rendimento de membranas de 8-9 g. - Homogenizacao homogeneizar as membranas e a alíquota para tubos de 50ml cónico que agora podem ser armazenados indefinidamente a-80 ° C.
Nota: Para este experimento, tipicamente duas alíquotas são feitas, para permitir que duas purificações de proteína separada ser executada a partir de uma preparação da pilha original.
4. solubilização e purificação de proteínas
- Para um copo de adicionar uma barra de agitação e 150 mg de n-dodecil-β-D-Maltopyranoside (DDM) por membrana g sendo usada. Manter as proteínas no gelo ou a 4 ° C em todos os momentos.
Nota: DDM é higroscópico e deve ser armazenado em um frasco de vidro com dessecante em-20 ° C, quando não estiver em uso. Além disso, é típico para usar entre 4-5 g de membranas em uma purificação para obter uma quantidade apreciável de proteína pura. - Descongelar as membranas e trazer até um volume final de 15 mL por membrana g no buffer de ressuspensão de membrana suplementado com 1mm PMSF e pH 8.0 do imidazole de 20 mM. Adicionar as membranas para o copo com DDM e agitar durante 1 h a 4 ° C.
Nota: A concentração de DDM será 1% p/v, mas para a solubilização de proteínas de membrana é mais crítico para estar ciente da massa de detergente adicionado por membrana de g. - Girar para 25 min a 135.000 x g a 4 ° C, de material não-solubilizado de Pelotas. Filtre o sobrenadante através de um filtro de seringa de 5 µm.
- A amostra pela bomba peristáltica definida como uma taxa de fluxo de 1 mL/min para uma coluna de afinidade de níquel imobilizado 1ml de carga equilibrada em 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM de NaCl, 10% de glicerol, pH 8.0 do imidazole de 20 mM e 0,05% DDM.
Nota: Para baixas expressando proteínas, rendimento e pureza melhorada foram observado usando um 1 mL em vez de coluna de 5 mL e níquel em vez de íons de cobalto para cromatografia de afinidade. - Lavar a coluna com 10 volumes de coluna de um tampão de lavagem, contendo 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM de NaCl, 10% de glicerol, pH 8.0 do imidazole de 80 mM e 0,05% DDM.
Nota: A concentração de imidazol que pode ser usada durante as lavagens para uma proteína de 10-sua-Tag é maior do que comumente é apreciada e resulta em maior pureza. - Eluir a proteína no buffer contendo 20 mM Tris pH 7.0, 200 mM NaCl, 10% de glicerol, pH 8.0 do imidazole de 300mm e 0,05% DDM. Recolher o eluato em dez frações de 1 mL e executar em um gel de SDS-PAGE de Tris-glicina 4-20% juntamente com frações de lisado e lave solubilizados.
- Fracções de pico de piscina, geralmente aproximadamente 5-6 mL e concentrado a 500 µ l ou menos volume em um concentrador de corte de 50 kDa em uma centrífuga de bancada refrigerada a 4 ° C.
Nota: 500 µ l é um típico volume máximo injetado em colunas de cromatografia (SEC) de exclusão de tamanho. Neste ponto, a proteína pode ser armazenado por tempo indeterminado a-80 ° C ou continue na SEC. - Filtrar a proteína através de um filtro de coluna de rotação de 0,2 µm e injetar em uma coluna de exclusão tamanho (por exemplo, Superdex-200) incubada no buffer S200: 20mm Mes pH 6,5, 100 mM de NaCl, 2% de glicerol e 0,03% DDM.
Nota: Para o glutaraldeído subsequente do cross-linking do ensaio, o agente tamponador não deve conter uma amina primária. S é uma oportunidade para troca de amortecedores, se necessário, como feito aqui quando trocando Tris por Mes. - Execute que as frações de pico em um 4-20% Tris-glicina SDS-PAGE do gel. Manchar o gel, coletar frações de pico puro e concentrar-se em um concentrador de kDa-corte 50 a 4 ° C.
- Determinar a concentração de proteína através da medição da absorvância no comprimento de onda de 280 nm e a loja indefinidamente a-80 ° C.
5. glutaraldeído cross-linking do ensaio
- Prepare uma reação de 10 µ l misturando 3 µ l de proteína de 0,5 mg/mL em buffer S200, 5 µ l de tampão S200, 1 µ l de água ou 20% sulfato dodecyl de sódio (SDS), seguido de 1 µ l de 1,5% de glutaraldeído.
Nota: Isto vai dar uma reação 1x de 0,15 mg/mL proteína e 0,15% de glutaraldeído. Amostras contendo um pré-tratamento da SDS são controles negativos importantes e devem ser misturadas e incubadas à temperatura ambiente por 5 min antes de adicionar o glutaraldeído. - Incube a reação por 30 min à temperatura ambiente. Terminar a reação adicionando 5µL de 3x do gel de SDS-PAGE carregando a tintura, que contém um excesso de tampão Tris que sacia o glutaraldeído.
- Carrega todos os 15 µ l em gel de SDS-PAGE de Tris-glicina 4-20%, que carregará a 1,5 µ g proteína por faixa. Funcione o gel a 200 V para 30 min. mancha e determinar a extensão do dímero do cross-linking pela evidência de uma banda que executa duas vezes o tamanho do monômero desnaturado.
Nota: Um curso de tempo e titulação de glutaraldeído podem ser a primeira para encontrar as melhores condições para um transporte de homomeric.
Representative Results
Géis típicos para as frações eluted da realização de cromatografia de afinidade de níquel mostram todas três proteínas parcialmente purificadas (Figura 1A). À direita da escada é o lisado, que em cada caso não mostra uma banda significativa correspondente para o transportador de borato que é típico para proteínas que não overexpress bem. Pista de lavagem 80mm mostra mínima perda de proteína 10-sua-com a tag apesar da concentração relativamente elevada de imidazol. Bandas correspondentes aos transportadores borato são aparentes em frações eluted e frações, considera-se que contêm a maior parte da proteína eluted concentram-se antes de injectar na coluna S200 gel filtração. Nesta fase, as proteínas são insuficientemente purificadas para muitas aplicações a jusante, como indicado por faixas extras na amostra concentrada antes de injectar na coluna S200 (Figura 1B). No entanto, injetando a amostra para a coluna de exclusão de tamanho revela eluted frações de alta pureza (Figura 1B-C). Cromatogramas e seus géis correspondentes para cada um dos transportadores de borato são apresentados. Apesar da pureza moderada das amostras com eluição de cromatografia de afinidade, a proteína é altamente pura em cima de eluição da coluna de filtração de gel. Criticamente, os cromatogramas revelaram cada proteína para migrar principalmente como um pico único monodisperso com pouca proteína retida no volume vazio. Uma proteína estável e dobrada geralmente dá um monodisperso e pico simétrico, enquanto a proteína instável, misfolded ou agregada geralmente dará vários picos assimétricos ou um grande pico no volume vazio. É típico para obter um rendimento final de aproximadamente 2 mg purificado proteína por L de cultura de levedura para ScBor1 e aproximadamente 1 mg cada de purificado AtBor1 e OsBor3 por cultura de L. Estes números são a quantidade de proteína purificada a partir de uma alíquota de 4-5 g de membranas, que se origina de uma metade da nossa preparação da pilha original.
A experiência do cross-linking mostra que os transportadores homomeric purificado podem ter seu assembly em solução prontamente avaliada (Figura 2). O propósito das amostras contendo um pré-tratamento da SDS é mostrar que o cross-linking é dependente de um estado dobrado em solução e que cross-linking, portanto, não ocorre quando multimerization é interrompida por um detergente áspero. Os resultados mostrados distinguem que dentre os três transportadores de borato, ScBor1, não é dimerized quando purificado no DDM nestas condições, enquanto os outros dois, AtBor1 e OsBor3, cross-link e mostram a dimerização. É possível ver que nem todas as proteínas podem cross-link. Neste exemplo, vestígios de monômero OsBor3 são visíveis, enquanto AtBor1 ligações cruzadas para conclusão. A extensão do cross-linking dependerá do número de resíduos de lisina na proximidade um do outro, e é possível que outros reagentes do cross-linking eficientemente podem cross-link proteínas de membrana diferentes.
Figura 1 . Afinidade e tamanho purificação de cromatografia de exclusão por três transportadores de borato de níquel. Cada painel vertical (A), (B), e (C) contém dados para ScBor1, AtBor1 e OsBor3. (A) coluna de afinidade de níquel. M é uma escada de marcadores de peso molecular com pesos em kDa especificado para a esquerda. L é o lisado de bruto, e W é a lavagem de imidazol 80 mM. Todas outras faixas numeradas correspondem às frações 1 mL eluídas com imidazol 300 milímetros. Barras acima frações indicam que foram selecionados para ser combinado e concentrado para injeções na coluna. P (B) indica proteína concentrada antes de injectar na coluna S200. Eluted frações de segundo são para a direita, com os suportes utilizados para coincidir com o gel de pistas com suas frações cromatograma em (C). O volume vazio é só depois de 8 mL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Cross-linking ensaio avalia purificados transportadores para assembly multiméricas. Uma escada com pesos moleculares é indicada à esquerda. Acima de tudo, outras pistas é mostrada qual proteína está presente e se a amostra teve glutaraldeído adicionado ou um pré-tratamento da SDS antes de adição de glutaraldeído. As setas indicam as posições de monômero e dímero para AtBor1 e OsBor3. ScBor1 é uma proteína menor do que AtBor1 e OsBor3 e é executado conforme o esperado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Aqui partilhamos protocolos detalhados que resultam na purificação de homogeneidade de três transportadores distintos borato eucarióticas. Os protocolos aqui apresentados são derivados de outros protocolos para a expressão de proteínas de membrana integrais em S. cerevisiae1,14e o nosso resultado de otimizações em pureza melhorada e melhor rendimento. Os parâmetros otimizados aqui incluem volumes de crescimento de cultura celular e vezes, procedimentos de lise do grânulo-surra, composição de tampão durante a lise celular e purificação de proteínas, a quantidade de detergente utilizado por grama da membrana, íon metálico identificar na purificação de afinidade, volume da coluna de afinidade e a implementação de um ensaio do cross-linking para avaliar a adequação do homólogo e detergente, avaliando o estado multiméricas de transportadores oligoméricos. Os protocolos são bem sucedidos para vários SLC4 homologs da planta e espécies de fungos. Uma limitação de todas as estratégias para a purificação de proteínas integrais da membrana é que não existe nenhum método de purificação de proteínas de membrana universal que é garantido que funcione. É possível que nossos protocolos são mais provável ser bem sucedido para proteínas mais perto na identidade de sequência e estrutura para os transportadores de SLC4 e, portanto, membros das famílias SLC4, SLC23 e SLC26 poderiam ser promissoras metas15. Da mesma forma, os transportadores de borato mais evolutivamente distantes um transportador de membrana pode ser, o mais provável o protocolo terá de ser diferentes, tais como, variando o sistema de expressão, detergente ou outros parâmetros-chave4.
O protocolo aproveita-se da marca de afinidade mais comumente usados na purificação de proteínas, a sua marca. Apesar da presença de impurezas nas fracções eluted iniciais, as combinações de afinidade de níquel, extensa lavagem e purificação subsequente SEC resulta na proteína altamente purificada. Um 10-His-tag permite a lava o imidazol mais rigorosa e, portanto, pode remover proteínas mais fundo do que pode ser removido em lavagens permitidas por 8-His - ou 6-His-tags. Nossas seleções para frações puras err no lado conservador da maioria das frações altamente puro gel, que correspondem a frações de segundo o pico. Rendimento final da proteína pode ser aumentado por pool e concentrando-se mais fracções, embora com a troca de um pouco menos pura proteína. Os métodos apresentados aqui habilitado a purificação do AtBor1 em quantidades que levou para a determinação da sua estrutura de cristal7, com diferenças de purificação consiste em cortar a sua marca e trocando o transporte em um diferente detergente para melhorar de difração cristal7.
Nosso protocolo gera importantes considerações para a seleção de homologs e o detergente usado para solubilizar e purificá-los. DDM é uma primeira escolha comum para detergente porque é relativamente suave, muitas vezes bem sucedidos em solubilizing e tem sido utilizado em estudos estruturais e funcionais de uma grande variedade de proteínas da membrana. Para determinar se um detergente é uma seleção pobre por uma membrana, um método comum de avaliação é se a proteína dá um pico único monodisperso em um cromatograma da SEC, em vez de um grande pico no volume vazio ou uma gama de polydisperse picos, que indica a proteína misfolded ou instável. Uma consideração mais sutil é gerada pela nossa purificação de ScBor1. Purifica em grandes quantidades e parece favorável e monodisperso em um cromatograma da SEC, que sugere que poderia ser um alvo atraente para estudos estruturais. No entanto, nosso ensaio do cross-linking revela que é um monômero quando purificado. Embora seja possível que ScBor1 poderia existir nativamente como um monômero na célula, estudos indicam que os transportadores de SLC4 e seus homologs são susceptíveis de ser dímeros7,8,9,10. Nosso desenvolvimento do ensaio do cross-linking ocorreu após a cristalização e resolver a estrutura de AtBor1. No entanto, tinha sido capaz de avaliar o ScBor1 em comparação com AtBor1 com o ensaio do cross-linking, valiosos esforços de pesquisa e tempo poderiam ter foi redirecionados para a prossecução dos AtBor1 em vez de ScBor1, o último dos quais, em última análise não foi bem sucedido em experimentos de cristalização e difração. Este ensaio pode assim ajudar pesquisadores distinguir entre homologs ou detergentes para usar ao prosseguimento de estudos estruturais a fim de priorizar as condições em que a proteína mantém sua conformação nativa suspeita. Além disso, o ensaio pode ser usado para sondar quais aminoácidos são críticos para o multimerization, a fim de encontrar substituições de aminoácidos que desestabilizam o multimerization interface e chumbo para obrigar os monômeros. Esta abordagem tem sido usada para sondar o significado funcional de homomeric montagem de transportadores de membrana a16,17,18.
Uma vantagem geral do nosso método é que fermento tem sido mostrado para permitir a expressão das proteínas de membrana muitos desafiadores de diversas função1. Além disso, seus baixo custo e crescimento vezes promovem sua acessibilidade para muitos esforços de pesquisa que pode ser menos capaz de usar estratégias de expressão que requerem mídia de crescimento caro ou cultura de tecidos. Os procedimentos apresentados aqui são relativamente baratos e podem ser executados em uma semana, que ressalta a viabilidade da abordagem. Implementação desses protocolos pode ajudar a permitir estudos estruturais e funcionais de outras proteínas de membrana desafiador.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por fundos de inicialização no Davidson College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES) | Acros | 172591000 | |
| Äkta Pure 25 L FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC905024 | for concentrating nickel column fractions |
| Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC805024 | for concentrating S200 fractions |
| Bacto Peptone | BD Diagnostics | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD Diagnostics | 288620 | |
| Glass Erlenmeyer flask, 2L | Sigma-Aldrich | CLS44442L | |
| Benchtop centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Bottle top filter | Nalgene | 595-4520 | the membrane is removed and used to filter glass beads |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Complete supplement mixture without histidine | Sunrise Science | 1006-100 | |
| D-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
| Ethanol, 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| Gel tank SDS-PAGE system | Bio-Rad | 1658004 | |
| Glass bead-beating cell disruptor | BioSpec | 1107900 | |
| Glass beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105 | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | sent as an 8% solution under nitrogen |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| HiTrap IMAC FF column, 1 mL | GE Healthcare | 17-0921-02 | charged with nickel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imidazole | Acros | 12202 | |
| Instant Blue gel stain | Expedeon | ISB1L | |
| JA-10 rotor | Beckman | 369687 | |
| JA-14 rotor | Beckman | 339247 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Thermo Scientific | 3451 | |
| Microcentrifuge, refrigerated | Fisher | 13-100-676 | |
| Mini-Protean Tris-glycine gels, 4-20% | Bio-Rad | 456-1096 | |
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | F155005 | used for loading lysate onto affinity column |
| n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM) | Inalco | 1758-1350 | |
| Nickel(II) Sulfate Hexahydrate | Sigma-Aldrich | 227676 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick | C24 | |
| p423 GAL1 plasmid with borate transporter insert | available from authors | ||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Acros | 215740050 | |
| Polycarbonate ultracentrifuge tubes | Beckman | 355618 | |
| Polypropylene bottles, 250mL | Beckman | 356011 | |
| Polypropylene bottles, 500mL | Beckman | 355607 | |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | Bio-Rad | 1610375 | |
| S. cerevisiae expression strain DSY-5 | available from authors | ||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Spin column with 0.2 µm filter, 0.5mL | Millipore | UFC30GV0S | for filtering protein before injecting onto S200 column |
| Sterile Falcon tubes, 15mL | Lab Depot | TLD431696 | |
| Sterile Falcon tubes, 50mL | Lab Depot | TLD431698 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | used for SEC purification |
| Syringe filter, 5µm | Pall | 4650 | for filtering lysate before loading affinity column |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman | 337922 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-70M | |
| YNB+Nitrogen without amino acids | Sunrise Science | 1501-500 |
References
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