Summary
Hier presenteren we een protocol om express, solubilize en zuiveren van diverse eukaryotic boraat vervoerders met homologie aan de SLC4 transporter familie met behulp van gist. Ook beschrijven we een chemische cross-linking test om te beoordelen van de gezuiverde homomeric eiwitten voor montage van de multimeric. Deze protocollen kunnen worden aangepast voor andere uitdagende membraaneiwitten.
Abstract
De opgeloste stof Carrier 4 (SLC4)-familie van eiwitten heet de bicarbonaat vervoerders en omvat het archetypische eiwit Anion Exchanger 1 (AE1, ook bekend als Band 3), de meest voorkomende membraan eiwit in de rode bloedcellen. De familie SLC4 is homoloog met boraat vervoerders, die in planten en schimmels gekenmerkt. Het blijft een grote technische uitdaging te uiten en te zuiveren van vervoer membraaneiwitten aan homogeniteit in hoeveelheden geschikt voor structurele of functionele studies. Hier beschrijven we gedetailleerde procedures voor de overexpressie van boraat vervoerders in Saccharomyces cerevisiae, isolatie van gist membranen, solubilisatie van eiwitten door wasmiddel en zuivering van boraat vervoerder homologen van S. cerevisiae, Arabidopsis thalianaen Oryza sativa. Wij ook detail een experiment om te multimerization van homomeric vervoerders assay dwarsbinding Glutaaraldehyde. Onze algemene procedures kunnen worden toegepast op alle drie eiwitten en zijn geoptimaliseerd voor werkzaamheid. Veel van de strategieën die hier ontwikkeld kunnen worden gebruikt voor de studie van andere uitdagende membraaneiwitten.
Introduction
De moeilijkheid in het verkrijgen van voldoende hoeveelheden van gezuiverde membraan eiwit blijft een kritische knelpunt bij het nastreven van structurele en functionele studies van receptoren, ionenkanalen en vervoerders. Er zijn veel protocollen voor matig hoge doorvoer pijpleidingen naar scherm en vind kandidaat membraaneiwitten die uitdrukking geven aan goed genoeg om latere in vitro studies1,2,3,4 . Meestal eiwitten zijn gelabeld met een N - of C-terminaal groen fluorescente proteïne (GFP) en expressie niveaus worden gecontroleerd, hetzij door fluorescentie-gel, hetzij door fluorescentie-detectie grootte uitsluiting chromatografie (FSEC)5. Een dergelijke aanpak in staat stellen de triaging van membraan eiwit kandidaten in hoge waarin eiwitten, matige of laag uitspreken van eiwitten, of eiwitten die uitdrukking geven aan slecht of helemaal niet. Deze aanpak werkt goed wanneer de proefopzet is te groot aantal kandidaat-genen met de bedoeling te selecteren welk eiwit spreekt het beste onderzoeken. Echter in sommige gevallen, is een experimentele aanpak gebaseerd op het bestuderen van een bepaalde membraan eiwit, dat kan lastig zijn wanneer de expressie van dat eiwitniveaus in de gematigde of lage bereik. Daarnaast, kunnen soms in deze gevallen expressie niveaus slechts minimaal verhoogd worden door een wijziging van de constructie via opschoningen, thermostabilizing mutaties of codon optimalisatie. Het is daarom, soms noodzakelijk voor het optimaliseren van membraan eiwit expressie en zuivering protocollen voor membraaneiwitten die slechts matig goed uitdrukken.
De SLC4 familie van vervoerders omvat de bicarbonaat vervoerder Anion Exchanger 1 (ook bekend als Band 3), de meest voorkomende membraan eiwit in rode bloedcellen6en een belangrijke stimulans van cellulaire ademhaling. De familie SLC4 is homoloog met boraat vervoerders, die zijn essentieel in planten en is aangetoond dat ze vertonen een vergelijkbare structuur aan Anion Exchanger 1 alsmede aan natrium-coupled SLC4 vervoerders7,8,9 ,10. Wij rapporteren hier geoptimaliseerde expressie en zuivering EiwitProtocollen S. cerevisiae met drie verschillende boraat vervoerders gevonden in gist en planten zuiveren. We benadrukken in detail belangrijke stappen we hebben naar het optimaliseren van het rendement en de efficiëntie van de zuivering aan homogeniteit. Daarnaast rapporteren we een chemische cross-linking assay Glutaaraldehyde gebruiken om te controleren de multimeric vergadering van deze vervoerders in het kader van een gezuiverde eiwit-wasmiddel-lipide-complex. De cross-linking experiment kan helpen homolog en afwasmiddel geschiktheid evalueren door beoordeling van de toestand van de multimeric van oligomere vervoerders na zuivering.
Dit protocol wordt ervan uitgegaan dat de gewenste vervoerder in een plasmide 2 µ afgeleid onder afleidbare controle van de promotor van de GAL1 voor expressie in S. cerevisiaeheeft gekloond. Voor deze procedures, DNA werd gebruikt codering full-length wild-type boraat vervoerders Saccharomyces cerevisiae Bor1 (ScBor1)11, Arabidopsis thaliana Bor1 (AtBor1)12, en Oryza sativa -Bor3 (OsBor3)13 . De C-terminus in elk construct is toegevoegd met een 10-zijne-tag en een trombine breukzijde ingevoegd tussen de vervoerder en de 10-zijne-tag om haar verwijderen, als gewenst. Het protocol zal ook aannemen dat het plasmide al omgetoverd tot de DSY-5 expressie stam van S. cerevisiae op volledige aanvullende selectieve media (CSM) ontbreken van histidine.
Protocol
1. voorbereiding van de media en belangrijke buffers
- Bereiden 500 mL 40% galactose door 200 g galactose en -geïoniseerd water toe te voegen aan een totaal volume van 500 mL. Gebruik een hete plaat of magnetron te verhogen van het tempo van de galactose krijgen in oplossing. Steriel filter met een vacuüm filtratie apparaat bestaande uit een 0,2 µm filter top gekoppeld aan een steriele fles.
Opmerking: Alle mediaoplossingen zijn bereid met behulp van de geïoniseerd water. - Bereiden 500 mL van 40% glucose door 200 g glucose en water toe te voegen aan een totaal volume van 500 mL. Autoclaaf te steriliseren.
- In elk van de vier 2 L kolven, Voeg 0.4 g van volledige aanvulling mengsel zonder histidine (CSM-Hsi), 3,35 g gist stikstof basis met ammoniumsulfaat (YNB + stikstof) en 475 mL water. Autoclaaf. Voeg 25 mL van 40% glucose te bereiken van een definitieve glucose concentratie van 2%.
- Toevoegen, een glazen fles, 50 g pepton en 25 g gistextract en tot 375 mL water. Autoclaaf. Voeg 125 mL 40% galactose te geven van 5 x Gist-pepton (YP) oplossing met 10% galactose.
- Toevoegen, in een maatkolf van 250 mL, 0,04 g CSM-Hsi, 0.335 g YNB + stikstof en water tot 47.5 mL. Autoclaaf. Voeg 2,5 mL van 40% glucose om 50 mL van CSM-Hsi YNB + 2% glucose.
- Bereid 1 L van 1M Tris pH 7.0 door het mengen van 121.14 g van Tris basis met 800 mL water. Geconcentreerd zoutzuur toevoegen totdat de pH 7.0. Voeg water toe tot een eindvolume van 1 L en passeren een 0,2 µm filter.
- Bereid 500 mL 0,5 M ethyleendiamminetetra zuur (EDTA) pH 8,0 door het mengen van 73.06 g EDTA met 400 mL water. Natriumhydroxide-pellets toevoegen totdat het EDTA is ontbonden en de pH 8.0 bereikt. Voeg water toe tot een eindvolume van 500 mL en passeren een 0,2 µm filter.
- Bereid 100 mL voor 100 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) door het mengen van 1.74 g PMSF met 200 bewijs ethanol. Winkel bij-20 ° C.
- 225 mL 2 x parel was buffer bestaande uit 50 mM Tris pH 7.0, 1.4 M NaCl, 20% glycerol en 1 mM EDTA pH 8.0 voor te bereiden.
- 100 mL van de uitsluiting chromatografie buffergrootte (S200 buffer) bestaande uit 20 mM 4-Morpholinoethanesulfonic zuur hydraat (MES) pH 6,5, 100 mM NaCl, 2% glycerol en 0,03% n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM) voor te bereiden.
- 100 mL membraan resuspensie buffer bestaande uit 50 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, en 10% glycerol te bereiden.
- 10 mL van een 3 x SDS-pagina laden kleurstof voor te bereiden door het mengen van 3 mL 20% natrium dodecyl sulfaat (SDS), 3 mL glycerol, 2.4 mL 1M Tris pH 6.8, 0,03 g bromophenol blauw en 1.6 mL 2-mercaptoethanol.
2. overexpressie van boraat Transporter in S. cerevisiae
- Inoculeer drie getransformeerde gist kolonies in 50 mL CSM-Hsi + YNB + 2% glucose media en schud overnachting in 190 rpm bij 30 ° C.
- De volgende dag een spectrofotometer gebruiken om te bepalen van de optische dichtheid bij een golflengte van 600 nm (OD600) en beënten tot een OD600 van 0,01 elk van vier 2 L kolven bevatten elk 500 mL van CSM-Hsi YNB + 2% glucose media.
- Schudden van 190 toeren per minuut bij 30 ° C gedurende 30 h om de cellen te verbruiken alle glucose en te groeien naar een hoge dichtheid toestaan.
Opmerking: Resulteert in een langere tijd van groei resulteert in grotere cel, grotere geoogste membraan opbrengsten, en uiteindelijk grotere gezuiverde eiwit levert. - Induceren expressie door toevoeging van 125 mL 5 x YP media aangevuld met 10% galactose voor een inductie van de definitieve concentratie van 2% galactose. Schudden van 190 toeren per minuut bij 30 ° C gedurende 16 h.
- Oogst cellen door spinnen bij 4000 x g gedurende 15 min. resuspendeer de cellen in 100 mL koud water.
Opmerking: op dit punt cellen kunnen worden bevroren bij-80 ° C voor onbepaalde tijd, of de prep in lysis van de cel en membraan oogsten kan worden voortgezet. We oogsten meestal 40-45 g van cellen.
3. oogsten van gist membranen
- Toevoegen aan de cel resuspensie 11.25 mL 1M Tris pH 7.0, 0,45 milliliters EDTA 0.5 M, en 2,25 mL van 100 mM PMSF, de laatste twee van die als proteaseinhibitors fungeren. Voeg water toe tot een eindvolume van 225 mL, wat in een resuspensie van de cel buffer van 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA, en 1 mM PMSF resulteert.
Opmerking: Als met behulp van bevroren cellen toestaan cellen te ontdooien grondig, ongeveer 1 uur bij kamertemperatuur, omdat als ze gedeeltelijk bevroren blijven, zij lysis zal weerstaan door kraal gewonnen. - Voeg de cel hersuspensie in een metalen busje van 450 mL voor kraal gewonnen. Top af met koude 0.5 mm glaskralen het resterende volume.
- Monteren van een kraal-kloppend kamer met de rotor en onderdompelen in een ijsbad. Uitvoeren van zes 1 min pulsen, gescheiden door 2 minuten rusttijden de lysate oververhitting te voorkomen.
- Monteren van een vacuüm filtratie-apparatuur met behulp van een plastic wegwerp fles top filter geschroefd in een glazen fles. Verwijder het membraan van de filtratie, omdat de resterende kunststof apparaat de kralen vangt kan terwijl lysate geschiedde. De parels van de lysate scheiden door het gieten van de inhoud van de meetkamer kloppend kraal op de vergadering tijdens het toepassen van het vacuüm.
- Wassen van de kraal kloppend kamer met een 2 x wassen buffer waarin 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1.4 M NaCl, en 20% glycerol 225 mL. Verwijder de inhoud van de kamer op de parels om ze te wassen.
Opmerking: De wash geeft een eindvolume van ~ 450 mL lysed cellen en aanzienlijk verhoogt geoogste membraan levert. De eindconcentraties zijn 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10% glycerol en 700 mM NaCl en het primaire doel van het verheffen van de zoutconcentratie is te distantiëren van perifere membraaneiwitten. - Spin down de cel lysate gedurende 15 minuten staan bij 15.000 x g. Giet het supernatant in polycarbonaat flessen en spin voor 1 h bij 135.000 x g in een ultracentrifuge voor het verzamelen van membranen.
Opmerking: Als een ultracentrifuge niet beschikbaar is, membranen kunnen worden verzameld door spinnen gedurende 3 uur bij 53.000 x g, een kracht die in de vloer model centrifuges haalbaar is. - Verwijder het supernatant en wegen van de flessen met de membraan-pellets. Resuspendeer de membraan-pellets in ongeveer 35 mL membraan resuspensie buffer met 50 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, en 10% glycerol en voeg toe aan een glas douncer. Weeg de lege centrifuge buizen om te bepalen van de massa van membranen geoogst.
Opmerking: In de oogst van een efficiënte membraan, het gewicht van membranen worden gelijk aan ongeveer 20% het gewicht van cellen voor die oogst membraan gebruikt. Dit protocol geeft typische cel opbrengsten van 40-45 g, en dus verwachten we ook een rendement van 8-9 g membranen. - Dounce Meng de membranen en aliquot in 50 mL conische buizen die nu voor onbepaalde tijd kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C.
Opmerking: Voor dit experiment, meestal twee aliquots zijn gemaakt, zodat twee aparte eiwit zuivering worden uitgevoerd vanaf de ene oorspronkelijke cel voorbereiding.
4. solubilisatie en zuivering van eiwitten
- Voeg een roer bar en 150 mg n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) per g membraan wordt gebruikt in een bekerglas. Eiwit op het ijs of bij 4 ° C houden te allen tijde.
Opmerking: DDM hygroscopisch is en in een glazen pot met droogmiddel bij-20 ° C wanneer niet in gebruik moet worden opgeslagen. Het is ook typisch tussen de 4-5 g van membranen in een zuivering te verkrijgen van een aanzienlijke hoeveelheid pure eiwit te gebruiken. - Ontdooi membranen en een eindvolume van 15 mL per g membraan in membraan resuspensie buffer aangevuld met 1 mM PMSF en 20 mM imidazool pH 8,0 brengen. Membranen toevoegen aan het bekerglas af met DDM en roer gedurende 1 uur bij 4 ° C.
Opmerking: De DDM concentratie worden 1% w/v, maar voor de solubilisatie van membraaneiwitten wel kritischer bewust te zijn van de hoeveelheid wasmiddel toegevoegd per g membraan. - Spin voor 25 min bij 135.000 x g bij 4 ° C tot niet-ontbindend materiaal pellet. De bovendrijvende vloeistof filteren door een filter van de spuit 5 µm.
- Belasting de Voorbeeldset door de peristaltische pomp met een debiet van 1 mL/min op een 1 mL geïmmobiliseerdet nikkel affiniteit kolom geëquilibreerd in 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 20 mM imidazool pH 8,0 en 0,05% DDM.
Opmerking: Voor lagere waarin eiwitten, verbeterde zuiverheid en de opbrengsten werden waargenomen met behulp van een 1 mL in plaats van 5 mL kolom en nikkel in plaats van kobalt ionen voor chromatografie van de affiniteit. - Was de kolom met 10 kolom volumes van een wash-buffer met 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 80 mM imidazool pH 8,0 en 0,05% DDM.
Opmerking: De imidazool-concentratie die kan worden gebruikt tijdens wast voor een 10-zijne-gelabeld eiwit is hoger dan algemeen wordt gewaardeerd en in een verbeterde zuiverheid resulteert. - Elueer de proteïne in de buffer met 20 mM Tris pH 7.0, 200 mM NaCl, 10% glycerol, 300 mM imidazool pH 8,0 en 0,05% DDM. Verzamelen van het eluaat in tien 1 mL breuken en draaien op een 4-20% Tris-glycine SDS-pagina gel samen met ontbindend lysate en wassen breuken.
- Zwembad piek breuken, meestal ongeveer 5-6 mL en concentraat tot 500 µL of minder volume in een concentrator 50 kDa cutoff in een benchtop centrifuge gekoeld bij 4 ° C.
Opmerking: 500 µL is een typische maximumvolume geïnjecteerd in grootte uitsluiting Chromatografiekolommen (SEC). Op dit punt het eiwit voor onbepaalde tijd kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C of blijven op de SEC. - Filtreer de proteïne door een 0,2 µm filter voor de kolom van de spin en Injecteer op een grootte uitsluiting kolom (bijvoorbeeld Superdex-200) geëquilibreerd in S200 buffer: 20 mM Mes pH 6,5, 100 mM NaCl, 2% glycerol en 0,03% DDM.
Opmerking: Voor de latere Glutaaraldehyde dwarsbinding assay, de buffering agent moet niet bevatten een primair amine. SEC is een mogelijkheid om te wisselen van buffers, indien nodig, zoals hier wordt gedaan, wanneer het uitwisselen van Tris voor Mes. - Voer dat de piek breuken op een 4-20% Tris-glycine SDS-pagina gel. Vlekken van de gel pure piek breuken verzamelen en concentreren in een 50 kDa-cutoff-concentrator bij 4 ° C.
- De eiwitconcentratie bepalen door het meten van de extinctie bij een golflengte van 280 nm, en winkel voor onbepaalde tijd bij-80 ° C.
5. Glutaaraldehyde dwarsbinding Assay
- Bereid een 10 µL reactie door het mengen van 3 µL van 0, 5 mg/mL eiwitten in S200 buffer, 5 µL van S200 buffer, 1 µL van water of 20% natrium dodecyl sulfaat (SDS), gevolgd door 1 µL van 1,5% Glutaaraldehyde.
Opmerking: Dit geeft een 1 x reactie van de eiwitten en 0,15% Glutaaraldehyde 0,15 mg/mL. Monsters met een voorbehandeling van SDS moeten zijn belangrijke negatieve controles worden gemengd en bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten geïncubeerd voordat u Glutaaraldehyde toevoegt. - Incubeer de reactie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De reactie beëindigen door toe te voegen 5µL van 3 x SDS-pagina gel laden kleurstof, die bevat een overmaat van Tris buffer die het Glutaaraldehyde lest.
- Laden van alle 15 µL op 4-20% Tris-glycine SDS-pagina gel, die 1,5 µg eiwit per rijstrook zal laden. Voer de gel bij 200 V voor 30 min. vlek en bepalen van de omvang van het dimeer cross-linking door bewijs van een band die twee keer de grootte van de gedenatureerde monomeer prestatiestatus.
Opmerking: Een Glutaaraldehyde titratie en tijdsverloop kunnen eerst worden uitgevoerd om te zoeken naar de beste voorwaarden voor een homomeric transporter.
Representative Results
Typische gels voor de eluted breuken uit het uitvoeren van de chromatografie van de affiniteit van de nikkel Toon alle drie eiwitten gedeeltelijk gezuiverd(Figuur 1). Aan de rechterkant van de ladder is de lysate, die in elk geval toont niet een significante band die overeenkomt met de boraat vervoerder, hetgeen typisch is voor proteïnen die doen niet goed overexpress. De 80 mM wassen baan toont minimaal verlies van 10-zijne-gelabeld eiwit ondanks de relatief hoge imidazool-concentratie. Bands die overeenkomt met de boraat vervoerders zijn gemakkelijk herkenbaar in geëlueerd breuken, en breuken geacht te bevatten het grootste deel van het eluted eiwit vóór het injecteren op de S200 gel filtratie kolom zijn geconcentreerd. In dit stadium zijn de eiwitten onvoldoende gezuiverd voor tal van downstream toepassingen, zoals aangegeven door extra bands in de geconcentreerde steekproef vóór het injecteren op de S200 kolom (Figuur 1B). Echter blijkt het injecteren van het monster op de kolom grootte uitsluiting geëlueerd breuken van hoge zuiverheid (Figuur 1-B-C). Chromatogrammen en hun overeenkomstige gels voor elk van de boraat vervoerders worden gepresenteerd. Ondanks de matige zuiverheid van de monsters op de elutie van de chromatografie van de affiniteit is de proteïne zeer zuiver op eluerende uit de gel filtratie kolom. Kritisch, onthullen de chromatogrammen elke proteïne te migreren hoofdzakelijk als een piek van één monodispers met weinig eiwitten in het dode volume behouden. Een stabiele en gevouwen proteïne in het algemeen geeft een monodispers en de symmetrische peak, terwijl unstable, misfolded of geaggregeerde eiwit zal in het algemeen meerdere asymmetrische pieken of een grote piek in het dode volume. Het is tekenend voor het verkrijgen van een definitieve rendement van ongeveer 2 mg gezuiverd eiwit per L van gist cultuur voor ScBor1, en ongeveer 1 mg elke gezuiverde AtBor1 en OsBor3 per L cultuur. Deze cijfers zijn de hoeveelheid eiwit gezuiverd van een aliquoot deel van 4-5 g van membranen, die afkomstig van een is helft van onze oorspronkelijke cel voorbereiding.
De cross-linking experiment blijkt dat gezuiverde homomeric vervoerders kunnen hun vergadering in oplossing gemakkelijk beoordeeld (Figuur 2). Het doel van de monsters met een voorbehandeling van SDS is om te laten zien dat dwarsbinding afhankelijk van een gevouwen deelstaat van de oplossing is en dat dwarsbinding daarom treedt niet op wanneer multimerization wordt verstoord door een harde wasmiddel. De resultaten die worden weergegeven onderscheid dat is een van de drie boraat vervoerders, ScBor1, niet dimerized wanneer gereinigd in DDM in deze voorwaarden, terwijl de andere twee, AtBor1 en OsBor3, cross-link en dimerisatie Toon. Het is mogelijk om te zien dat niet alle eiwit kan cross-link. In dit voorbeeld zijn de sporen van OsBor3 monomeer zichtbaar, terwijl AtBor1 cross-links tot voltooiing. De omvang van de cross-linking hangt af van het aantal lysine residuen in de nabijheid van elkaar, en het is mogelijk dat andere cross-linking reagentia efficiënt verschillende membraaneiwitten kunnen cross-link.
Figuur 1 . Nikkel affiniteit en grootte uitsluiting chromatografie zuivering voor drie boraat vervoerders. Elk verticaal paneel (A), (B), en (C) gegevens voor ScBor1, AtBor1 en OsBor3 bevat. (A) nikkel affiniteit kolom. M is een ladder van moleculair gewicht markers met gewichten in kDa opgegeven aan de linkerkant. L is de ruwe lysate en W is de 80 mM imidazool wassen. Alle andere genummerde rijstroken correspondeert met 1 mL breuken met 300 mM imidazool geëlueerd. Balken boven breuken aangeven die werden geselecteerd om te worden gecombineerd en geconcentreerd voor injecties op de kolom. (B) P geeft aan geconcentreerd eiwit vóór het injecteren op de S200-kolom. Geëlueerd SEC breuken zijn rechts, met haakjes gebruikt voor het vergelijken van gel rijstroken met hun chromatografische breuken in (C). Het dode volume is net na 8 mL. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Gezuiverde vervoerders voor multimeric montage dwarsbinding assay beoordeelt. Een ladder met molecuulgewicht wordt aangegeven aan de linkerkant. Vooral andere rijstroken wordt weergegeven welke eiwit aanwezig is en of het monster heeft Glutaaraldehyde toegevoegd of een voorbehandeling van SDS vóór Glutaaraldehyde toevoeging. Pijlen geven aan de standpunten van het monomeer en het dimeer voor AtBor1 en OsBor3. ScBor1 is een kleinere eiwit dan AtBor1 en OsBor3 en loopt zoals verwacht. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
We hebben hier gedetailleerde protocollen die in de zuivering aan homogeniteit van drie verschillende eukaryotische boraat vervoerders resulteren gedeeld. De protocollen die hier gepresenteerd worden afgeleid uit andere protocollen voor de expressie van integraal membraaneiwitten in S. cerevisiae1,14, en het resultaat van onze optimalisaties in zowel de verbeterde zuiverheid en de verbeterde opbrengsten. De parameters geoptimaliseerd hier omvatten cel cultuur groei volumes en tijden, kraal-kloppend lysis van de procedures, buffer samenstelling tijdens lysis van de cel en eiwitreiniging, hoeveelheid wasmiddel gebruikt per gram membraan, metaalion identificeren in affiniteit zuivering, volume van de kolom affiniteit en de uitvoering van een cross-linking assay evalueren homolog en afwasmiddel geschiktheid met de beoordeling van de toestand van de multimeric van oligomere vervoerders. De protocollen zijn succesvol voor meerdere SLC4 homologen van de plant en schimmel soorten. Een beperking van alle strategieën voor de zuivering van integraal membraaneiwitten is dat er geen universele membraan eiwit zuivering methode dat is gegarandeerd om te werken. Het is mogelijk dat onze protocollen waarschijnlijker om succesvol te zijn zijn voor eiwitten dichter in de identiteit van de volgorde en structuur SLC4 vervoerders, en daarmee de gezinsleden, SLC4, SLC23 en SLC26 veelbelovende worden kon richt zich op15. Ook de meer evolutionair ver van de vervoerders boraat zou een membraan transportwagen, hoe groter de kans het protocol zal hebben om anders te zijn, zoals door het variëren van de expressie systemen, wasmiddel of andere essentiële parameters-4.
Het protocol maakt gebruik van de meest gebruikte affiniteit tag in EiwitReiniging, de zijne-tag. Ondanks de aanwezigheid van verontreinigingen in de eerste eluted breuken, de combinaties van nikkel affiniteit, uitgebreide wassen en latere SEC zuivering resulteert in de hoogst gezuiverde proteïne. Een 10-zijne-tag maakt het mogelijk voor de strengere imidazool wast en dus meer achtergrond bindende proteïnen dan kan worden verwijderd in wast toegestaan door 8-Hsi - of 6-zijne-tags kunt verwijderen. Onze selecties voor zuivere breuken err op de conservatieve zijde van de meeste fracties van zeer zuivere gel, die correspondeert met de fracties van de SEC piek. Definitieve eiwit opbrengst kunnen worden verhoogd door te bundelen en te concentreren meer breuken, zij het met de inruil van iets minder zuivere eiwitten. De hier gepresenteerde methoden ingeschakeld de zuivering van AtBor1 in hoeveelheden die hebben geleid tot de vaststelling van haar kristal structuur7, met zuivering verschillen uit het afsnijden van de His-tag en het uitwisselen van de vervoerder in een andere wasmiddel te verbeteren kristal diffractie7.
Ons protocol werpt belangrijke overwegingen voor de selectie van homologen en het wasmiddel gebruikt om te solubilize en te zuiveren van hen. DDM is een gemeenschappelijk eerste keuze voor wasmiddel, omdat het relatief mild, vaak succesvol in het solubilizing, en is gebruikt in structurele en functionele studies van een breed scala aan membraaneiwitten. Om te bepalen of een wasmiddel een slechte keuze voor een membraan is, wordt een gemeenschappelijke methode voor de evaluatie of het eiwit geeft een enkele monodispers piek op het chromatogram van een SEC, in plaats van een grote piek in het dode volume of een bereik van polydisperse pieken, die het geven van misfolded of instabiel eiwit. Een meer subtiele aandacht is opgevoed door onze zuivering van ScBor1. Het zuivert in grote hoeveelheden en ziet er gunstige en monodispers op een chromatogram van de SEC, die suggereert dat het een aantrekkelijk doelwit voor structurele studies zou kunnen zijn. Onze cross-linking assay blijkt echter dat er een monomeer wanneer gereinigd. Hoewel het mogelijk is dat ScBor1 native kon bestaan als een monomeer in de cel, blijkt studies dat SLC4 vervoerders en hun homologen waarschijnlijk Dimeren7,8,9,10. Onze ontwikkeling van de cross-linking assay hebben plaatsgevonden na kristalliseren en de structuur van de AtBor1 op te lossen. Echter hadden we kunnen evalueren van ScBor1 in vergelijking met AtBor1 met de cross-linking assay, waardevolle tijd en speurwerk inspanningen kon hebben omgeleid naar de uitoefening van AtBor1 in plaats van ScBor1, de laatste van die uiteindelijk was niet succesvol in kristallisatie en diffractie experimenten. Deze test kan dus helpen onderzoekers onderscheiden homologen of wasmiddelen te gebruiken bij het nastreven van structurele studies om te prioriteren voorwaarden waarin de proteïne de vermoedelijke inheemse conformatie onderhoudt. Bovendien kan de bepaling sonde welke aminozuren zijn essentieel voor multimerization, om te vinden van aminozuur vervangingen die destabiliseren de multimerization interface en leiden tot het verplichten van monomeren worden gebruikt. Een dergelijke aanpak is gebruikt om de sonde van de functionele betekenis van homomeric vergadering in membraan vervoerders16,17,18.
Een algemeen voordeel van onze methode is dat gist is gebleken om de uitdrukking van vele uitdagende membraaneiwitten voor diverse functie1. Bovendien zijn lage kosten en groei tijden reclame maken voor de toegankelijkheid voor vele onderzoeksinspanningen die wellicht minder gebruik maken van strategieën van de expressie waarvoor weefselkweek of dure groei media. De procedures die hier gepresenteerd zijn relatief goedkoop en kunnen worden uitgevoerd in een week waarin de haalbaarheid van de aanpak onderstreept. Uitvoering van deze protocollen kan helpen structurele en functionele bestudering van andere uitdagende membraaneiwitten mogelijk maken.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door opstarten middelen aan Davidson College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES) | Acros | 172591000 | |
| Äkta Pure 25 L FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC905024 | for concentrating nickel column fractions |
| Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC805024 | for concentrating S200 fractions |
| Bacto Peptone | BD Diagnostics | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD Diagnostics | 288620 | |
| Glass Erlenmeyer flask, 2L | Sigma-Aldrich | CLS44442L | |
| Benchtop centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Bottle top filter | Nalgene | 595-4520 | the membrane is removed and used to filter glass beads |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Complete supplement mixture without histidine | Sunrise Science | 1006-100 | |
| D-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
| Ethanol, 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| Gel tank SDS-PAGE system | Bio-Rad | 1658004 | |
| Glass bead-beating cell disruptor | BioSpec | 1107900 | |
| Glass beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105 | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | sent as an 8% solution under nitrogen |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| HiTrap IMAC FF column, 1 mL | GE Healthcare | 17-0921-02 | charged with nickel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imidazole | Acros | 12202 | |
| Instant Blue gel stain | Expedeon | ISB1L | |
| JA-10 rotor | Beckman | 369687 | |
| JA-14 rotor | Beckman | 339247 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Thermo Scientific | 3451 | |
| Microcentrifuge, refrigerated | Fisher | 13-100-676 | |
| Mini-Protean Tris-glycine gels, 4-20% | Bio-Rad | 456-1096 | |
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | F155005 | used for loading lysate onto affinity column |
| n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM) | Inalco | 1758-1350 | |
| Nickel(II) Sulfate Hexahydrate | Sigma-Aldrich | 227676 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick | C24 | |
| p423 GAL1 plasmid with borate transporter insert | available from authors | ||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Acros | 215740050 | |
| Polycarbonate ultracentrifuge tubes | Beckman | 355618 | |
| Polypropylene bottles, 250mL | Beckman | 356011 | |
| Polypropylene bottles, 500mL | Beckman | 355607 | |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | Bio-Rad | 1610375 | |
| S. cerevisiae expression strain DSY-5 | available from authors | ||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Spin column with 0.2 µm filter, 0.5mL | Millipore | UFC30GV0S | for filtering protein before injecting onto S200 column |
| Sterile Falcon tubes, 15mL | Lab Depot | TLD431696 | |
| Sterile Falcon tubes, 50mL | Lab Depot | TLD431698 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | used for SEC purification |
| Syringe filter, 5µm | Pall | 4650 | for filtering lysate before loading affinity column |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman | 337922 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-70M | |
| YNB+Nitrogen without amino acids | Sunrise Science | 1501-500 |
References
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Andréll, J., Tate, C. G. Overexpression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Molecular Membrane Biology. 30 (1), 52-63 (2013).
- Lyons, J. A., Shahsavar, A., Paulsen, P. A., Pedersen, B. P., Nissen, P. Expression strategies for structural studies of eukaryotic membrane proteins. Current Opinion in Structural Biology. 38, 137-144 (2016).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).
- Thurtle-Schmidt, B. H., Stroud, R. M. Structure of Bor1 supports an elevator transport mechanism for SLC4 anion exchangers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10542-10546 (2016).
- Coudray, N., et al. Structure of the SLC4 transporter Bor1p in an inward-facing conformation. Protein Science. 26 (1), 130-145 (2016).
- Arakawa, T., et al. Crystal structure of the anion exchanger domain of human erythrocyte band 3. Science. 350 (6261), 680-684 (2015).
- Huynh, K. W., et al. CryoEM structure of the human SLC4A4 sodium-coupled acid-base transporter NBCe1. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Zhao, R., Reithmeier, R. A. Expression and characterization of the anion transporter homologue YNL275w in Saccharomyces cerevisiae. American Journal of Physiology Cell Physiology. 281 (1), 33-45 (2001).
- Takano, J., et al. Arabidopsis boron transporter for xylem loading. Nature. 420, 337-340 (2002).
- Nakagawa, Y., et al. Cell-type specificity of the expression of Os BOR1, a rice efflux boron transporter gene, is regulated in response to boron availability for efficient boron uptake and xylem loading. Plant Cell. 19 (8), 2624-2635 (2007).
- Hays, F. A., Roe-Zurz, Z., Stroud, R. M. Overexpression and purification of integral membrane proteins in yeast. Methods in Enzymology. 470, Issue C (2010).
- Chang, Y. -N., Geertsma, E. R. The novel class of seven transmembrane segment inverted repeat carriers. Biological Chemistry. 398 (2), 165-174 (2017).
- Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Design, function and structure of a monomeric ClC transporter. Nature. 468 (7325), 844-847 (2010).
- Last, N. B., Miller, C. Functional Monomerization of a ClC-Type Fluoride Transporter. Journal of Molecular Biology. 427 (22), 3607-3612 (2015).
- Yu, X., et al. Dimeric structure of the uracil:proton symporter UraA provides mechanistic insights into the SLC4/23/26 transporters. Cell Research. 27 (8), 1020-1033 (2017).
