Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

עיכוב של צמיחה אספרגילוס flavus Aflatoxin ייצור הטרנסגניים תירס לבטא מעכב α-עמילאז מן Lablab purpureus ל'

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/59169
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Southern Regional Research Center, USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology, University of Arkansas

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אספרגילוס flavus צמיחה וייצור aflatoxin ב תירס גרעינים ביטוי של חלבונים נגד פטריות.  באמצעות זן GFP-לבטא flavus א לנו פיקוח זיהום או התפשטות הפטרייה ב גרעינים בוגרת בזמן אמת. וזמינותו היא מהירה, אמינה, לשחזור.

Abstract

Aflatoxin זיהום בגידולים ואוכל הזנה היא אתגר גדול ברחבי העולם. Aflatoxins, המיוצר על ידי הפטריה אספרגילוס flavus (flavus א) הם קרצינוגנים, המפחיתים באופן משמעותי חיתוך הערך בשדה תירס וגידולים אחרים שמן עשיר כמו בוטנים חוץ פוזות איום רציני לבריאות האדם ושל בעלי החיים. גישות שונות, כולל הרבייה המסורתיים, ביטוי הטרנסגניים ההתנגדות קשורה חלבונים ו RNA הפרעה (RNAi)-מבוסס מארח-induced ג'ין להחרשת הקריטיים flavus ע' ג'ין מטרות, להיות מוערכים להגדיל aflatoxin עמידות גידולים רגישים. מחקרים שנעשו בעבר הראו תפקיד חשוב של α-עמילאז הייצור הפתוגנזה ו aflatoxin א flavus , מציע הגן/אנזים זה הוא מטרה אפשרית כדי להפחית flavus א צמיחה וייצור aflatoxin. בהקשר זה, המחקר הנוכחי נערך כדי להעריך ביטוי heterologous (תחת שליטה של האמרגן 35S קונסטיטוטיביות CaMV) Lablab purpureus ל' α-עמילאז דמוי מעכב חלבון (AILP) תירס נגד flavus א. AILP הוא חלבון 36-kDa, אשר מעכב תחרותי של האנזים α-עמילאז flavus א , שייך למשפחת חלבון מעכב לקטין – arcelin – α-עמילאז במשותף שעועית. מחקרים במבחנה לפני העבודה הנוכחית הייתה הפגינו את התפקיד של AILP בעיכוב של צמיחה פטרייתי ופעילות של α-עמילאז flavus א . צמיחה פטרייתי וייצור aflatoxin ב גרעינים בוגרת נוטרו בזמן אמת באמצעות זן GFP-לבטא flavus א . הגרעין הקרנת assay (קרית גת) הוא מאוד פשוט להגדיר ומספק אמין לשחזור נתונים על זיהום ואת מידת התפשטות זה יכול ניתן לכמת להערכת germplasm וקווים מהונדס. בגלל הלחץ GFP הוא צמיחה בקורלציה מקרוב פטרייתי וזה, לפי סיומת, מתואם היטב לערכים aflatoxin.  מטרת העבודה הנוכחית הייתה ליישם את הידע הקודם הזה ב יבול מסחרי חשוב כמו חיטה כדי להגדיל את ההתנגדות aflatoxin. התוצאות שלנו מראים הפחתה 35% – 72% צמיחה flavus א AILP-ביטוי הטרנסגניים תירס גרעינים אשר, בתורו, מתורגם הפחתה 62% – 88% ברמות aflatoxin.

Introduction

Mycotoxin זיהום על ידי סוגים פטריות, אספרגילוס, Fusarium, Penicilliumו Alternaria היא בעיה רצינית של מזון ולהאכיל יבולים גדולים ברחבי העולם1,2,3. בין אלה שזקוקים, אספרגילוס יש את השפעה שלילית הגבוה ביותר על ערך היבול ובריאות האדם ושל בעלי החיים. אספרגילוס flavus (א flavus) הוא פתוגן הזדמנותית הצמח משפיע על יבול עשיר שמן כגון תירס, זרעי כותנה, בוטנים, מייצרת את קרצינוגנים, aflatoxins, כמו גם רבים רעילים מטבוליטים משניים (SMs). תירס האוכל חשוב להאכיל הגידול ברחבי העולם ו נמצא רגישים מאוד זיהום על-ידי flavus א. ההשפעה הכלכלית של זיהום aflatoxin-מאבד ערך מופחת ב תירס יכול להיות ככל 686.6 מיליון דולר לשנה בארה ב2 עם השינויים החזויים באקלים העולמי, ההשפעה של aflatoxins יכול לגרום הפסדים כלכליים רבתי ב תירס עם הערכות גבוה כמו 1.68 מיליארד דולר לשנה בעתיד הקרוב2. נתון כלכלי ובריאות להשפעות של aflatoxins בני אדם, חיות משק, שליטה aflatoxin קדם קציר תירס עשוי להיות הדרך היעילה ביותר כדי למנוע זיהום aflatoxin מזון, מוצרים.

הגישה ובקרה הקציר מראש גדול עבור עמידות aflatoxin תירס היה בשימוש נרחב של העשורים האחרונים היא בעיקר באמצעות רבייה, אשר דורשת כמות משמעותית של זמן4. לאחרונה, הייצור יש לו הצלחות בהפחתה aflatoxin בקנה מידה גדול שדה יישומים5,6. מלבד/מוצרים חדשים, יישום של כלים חדשניות כגון 'המארח המושרה ג'ין להחרשת' (HIGS) דרך RNAi וביטוי הטרנסגניים של חלבונים הקשורים בהתנגדות יש לו הצלחות בהפחתה של צמיחה flavus א aflatoxin ייצור במחקרים מעבדה ושדה בקנה מידה קטן. גישות אלה כעת להיות ממוטבים בנוסף לזיהוי מטרות ג'ין flavus א פוטנציאלי חדש עבור מניפולציה בעתיד.

מלבד גנים המעורבים ישירות בייצור mycotoxin בתור מטרות פוטנציאליות של אסטרטגיות שליטה מהונדס, הוכחו amylases פטרייתי לשחק תפקיד חיוני בשמירה על הפקה מוצלחת הפתוגנזה ו mycotoxin במהלך השלבים המוקדמים לזיהום הצמח הפונדקאי. כמה דוגמאות Pythium pleroticum (סוכן סיבתי של ריקבון קנה שורש ג'ינג'ר), Fusarium solani (סוכן סיבתי של כרובית ווילט), איפה מתאמים חיוביים בין פתוגניות והביטוי α-עמילאז ופעילות נצפו 7,8. עיכוב של פעילות α-עמילאז או באמצעות נוקאאוט גנטי או גישות תמונות ציפורים משפיע באופן שלילי צמיחה פטרייתי וייצור הרעלן. מוטציה נוקאאוט α-עמילאז של flavus א לא הצליח לייצר aflatoxins כאשר גדל עמילן המצע או degermed תירס גרעינים9. באופן דומה, ב- Fusarium verticillioides זן נוקאאוט α-עמילאז הצליחה לייצר fumonisin B1 (mycotoxin) במהלך זיהום של תירס גרעינים10. במחקר עדכני יותר, הפגינו גילברט et al. (2018) מבוסס-RNAi דפיקה למטה של הביטוי α-עמילאז flavus א HIGS. הקטינה באופן משמעותי את ייצור צמיחה, aflatoxin flavus א במהלך זיהום גרעיני תירס11 .

מעכבים ספציפיים של פעילות α-עמילן יש גם הפיק תוצאות דומות כמו המתקבל למטה-רגולציה של הביטוי α-עמילאז. הדוח הראשון את התפקיד של מעכב α-עמילאז בהתנגדות פטרייתי הגיעה בידוד ואפיון של מעכב טריפסין-α-עמילאז 14-kDa משורות תירס עמידים בפני flavus א12. בהמשך הקרנת הסרט כמה מאות מיני צמחים על-ידי Fakhoury Woloshuk להביא לאיתורם של חלבון מעכב דמוי α-עמילאז (AILP) 36-kDa מהזרעים של יקינתון שעועית, ל' Lablab purpureus 13. רצף פפטיד לקטינים AILP דמה השייכים למשפחת מעכבי לקטין – arcelin – α-עמילאז דיווח במשותף שעועית14,15. AILP מטוהרים התערוכה לא כל פעילות המעכבת לכיוון בתרבית של טריפסין ואפיון נוסף במבחנה הראו עיכוב משמעותי של נביטה conidial13וצמיחה של flavus א . דוחות שהוצגו כאן בבירור מראה α-עמילאז יכול לשמש מטרה בבקרת גישות להגבלת פתוגנים או מזיקים תלויים גיוס עמילן (באמצעות פעילות עמילאז-α) ורכישה של סוכרים מסיסים כמקור אנרגיה בזמן שלהם פתוגניים אינטראקציה עם צמחים פונדקאים.

אלפא-עמילאז ידוע להיות הקריטיים flavus ע' פתוגניות9,10,11, ונתן את החשיבות של AILP כמו אנטי חזק-הסוכן (α-עמילאז עיכוב/antigrowth)flavus א 13, יצרנו צמחי תירס מהונדס לבטא Lablab AILP ג'ין תחת האמרגן CaMV 35S מכוננת. המטרה היא לחקור אם ביטוי heterologous של זה מעכב α-עמילאז ב תירס הוא יעיל נגד ייצור פתוגנזה, aflatoxin flavus א במהלך זיהום גרעיני תירס. התוצאות שלנו מדגימים כי הגרעינים תירס מהונדס לבטא את AILP באופן משמעותי צמצם ייצור צמיחה, aflatoxin flavus א במהלך זיהום ליבה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. פלסמיד בונה ושינוי תירס

  1. PCR להגביר Lablab AILP הוספה באמצעות תחל את 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'ו 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3'. התנאים PCR לכלול צעד דנטורציה הראשונית ב 98 ° C ל 30 s (שלב 1), ואחריו דנטורציה ב 98 ° C עבור 10 s (שלב 2), חישול ב 55 ° C ל 30 s (שלב 3), התארכות ב-72 מעלות 20 s (שלב 4), 31 מחזורים של שלב 2 עד שלב 4 , וצעד התארכות הסופי ב-72 מעלות במשך 5 דק שיבוט המוצר PCR לתוך pCAMBIA שונה 1,300 וקטוריות באמצעות Xbaאני ו Pstאני באתרים מגבלת. רצף הווקטור היעד הסופי צמח כדי לאשר את הכיוון ואת רצף של הגן AILP משוכפל בוקטור.
  2. להפוך Agrobacterium המתח EHA101 עם הבונה וקטור הסופי (איור 1) כפי שתואר קודם לכן 16.
  3. שימוש טרנספורמציה Agrobacterium המכיל את הווקטור היעד הסופי צמח להפוך את העוברים ילדותי תירס (זיה מייז ל' Hi-II) (ביצע את הצמח טרנספורמציה מתקן של איווה סטייט) 16.
  4. לגדל צמחים0 T בחממה (26-29 מעלות צלזיוס; 16/8 h photoperiod בתוספת בלחץ גבוה Na-מנורות), self-pollinate שוב ושוב כדי לקבל T דור6 כדי להשיג homozygosity עבור התכונה מהונדס.

2. נבג נביטה assay

  1. הקציר דגימות עלים ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס. לטחון דגימות עלים עם ומכתש בעזרת חנקן נוזלי. שוקלים לצאת 0.5 g ב- 2 mL microcentrifuge צינורות, להוסיף µL 17 של מעכב פרוטאז, במקום צינורות על קרח.
  2. צנטריפוגה צינורות עבור 10 דקות ב 16,000 x g. העברת µL 225 של תמצית צמח ל 0.5 mL microcentrifuge צינורות ומניחים על קרח.
  3. בשפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל, להכין השעיה נבג מ של אספרגילוס flavus 70-GFP ב 1% תפוחי אדמה דקסטרוז מרק (w/v). מערבולת ולהתאים נבג ריכוז עד 105 נבגים/מ"ל עם haemocytometer.
    התראה: א flavus מייצרת aflatoxins, כל העבודה עם פטריה זו צריך לנהל בטיחות ביולוגית בארון.
  4. דגירה ב- PDB ב 28 ° C עד תרבות משיגה 50% חניכה של נביטה נבג כמצוין על-ידי בולטות של נבגים.
  5. מערבולת ופתרון aliquot 25 µL נבג למפעל 225 µL לחלץ. תקופת דגירה בדגימות של 20 שעות ב 28 ° C ברעידות לסירוגין.
  6. Aliquot 25 µL של פתרון נבג על שקופיות מיקרוסקופ ולמדוד אורך נבט צינורות הנבגים באמצעות את תוכנת המצלמה הדיגיטלית. השתמש מינימום של 20 מידות שכפל עבור כל שורה.
    הערה: בשלב זה, במקום כל התרבויות בגיל 4 ° C כדי לעצור את הצמיחה המושבה עד מוכן לספור.

3. ליבה הקרנת Assay (קרית גת)

  1. לבנות KSA בקבוקים על ידי הדבקה כמוסות snap 4 (22 מ"מ) בצלוחית 60 x 15 מ מ. לאפשר דבק להתייבש במשך 48 שעות לפני השימוש כמוסות. כל כובע KSA מהווה נציג אחד (איור 2).
  2. ב סטרילי בטיחות ביולוגית cabinet, לרסס מגש מרובע bioassay (24 ס מ x 24 ס מ) עם 70% אתנול: H2O (v/v) ולתת אוויר יבש. להוסיף נייר סטרילי כרומטוגרפיה המגש. לרסס 9 KSA כמוסות עם 70% אתנול, תן אוויר יבש, ומניחים במגש bioassay.
  3. לקו לכל הטרנסגניים תירס נבדק, לבחור 20 גרעינים ניזוק ומניחים בתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ. הוספת אתנול 70% ואפשר לשבת במשך 4 דקות. מנערים בעדינות צינורות במהלך עיקור. יוצקים את הגרעינים אתנול ולשטוף שלוש פעמים ב סטרילי יונים H2O.
  4. להכין השעיה ספורה של אספרגילוס flavus 70-GFP17 מתרבות בן 6 יום גדל על בינוני V8 (5% V8 מיץ, אגר 2%, pH 5.2).
    1. הוסף 20 מ"ל סטרילי 0.02% H X-100/יונים טריטון2O (v/v), לגנוז את הנבגים עם לולאה סטרילי. Pipet inoculum ואת המקום סטרילי בתוך 300 מ.
    2. להכין לדילול 5-fold עם 0.02% טריטון X-100, לאחר מכן לבצע ספירה נבג עם haemocytometer. לדלל שוב במידת הצורך להשיג 100 מ עם ריכוז של 4 x 106 נבגים/mL....
  5. מקום גרעינים גביע סטרילי 300 מ עם בר מערבבים. להוסיף inoculum הספל.
    התראה: הוספת גרעינים inoculum יגרום לפתרון הפתיחה. במקום כוס כימית על צלחת מערבבים במשך 3 דקות. לאחר 3 דקות, יוצקים את inoculum לתוך גביע ריק.
  6. באמצעות מלקחיים, מקום גרעינים המנה bioassay (1 ליבה cap). להוסיף 30 מ ל יונים מים לתחתית בכל מגש bioassay דגירה ב 31 ° C בחושך במשך 7 ימים.
  7. להכין גרעינים לצילום.
    1. להפריש 4 גרעינים מכל שורה עבור ניתוח מיקרוסקופי וצילום.
      הערה: ניתן לאחסן גרעינים ב 4 ° C לא יותר מאשר 5 ימים לפני סיום הצילום.
    2. תצלמי תמונות של גרעינים לאחר שבעה ימים של חיסון עם flavus א (איור 3).
    3. החיצוני נקי של גרעינים עם רקמות רכות, מים יונים. ביצוע סעיפים האורך של גרעינים ולצלם מיד תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  8. להכין גרעינים לניתוח.
    1. החיצוני נקי של גרעינים הנותרים עם רקמות רכות, מים יונים.
    2. מקום 4 גרעינים, המהוות נציג 1, בפוליקרבונט פקקי בורג 15 מ"ל בקבוקון המכיל 2 כדורים פלדת אל-חלד. מיד להקפיא בקבוקונים חנקן נוזלי, חנות ב-80 מעלות צלזיוס עד המשך עיבוד וניתוח.
    3. להסיר את צלוחיות למקפיא-80 ° C, לטחון גרעיני מהמגן-1,500 סל ד במשך 3 דקות.
      הערה: לשמור על גרעינים קפוא עם חנקן נוזלי.

4. PCR הקרנת גרעינים תירס מהונדס

  1. השתמש ה-DNA בידוד ערכת כדי לבודד דנ א גנומי (gDNA) מ השמיד תירס גרעינים נגוע flavus א על פי הוראות היצרן. בקצרה, להוסיף 280 מאגר µL F, פרוטאז µL 20 ו- 3 µL dithiothreitol (DTT) 10-15 מ"ג של גרעינים תירס השמיד. דגירה ומנערים ב thermomixer (56 ° C, 1,200 סל ד, 30 דקות). צנטריפוגה-g 10,000 x עבור 1 דקות, להעביר את תגובת שיקוע ברור equilibrated עמודה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות, צנטריפוגה ב x 700 g עבור 1 דקות עד elute gDNA.
  2. קח µL 0.8 של שחולצו gDNA כדי להגדיר את תגובת ה-PCR µL 20 עבור כל דגימה באמצעות ערכת ה-PCR. בצע thermocycling בתנאים המומלצים בפרוטוקול של היצרן. התנאים PCR לכלול צעד דנטורציה הראשונית ב 98 ° C למשך 5 דקות (שלב 1) ואחריו דנטורציה ב 98 ° C 5 s (שלב 2), חישול ב 55 ° C 5 s (שלב 3), התארכות ב-72 מעלות 20 s (שלב 4), 40 מחזורי שלב 2 עד שלב 4 , וצעד התארכות הסופי ב 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה (שלב 5).
  3. השתמש פריימר לפנים 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' הפוכה פריימר 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' כדי לאשר את הנוכחות של Lablab AILP ג'ין בליבות תירס מהונדס.

5. RNA בידוד, סינתזה cDNA ו- RT-PCR כמותי למחצה

  1. קח הומוגני flavus א נגוע תירס גרעינים שאוחסנו בעבר ב-80 מעלות צלזיוס לחילוץ RNA. תמצית ה-RNA באמצעות הכולל RNA בידוד ערכת לפי הפרוטוקול של היצרן, אבל עם שינוי קל18. לאחר הוספת 50 מ ג של אבקת הומוגני גרעיני תירס במאגר החילוץ, לערבב אותו (בלי vortexing) באמצעות טיפ pipet 1 מ"ל, תשאיר את זה על קרח למשך 5-6 דקות לפני שתמשיך והשלבים כמפורט בפרוטוקול של היצרן.
  2. להכין cDNA באמצעות ערכת סינתזה cDNA לפי פרוטוקול של היצרן 18.
  3. השתמש µL 0.5 של cDNA מדולל לפי תגובת ה-PCR RT-PCR כמותי למחצה כמו שתואר קודם לכן18. השתמש תחל ואחורה qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' ו- qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' בהתאמה, כדי לזהות ביטוי גנים Lablab AILP , ואת קדימה ולהפוך תחל qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ ו- qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ בהתאמה לביטוי של תירס ribosomal מבנה גנטי (צלעות), GRMZM2G02483819 כמו גן משק בית.

6. GFP כימות

  1. הכנת 50 מ ל כל אחד 0.2 מ' monobasic סודיום פוספט (NaH2PO4) ו- 0.2 מ' dibasic סודיום פוספט (נה2HPO4·7H2O) יונים H2O.
  2. לפצות 100 מ של pH 7.0 סורנסון פוספט המאגר. PH 7.0, להוסיף 19.5 mL NaH2PO4 המניות, 30.5 מ ל NaHPO4·7H2O מניות, 50 מ ל יונים H2O.
  3. שוקלים לצאת חומר הליבה הקרקע 25 מ ג (משקל טריים, FW) ולמקם צינור microcentrifuge 1.0 מ"ל. להוסיף 500 µL פוספט מאגר צנטריפוגה צינור ו vortex ב-30 s.
  4. צנטריפוגה דגימות במשך 15 דקות ב 16,000 x g. תגובת שיקוע לתוך צלחת טוב שחור 96 pipet 100 µL. קרא את הדגימות עם fluorometer (nm עירור 485, פליטה 528 ננומטר).

7. ניתוח aflatoxin הכולל

  1. חילוץ מדגם עיבוד של aflatoxin
    1. דוגמאות ליבה יבש בתנור אוויר מאולץ במשך יומיים ב 60 מעלות צלזיוס. שוקל דגימות ולמקם 50 מ ל Erlenmeyer בקבוק עם פקק זכוכית.
    2. בשכונה fume, להוסיף 25 מ ל מתילן כלוריד כל הבקבוק.
      התראה: מתילן כלוריד הוא הפכפך מאוד, והוא נחשב מסוכנים (גירוי, מסרטן). ב- latex ואינו nitrile כפפות בטוחים עבור עבודה עם מתילן כלוריד. להשתמש בכפפות משופר אורגני PolyVinylAlcohol עמיד הממס.
    3. דוגמאות למשך 30 דקות נתנער לכבוד מטרף פעולה פרק כף היד. לאחר 30 דקות, מוזגים את התמצית באמצעות עיגול נייר סינון מחורץ לתוך הספל 80 מ. . בוא הלילה יבש בקבוקונים בשכונה fume
    4. למחרת, להשפריץ מתילן כלוריד (כ- 5 מ"ל) בתוך רים של בקבוקונים יבש מתרוצצות, שופכים לתוך מבחנות זכוכית דראם 2. בקבוקונים. השאירו פתח להתייבש בשכונה fume בן לילה.
  2. ניתוח aflatoxin
    1. להוסיף 4.0 מ ל 80% מתנול: יונים H2O (v/v) כדי בקבוקונים.
    2. שימוש ערכת חילוץ aflatoxin לסינון לטהר מתנול פתרון עם העמודה שסופקו. ניתוח aflatoxin הכולל רמות עם fluorometer, על פי הוראות היצרן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שינוי תירס, מולקולרי ההקרנה של הצמחים הטרנסגניים

עוברי ילדותי של תירס קווי Hi-II היו מומרת באמצעות זן Agrobacterium tumefaciens EHA101 המכיל הווקטור היעד הסופי צמח לבטא את הגן AILP Lablab purpureus תחת השליטה של CaMV 35S יזם. חמישה קווי תירס באופן עצמאי טרנספורמציה היו מתקדמים לדור T6 עבור מחקרים מאוחרים יותר. הצמחים תירס מהונדס היו הרבה יותר קטן, פחות נמרצת, אך לא הראה חריגות אחרות לעומת הצמחים isogenic בקרה שלילית. PCR הגברה של הגן AILP היעד הראה אמפליקון bp 548, נצפתה רק הקווים תירס מהונדס לעומת הצמחים שליטה (איור 4A). הגן AILP הראה ביטוי הקווים הטרנסגניים ואילו אין ביטוי AILP נצפתה ב הצמחים שליטה (איור 4B).

אספרגילוס flavus נבג assay עם עלה תמציות

תמציות עלה גולמי צעיר מתירס מהונדס צמחים הוכנו על ידי טחינת בנוזל N, צריך שתוציאו ב 16,000 x g. נבגים. הנבטת בשלב מוקדם נחשפו החילוץ עלה במשך 20 שעות, אורך hyphal רשע נבג הוקלט מדגימות 20. אורך hyphal מנבגים נחשפים תמציות עלה הטרנסגניים הראה ירידה 58%-80% בהשוואה הפקד שלילי (איור 5)

אספרגילוס flavus הצמיחה במהלך זיהום ליבה

הקרנל הקרנת Assay (קרית גת) בוצעה לבחון את הצמיחה של flavus א בליבות הטרנסגניים ושליטה. ביטוי של הגן AILP ב גרעינים הטרנסגניים מושפעים לרעה flavus א צמיחה. המתח flavus א השתמשו במחקר הנוכחי מכיל כתב GFP המאפשרת את ניטור, כימות של צמיחה פטרייתי בזמן אמת. הפחתה משמעותית של זריחה GFP נצפתה ב הטרנסגניים גרעינים AILP בהשוואה הפקד שלילי isogenic (איור 6). AILP קווים 4 ו-5 הראו ירידה משמעותית צמיחה פטרייתי, 69% ל- 72%, בהתאמה, ואחריו הקווים האחרים שבו נצפתה הפחתה 35% – 60% בהשוואה גרעיני שליטה (איור 7 א).

Aflatoxin ייצור בליבות נגוע

ביטוי heterologous של הגן AILP ב תירס הביא הפחתה משמעותית של תוכן aflatoxin שורות הטרנסגניים לעומת שליטה. Aflatoxin הנתונים מסופקים הנה התוכן aflatoxin הכולל זוהה בליבות נגועים. 62% – 88% צמצום תוכן aflatoxin נצפתה בליבות AILP לעומת הפקד (איור 7 ב). בין השורות AILP 5 שונים, קו 4 הראה את התוכן aflatoxin הנמוך (486 ng/g DW), ואחריו קווים אחרים הנעים בין 640-1,498 ng/g DW בליבות לעומת שליטה (3,986 ng/g DW).

Figure 1
איור 1: וקטור לעיצוב הטרנסגניים ביטוי של גנים Lablab AILP ב תירס. 35S = כרובית פסיפס וירוס או יזם קונסטיטוטיביות CaMV; RB = הגבול הימני; LB = גבולו השמאלי; nptII = neomycin זירוז הפוספולירציה-kanamycin ההתנגדות ג'ין; nos ו- 35s = שעתוק מחסלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ליבה הקרנת Assay. (A, B) לחטא גרעינים ויוצקים לתוך גביע סטרילי בבטיחות הביולוגי ארון. (C – E) לחסן גרעינים עם השעיה נבג flavus א . (F-H) באמצעות מלקחיים סטרילי, מקום גרעינים bioassay מאכל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: האור micrographs של צמיחה flavus א . בקרה שלילית Isogenic (א). (B-F) גרעינים הטרנסגניים לבטא AILP (שורות 1-5) שבוע לאחר חיסון. סרגל קנה מידה = 1 ס מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4. מולקולרי ההקרנה של הצמחים הטרנסגניים. (א) PCR אישור של צמחי תירס מהונדס (מסלולים 1-5) המכיל Lablab AILP (548 bp לאבחון DNA קטע; C = שליטה שלילי isogenic; נב 2-יומן ה-DNA סולם המשמש כסמן דנ א). (B) ביטוי של גנים Lablab AILP בקווים תירס מהונדס (מסלולים 1-5) באמצעות ה-RT-PCR. ליין C מייצג isogenic בקרה שלילית. תירס ribosomal מבנה גנטי (צלעות), GRMZM2G02483819 שימש גן משק בית (סולם הדנ א נב 2-יומן: סמן הדנ א). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5. השפעת עלים גולמי תמציות מצמחים AILP תירס מהונדס על נביטה נבג flavus א לעומת פקד isogenic שליליים (מינוס). כלומר ההפרדה נעשה על ידי posttest של Dunnett לאחר ANOVA. רמות של הפחתה משמעותית מסומנים על ידי כוכביות (* * *P ≤ 0.0001). קווי שגיאה מצביעים על שגיאת תקן של אמצעים דגימות עשרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6- זריחה GFP שמקורם flavus א זן 70-GFP ב גרעינים הטרנסגניים לבטא AILP אחרי שבוע אחד של bioassay. פקדים שלילי isogenic (א) שימשו כדי להעריך את זיהום פטרייתי ולהפיץ ב הטרנסגניים גרעינים (B-F המייצגת הטרנסגניים שורות 1-5). לפחות ארבעה גרעינים הוקרנו עבור כל קו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. סרגל קנה מידה = 2 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: ייצור צמיחה, aflatoxin flavus . (א) flavus ע' 70-GFP זיהום, גידול תירס גרעינים לאחר 7 ימים ב- Assay ההקרנה הקרנל. ממוצע של 3 ניסויים עצמאית עם ארבעה ביולוגית משכפל בכל פעם. GFP כמת (ביחידות יחסית פלורסצנטיות, RFU) מצביע על צמיחה פטרייתי בקווים תירס מהונדס לבטא AILP לפקד שלילי isogenic. כלומר ההפרדה נעשה על ידי posttest של Dunnett לאחר ANOVA. רמות של הפחתה משמעותית זה מסומן על ידי כוכביות (*P ≤ 0.05; * *P ≤ 0.01; * * *P ≤ 0.001). קווי שגיאה מצביעים על שגיאת תקן של אמצעים ארבע אקראי ביולוגי משכפל. (B) הפקה Aflatoxin flavus ע' 70-GFP ב תירס גרעינים לאחר 7 ימים ב- Assay ההקרנה הקרנל. הממוצע של משכפל ביולוגי 12 ואת כל שכפול הכיל ארבעה גרעינים. רמות aflatoxin גרעינים AILP הטרנסגניים (שורות 1-5) לעומת פקד isogenic שליליים (מינוס). כלומר ההפרדה נעשה על ידי posttest של Dunnett לאחר ANOVA. רמות של הפחתה משמעותית זה מסומן על ידי כוכביות (* *P ≤ 0.01; * * *P ≤ 0.001). קווי שגיאה מצביעים על שגיאת תקן של אמצעים ארבע אקראי ביולוגי משכפל. ראה דמויות משלימה כדי להציג את הנתונים בחלונית B ללא הטיה עקב בלימת פטרייתי. סגור את הקורלציה בין ה-GFP = RFU ו- aflatoxin ערכים הינם גם מסופקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Sup Figure 1
משלימה איור 1: נתונים 7 ב איור לצייר להראות aflatoxin הייצור על-ידי flavus ע' 70-GFP ב תירס גרעינים לאחר 7 ימים ב- Assay ההקרנה הקרנל כדי למנוע הטיה עקב בלימת צמיחה פטרייתי. Aflatoxin ערכים חולקו על ידי עיכוב צמיחה פטרייתי מיוצג כפי הערכים באיור 7 בGFP-RFU. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Sup Figure 2
משלימה איור 2: סגור מתאם בין ערכי ה-GFP-RFU (= צמיחה פטרייתי) ורמות aflatoxin (r2 = 0.86 ולגובה) דיווחו על KSA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההפסדים בגידולים חקלאיים בשל פתוגנים מזיקים היא בעיה עולמית20. כיום, יישום של קוטלי פטריות סינטטיים וחומרי הדברה הוא האמצעי השולט על השליטה פתוגנים צמח ומזיקים, אבל שאריות רעילות של אלה ביוכימיקלים ב ואוכל הזנה יכול להוות איום רציני לבריאות האדם ושל בעלי החיים21. בהתחשב החשיבות הכלכלית של תירס מזון, הזנה חיתוך, צמצום או אי-כלילה של זיהום aflatoxin הוא בעל חשיבות עליונה2,3,22. רבייה קונבנציונאלי דרך גן עמידים introgression לתוך זנים רגישים הוא תהליך ממושך ואינו בכזאת התנגדות תמיד יציב aflatoxin ההתנגדות היא תכונה בקשתית, ביטוי של גנים המשתתפים להשתנות באופן משמעותי עם שינויים סביבתיים פרמטרים4. גישות אלטרנטיביות להיות מוערכים להגדיל, לייצב את המארח הצמח הגנה מפני flavus א בצורה ecofriendly.

במחקר הנוכחי, בחרנו להעריך את היעילות של הגן AILP פולי יקינטון ב תירס נגד flavus א. AILP הוא מעכב תחרותי של α-עמילאז, גם סגולות נגד פטריות, אנחנו הביע את הגן הזה תחת מקדם מכוננת חזקה CaMV 35S. המטרה היא להגדיל את הייצור של חלבון זה heterologous ב תירס ללא קשר בשלב התפתחותי או סוג הרקמה. ביטוי משמעותי של הגן α-עמילאז בשורות תירס מהונדס (איור 4AB) תומך יציב ביטוי של גן זה במערכת heterologous. זה מושפעים לרעה צמיחה פטרייתי כפי שניתן לראות מן הירידה התפוצה המרחבית של קרינה פלואורסצנטית GFP בתוך גרגירים AILP נגוע, חסכון הכוללת פלורסצנטיות GFP בליבות (איור 6 ואיור 7 א).

ההתפתחות של הקרנל הקרנת Assay (קרית גת) מנצל מהונדס גנטית flavus א כתב זן לבטא גן קידוד של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מן המדוזה ויקטוריה Aequorea18, 23. לתכנן אסטרטגיות שליטה עבור כל פתוגן, יש צורך להבין את אופן התפשטות הזיהום ואת מושבת בתוך מצמח פונדקאי או רקמה. מושבת ואת התפשטות saprophyte aflatoxigenic, flavus א אינה בריאה הבין כי גנטי ויסות ההתנגדות המחלה, אם קיים, הוא לא הבין היטב. השימוש המתח GFP-לבטא flavus א מאפשר לעקוב בזמן אמת אחר את תהליך זיהום ואת מושבת. המתח GFP הפראי-סוג של לא שונים באופן משמעותי הפתוגן תוקפנות, aflatoxin הפקה23. עם זאת, גן ה-GFP בזן מסוים זה ממוקם תחת השליטה של גליצראלדהיד צורונים ביטוי פוספט דהידרוגנאז (gpdA) ג'ין יזם 24 וזה מתאים יותר למעקב אחר צמיחה פטרייתי. עם זאת, שימוש הכתם הזה על זרעי כותנה, תירס גרעינים, אנחנו הראו ההדוק בין זריחה GFP שמקורם הפטריה צמיחה פטרייתי, aflatoxin רמות18,23.

ליצור קשר קרוב עם aflatoxin בהפקת יכולת, gfp מונע על ידי היזמים ג'ין aflatoxin כגון כאשר אתםA או גרסה-125,26 יהיה יותר מתאים מאשר gpdא ה-GFP הוא רגיש מספיק כדי לאפשר זיהוי, מדידה בזמן אמת של אפילו שינויים קטנים צמיחה פטרייתי, הן במבחנה , הפיסקו, והן הערכה של פעילות המעכבת של חלבונים נוגדי פטרת לא ידוע, פפטידים כמו AILP ואחרים11,17,18,23. בנוסף, תוצאות KSA להרכב טוב השדה ביצועים של קווים תירס עמיד או רגישים לגבי הערכה על זיהום aflatoxin27.

KSA שימושי מאוד במעבדה שלנו המסך בסגנון קלאסי-bred חדש זנים4 , שורות הטרנסגניים11,18. קל להגדיר ולבצע KSA במעבדה כלשהי. צריך להשתמש גרעינים נקי ניזוק לביצוע הזה assay כך הבנה ברורה של אינטראקציה צמח-פטרייתי מארח יוכל להעריך. אנחנו באופן שגרתי לסרוק את כל הגרעינים בהם אנו משתמשים במעבדה שלנו תחת stereomicroscope לפני ביצוע וזמינותו. יצוין, כי התנאים שבהם אנו מעסיקים עבור KSA כוללים לחות גבוהה (95% RH), טמפרטורה קבועה (31 ° C). עם תחילת תהליך הנביטה מדומה בתנאים אלה, וזמינותו מספק תנאים אידיאליים כדי לבדוק את התקינות של קליפת הזרע, המבנה הגנטי של גרגירים כולל גנים/חלבונים נוגדי פטרת מופעל במהלך הנביטה, ו/או פטרייתי זיהום. זיהום פטרייתי וייצור aflatoxin תמיד יהיה גבוה ב KSA בהשוואה התרחשותם בשדה; עם זאת, מתאם קרוב כבר הוקמה4,27.

הראו ב KSA הזה AILP מפחיתה צמיחה פטרייתי ב תירס גרעינים. AILP סגולות נגד פטריות של הצמח לקטינים, הוכח לעכב α-עמילאז, הפחתת פירוק עמילן והגבלת צמיחה פטרייתי. במבחנה מחקרים הראו כי AILP היה מסוגל עיכוב flavus א גידול תפוחי אדמה עשיר סוכר דקסטרוז מרק (PDB) מלאכותי מדיום הגידול, המציין את פעילותה עיכוב גדילה/פטריות היה עצמאי של דיכוי עמילאז שלה פעילות13. לקטינים צמח אחרים מבודד dioica סרפד (סרפד נפוצות), הוואה ברזילאית (עץ הגומי), פקעות יכולת להתקשר אלי סולנום (תפוחי אדמה) גם להציג מאפיינים דומים פטריות ו עכבות צמיחת Botrytis cinerea , Pyrenophora tritici, Fusarium oxysporum28,29,30,31. מעכבי אלפא עמילאז אינם רק יעיל נגד פטריות וחיידקים, אבל היו גם הוכח להיות יעיל נגד חרקים מזיקים32. Amylases אלפא מדווחים להיות ביקורתי רגילה לצמיחה ופיתוח של חרקים האכלה צמח ולאחר מספר מעכבי α חרקים-עמילאז היה מבודד מצמחים כגון חיטה, שעועית נפוצות תירס12,33, 34,35. ירידה משמעותית אורך hyphal ופטריות מנבגים נחשפים עלים גולמי תמציות (איור 5), צמצום צמיחה פטרייתי ב תירס AILP לבטא הגרעינים כפי שמתואר על ידי צמצום GFP פלורסצנטיות בשני איכותית ( איור 6), באופן כמותי (איור 7 א) הוא כנראה משילוב של תכונותיו עיכוב ו פטריות α-עמילאז. ניסויים באמצעות אלה תירס לבטא AILP צמחים נגד פתוגנים אחרים, מזיקים בעתיד יהיה עניין רב כדי לבדוק את יעילותה נגד לחצים ביוטיים מגוונות של זרע ורקמות וגטטיבי. המאפיינים של פטריות ואת הצמיחה עיכוב של לקטין יוחסה בעיקר כדי שלה cross-linking כיטין, עיכוב של הרחבת עצה hyphal28. למעשה, אין ויטרו בתיווך AILP עיכוב של α-amylases ממקורות מגוונים פטרייתי ובקטריאליות הראו מעל 65% עיכוב של פתוגנים ופטריות כולל א flavus, Magnaporthe grisea, Helminthosporium victoriaeו- 41 עיכוב % בהמחלה חיידקי Bacillus subtilis13. התוצאות על הפחתה של צמיחה flavus א המובאות כאן הן בקנה אחד עם תפקידו של α-עמילאז מעכבי כמו סוכני פטריות. המחקר הנוכחי בהמשך מדגים יישום מעשי של מידע שימושי כגון שהתקבלו קודם לכן מחקרים במבחנה.

ירידה aflatoxin תוכן (איור 7 ב) AILP-לבטא קווים תירס הוא כנראה עקב בלימת הפעילות α-עמילאז flavus א , שמוביל מופחתת פירוק של עמילן מאוחסנות, שומן מופחתת רכישה של סוכרים כמו מקור האנרגיה של תירס גרגירים במהלך האינטראקציה פתוגניים. כפי פטרייתי α-עמילאז ממלא תפקיד חשוב בפירוק עמילנים ליבה, כל שינוי בפעילות פטרייתי α-עמילאז על-ידי AILP סביר הפיצולים לתכולת הסוכר מסיסים במהלך זיהום ליבה. תוכן של סוכרים מסיסים, במיוחד סוכרוז, גלוקוז, יש כבר בקורלציה גבוהה עם ייצור מוגבר של aflatoxins1 וסה ' כ AFB תירס, גידולים רגישים נוספים flavus א כגון בוטנים36,37. הגדלת תוכן סוכרוז בתקשורת גדילה מלאכותית מגדיל הייצור aflatoxin flavus א 38. סוכרים מסיסים אחרים כגון גלוקוז, מלטוז לתרום באופן חיובי גם ייצור aflatoxin הן מדיה מלאכותית והן זרע סובסטרטים38. עיכוב של פעילות α-עמילן וצמצום בייצור mycotoxin פטריות אחרים מחזקת את תפקיד חשוב של α-amylases פטרייתי ב ייצור הרעלן במהלך זיהום ליבה. אלפא-עמילאז נוקאאוט מוטציות של verticillioides פ וגם flavus א הצליחה לייצר fumonisin B1 ו- aflatoxins בהתאמה בעקבות זיהום של תירס גרעינים9,10. באופן דומה, למטה-רגולציה של α flavus א -עמילאז הקטינה באופן משמעותי צמיחה פטרייתי וייצור aflatoxin במהלך זיהום גרעיני תירס11. צמצום 62-88% aflatoxin שורות הטרנסגניים הם על פי דו חות קודמים על התפקיד של α-עמילאז בייצור aflatoxin. זה כדי לציין המבחנה ליבה הקרנת Assay (קרית גת) היא מחמירים יותר מאשר בדרך כלל למצוא בתנאים טבעיים. תנאים במהלך וזמינותו במבחנה הם מאוד תורמת לייצור aflatoxin, גם כך אחוז השינוי aflatoxin בתוכן הקווים הטרנסגניים עשוי להיות משמעותי יותר במקום המספרים מוחלטת של תוכן aflatoxin בליבות נגועים. התוצאות המובאות כאן מבטיחות, ניסויים עתידיים בתנאים שדה חשובים לבחון את הפוטנציאל של אלה AILP-לבטא קווים תירס להתנגדות aflatoxin תחת תרחיש טבעי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש אין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

אנו מודים דוד Meints, אוניברסיטת ארקנסו שלו לסיוע בפיתוח ובניתוח של תירס מהונדס במהלך הדורות הראשונים. עבודה זו קיבל סיוע כספי של משרד החקלאות-ARS כריס פרוייקט 6054-42000-025-00D. איזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר זה היא אך ורק לצורך אספקת מידע ספציפי, לא משתמע המלצה או אישור מאת לנו משרד החקלאות. מדיניות הזדמנות שווה בתעסוקה (EEO) של משרד החקלאות-ARS מנדטים שוויון הזדמנויות לכל האנשים, אוסר על אפליה בכל ההיבטים של אנשי מדיניות, שיטות ופעולות של הסוכנות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Caisson
Amazing Marine Goop Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm Fisher Scientific 08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL Ace Glass 6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla Romer Labs COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm Fisher Scientific 09-790-14E
Force Air Oven VWR
FQ-Reader Romer Labs EQFFM3010
Geno/Grinder 2010 OPS Diagnostics SP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves Ansell 012-15-554
Innova 44 Incubator Shaker Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants Nexttec 47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes ThermoFisher Scientific 240835
Phire Plant Direct PCR Kit ThermoFisher Scientific F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml OPS Diagnostics PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm DKW Life Sciences 242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' OPS Diagnostics GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer Biotek
T100 Thermal Cycler Bio-Rad
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
V8 juice Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 Fisher Scientific 09-820P
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
  2. Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
  3. Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
  4. Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies - a review. Food Additives & Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
  5. Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
  6. Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
  7. Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
  8. Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
  9. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
  10. Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
  11. Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
  12. Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
  13. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
  14. Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
  15. Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
  16. Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K. Ch. 22. Plant Embryo Culture. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Humana Press. Methods in Molecular Biology 327-341 (2011).
  17. Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
  18. Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
  19. Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
  20. Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
  21. Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
  22. Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
  23. Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
  24. Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
  25. Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
  26. Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
  27. Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
  28. Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
  29. Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
  30. Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
  31. Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
  32. Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
  33. Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
  34. Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
  35. Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
  36. Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
  37. Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
  38. Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 144 מעכב α-עמילאז aflatoxin flavus אספרגילוס תירס ליבה הקרנת assay Lablab purpureus תירס מהונדס
עיכוב של צמיחה <em>אספרגילוס flavus</em> Aflatoxin ייצור הטרנסגניים תירס לבטא מעכב α-עמילאז מן <em>Lablab purpureus</em> ל'
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rajasekaran, K., Sayler, R. J.,… More

Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Majumdar, R., Sickler, C. M., Cary, J. W. Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the α-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.. J. Vis. Exp. (144), e59169, doi:10.3791/59169 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter