Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

הכנת הגרגירים של גושוקאנג (GSK) בגרגרים בVivo ובניסויים חוץ-גופית

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59171
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education, 4School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

Summary

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט להכנת פתרון העבודה של בגרגרים gushukang עבור לימודי בעלי חיים, גרגר עושה המכיל סרום עבור ניסויים מבחנה. פרוטוקול זה ניתן להחיל על חקירות תרופתי של תרופות צמחיות, כמו גם מרשמים הן בvivo והן בניסויים מבחנה.

Abstract

צמחי מרפא סיניים מסורתיים ממלאים תפקיד כשיטה חלופית בטיפול במחלות רבות, כגון אוסטאופורוזיס בגיל המעבר (POP). Gushukang (GSK) בגרגרים, מרשם משווק בסין, יש השפעות מגן העצם בטיפול POP. לפני המינהל לגוף, אחד הליך ההכנה הסטנדרטי נדרש בדרך כלל, אשר מטרתו לקדם את שחרורו של המרכיבים הפעילים מצמחי מרפא גולמיים ולשפר את ההשפעות תרופתי, כמו גם תוצאות טיפוליות. מחקר זה מציע פרוטוקול מפורט עבור שימוש בגרגרים GSK ב vivo ו ניסיוני מחוץ לבית הספר. המחברים מספקים תחילה פרוטוקול מפורט לחישוב המינונים המתאימים לבעלי חיים של גרגירים בחקירה vivo: שקילה, המסת, אחסון ואדמיניסטרציה. שנית, מאמר זה מתאר פרוטוקולים עבור סריקת מיקרו-CT ומדידת פרמטרי העצם. הכנה לדוגמה, פרוטוקולים להפעלת מכונת מיקרו-CT וכימות של פרמטרי עצם הוערכו. שלישית, סרום, המכיל גרגרי GSK מוכנים, והסרום המכיל תרופות מופק עבור בתוך מבחנה ואוסטאופלסטובגנזה. גרגרי GSK היו intragastrically מנוהל פעמיים ביום לחולדות במשך שלושה ימים רצופים. בלאד נאסף לאחר מכן, מcentrifuged, מופעל ומסונן. לבסוף, הסרום היה מדולל ומשמש לביצוע אוסטאופלסטובגנזה ואוסטאופהסטובגנזה. הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיחשב התייחסות לחקירות תרופתי של תרופות מרשם צמחים, כגון גרגירים.

Introduction

הרפואה הסינית המסורתית (TCM) היא אחת מגישות משלימות וחלופיות חשובות לטיפול באוסטאופורוזיס1,2. רתח מים היא הצורה הבסיסית הנפוצה ביותר של הנוסחה3. עם זאת, החסרונות קיימים גם: טעם רע, אי נוחות לתובלה, חיי מדף קצרים פרוטוקולים לא עקביים, הגבלת השימושים, כמו גם את ההשפעות המרפא. כדי למנוע את החסרונות הנ ל, כמו גם לשאוף להשפעות טובות יותר, הגרגירים פותחו והיה בשימוש נרחב4. למרות מחקרים רבים חקרו את מנגנוני הפרמקולוגית של רכיבים יעילים אחד או יותר מן הגרגירים5,6,7, המנגנון המדויק תהליכים תרופתי הבסיסי עדיין קשה לזהות. הסיבה לכך היא שרכיבים יעילים יותר מדי מגרריר אחד עשויים להפעיל בו השפעות דומות או מנוגדים4. לכן, ההתפתחות של פרוטוקול רגיל אחד כדי להכין את הגרגירים לפני האספקה לגוף לא רק תהיה השפעה רבה על התוצאות הטיפוליות, אלא גם נדרש עבור שניהם בvivo וגם מבחנה.

יתר על כן, את ההשפעות המרפא של גרגירים במרפאה קשה לאשר ולזהות בדיוק באמצעות לימודי חוץ גופית או לשעבר vivo, אשר יוצר אתגר כי מנגנוני הפרמקולוגית מורכבים מדי. כדי לפתור את זה, הכנת סרום המכיל סמים הוצע לראשונה על ידי טסטינוב שנות ה-80. מכאן והלאה, חוקרים רבים מיושמים סרום המכיל תרופות לצמחי מרפא, כולל גרגירים9,10,11. כיום, הבחירה של סרום המכיל תרופות לחקירות מבחנה נחשבת כאסטרטגיה אחת הקרובה מחקה את התנאים הפיזיולוגיים.

גושוקאנג (GSK) בגרגרים פותחו לטיפול באוסטאופורוזיס בגיל המעבר (POP) מבוסס על פרקטיקה קלינית לאור התאוריה של TCM. גרגירים GSK למנוע אובדן העצם ב ovariectomized (OVX) עכברים ב vivo, לעכב את העצם האוסטאופתית ספיגת עצמות, ולעורר osteoblastic עצם היווצרות4. כתוצאה מכך, לי ואח '12 מצאו כי גרגירים gsk יש השפעות מגן העצם ב ovx עכברים על ידי שיפור הפעילות של קולטן סידן כדי לעורר את היווצרות העצם. כדי לאשר את ההשפעות העצם מגן, כמו גם את ההשפעות הפרמקולוגית של גרגרי GSK, המחברים כאן לספק הליך מפורט להכנת פתרונות עבודה ותרופות (granule)-המכיל סרום. יתר על כן, מאמר זה מתאר את היישום של בגרגרים GSK במודל עכבר osteoporotic המושרה ו GSK מכיל סרום לתוך מבחנה מחוץ למבחנה/אוסטאופהסטובגנזה.

גרגרי gsk מורכבים מכמה צמחי מרפא13,14 והוא יכול להיות מומס לחלוטין בקלות מלוחים. לכן, תמיסת מלח משמשת כרכב. עכברים מופעלים (שאם) ועכברים OVX היו בעלי אותו נפח של תמיסת מלח כמו עכברים מנוהל. המינון המקביל של גרגרי GSK עבור העכבר חושבו על בסיס משוואת Meeh-Rubner15. משוואה זו לא רק יש את היתרון של קבלת מינונים בטוחים אלא גם ערבויות השפעות פרמקולוגית15. שלושת המינונים של גרגרים GSK נוצרו כדלקמן: (1) GSKL: OVX + מינון נמוך בגרגרים GSK, 2 g/ק"ג/יום. (2) GSKM: OVX + בינוני מינון בגרגרים GSK, 4 ג'/ק"ג/יום. (3) GSKH: OVX + מינון גבוה בגרגרים GSK, 8 ג'/ק"ג/יום. עכברים בקבוצות GSKL, GSKL ו GSKL היו intragastrically מנוהלים בגרגרים GSK. סידן פחמתי (600 mg/tablet) עם ויטמין D3 (125 יחידה בינלאומית/tablet), למשל, במוצר בוגר ומשווק (g., Caltrate [CAL]) לטיפול ומניעת אוסטאופורוזיס, שימש כשליטה חיובית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים בוצעו עם אישור של טיפול בעלי חיים מוסדיים וועדת השימוש של אוניברסיטת שנגחאי של TCM (SZY201604005).

1. הכנה ואדמיניסטרציה של פתרון העבודה של GSK

  1. לחשב את המינון המקביל של גרגרי GSK לעכבר.
    1. חישוב משטח הגוף מבוסס על משוואת Meeh-Rubner15: משטח הגוף = K x (הגוף משקל2/3)/1000, שם ערכי K הם 10.6 עבור אדם ו9.1 עבור העכבר. בהנחה משקל גוף האדם של 70 ק ג, אז משטח הגוף האנושי (m2) = 10.6 x (702/3)/1000 = 1.8 m2. בהנחה משקל גוף העכבר של 20 גרם (0.02 ק ג; למשל, 1 חודש בן, נקבה, C57/BL6), לאחר מכן גוף העכבר משטח (m2) = 9.1 x (0.022/3)/1000 = 0.0067 m2.
    2. בהתבסס על משטח הגוף המחושב, לחשב את היחס שינוי הגוף לאדם ולעכבר. אדם: 70 ק ג/1.8 m2 = 39. עכבר: 0.02 ק ג/0.0067 m2 = 3. הגרניט GSK = 20 גרם/70 ק"ג x 39/3 = 3.72 g/ק"ג ≈ 4 גרם/ק"ג.
    3. מבוסס על משקל הגוף של 20 גרם לכל עכבר, לחשב את המינון המקביל לעכבר: 4 g/ק"ג x 0.02 ק ג = 0.08 g.
    4. חישוב שלוש מנות שוות ערך של בגרגרים GSK המבוססים על 20 עכברים לכל קבוצה והתערבות שנמשך 3 חודשים (90 ימים): (1) GSKL (המינון הנמוך בגרגרים GSK מינון [2 g/ק"ג/יום]): 0.04 g עכבר/יום x 20 עכברים x 90 ימים = 72 g. (2) GSKM (OVX + בינוני במינון בגרגרים GSK [4 g/ק ג/ יום]: 0.08 g עכבר/יום x 20 עכברים x 90 ימים = 144 g. (3) GSKH (OVX + מינון גבוה בגרגרים GSK [8 ג'/ק"ג/יום]): 0.12 g עכבר/יום x 20 עכברים x 90 ימים = 216 g.
      הערה: הכינו 20% מגרגרי GSK בפועל כדי לקזז את ההפסד.
  2. לחשב את עוצמת הנפח של הגרניט GSK לכל עכבר מבוסס על משקל הגוף15: לדוגמה, נפח (V) = 0.24 mL/עכבר/יום.
    הערה: נפח הניהול הפנימי של העכבר הוא 0.12 mL/10 גרם.
  3. שוקל 10 ימים בשווי של שלוש מנות של גרגרי GSK. שוקל 8 גרם, 16 גרם, ו 24 גרם של גרגרי GSK ולשמש GSKL, GSKM, ו GSKH, בהתאמה.
  4. לחשב את המינון המקבילה של סידן פחמתי עם ויטמין D3 (CAL) עבור העכבר מבוסס על משוואת Meeh-Rubner15 כמו בשלבים 1.1.1 ו 1.1.2: מינון CAL = 2 לוח/70 ק"ג x 39/3 = 0.372 לוח/ק"ג ≈ 0.4 לוח/ק"ג.
  5. מבוסס על משקל גוף של 20 גרם לעכבר (למשל, 1 חודש, נקבה, C57/BL6), לחשב את המינון המקביל של CAL עבור העכבר: 0.4 לוח/ק"ג x 0.02 ק"ג = 0.008 לוח. לאחר מכן לחשב את המינון המקבילה של CAL מבוסס על 20 עכברים לכל קבוצה והתערבות שנמשך 3 חודשים (90 ימים): 0.008 tablet x 20 x 90 = לוחות 14.4. שוקל בשווי של 10 ימים של CAL (1.6 טבליות).
  6. פירוק
    1. מקום 8 g של גרגרי GSK לתוך צינור 50 mL. הוסף 48 מ ל של מלוחים ושפופרת לנער להמיס לחלוטין.
      הערה: התקן לפירוק מלא הוא העדר משקעים. פירוק השלם יכול להיות מאושר נוסף אם מחט gavage יכול לצייר את פתרון העבודה ולאחר מכן לגרש אותו בצורה חלקה.
    2. חזור על שלב 1.5.1 עם 16 גרם ו 24 גרם של גרגרי GSK.
    3. מניחים 1.6 טבליות (בשווי של 10 ימים) של CAL לתוך צינור שפופרת 50 mL. הוסף 48 מ ל של מלוחים ושפופרת לנער להמיס לחלוטין.
      הערה: ניתן לאחסן את פתרונות העבודה ב-4 ° c ומוכנים כל 10 ימים.
  7. ממשל פנימי
    1. אחוז בגב העכבר (בת 1 חודשים, נקבה, C57/BL6) עם העכבר הפונה קדימה ולוודא שהוא נשאר יציב בתנוחה הזאת. לשמור על העכבר רגוע עבור 2-3 דקות לפני הממשל.
      הערה: ודא שהחוקר יכול לראות בבירור את חזית העכבר. ללבוש כפפות כדי למנוע עקיצות העכבר, במיוחד עבור חוקרים חדשים.
    2. מניחים את המחט gavage (גודל:12, 40 מ"מ) בפתרון העבודה של גרגרי GSK ולצייר 0.24 mL של פתרון העבודה.
    3. שים את המחט gavage לתוך העכבר דרך צד אחד של הפה עד מחט gavage מגיע לבטן.
      הערה: כדי לאשר את המחט הgavage הגיע לקיבה: (1) המחט הgavage נתקלת בתחושת ההתנגדות. בינתיים, העכבר מראה את הפעולה של בליעה לפני המחט gavage עובר את היצרות פיזית של הוושט. (2) להזריק כ 0.5 mL של פתרון העבודה לתוך העכבר ולחכות 1 דקות. אם אין פתרון יוצא מהעכבר, משמעות הדבר היא כי מחט gavage הגיע לקיבה.
    4. הכנס את פתרון העבודה של גרגר עושה (0.24 mL/עכבר) לתוך הקיבה ולאחר מכן לצייר את המחט gavage. להחזיר את העכבר לכלוב שלו.
    5. חזור על שלב 1.6.4 עם פתרון ה-CAL והכנס 0.24 mL של פתרון CAL לכל עכבר.
      הערה: הנפח של פתרון CAL מחושב כשלב 1.2.

2. סריקת מיקרו-CT

  1. טי איביה קציר והכנה
    1. Intraperitoneally את העכבר מורדם עם 300 mL/100 גרם של 80 mg/ק"ג היום בעקבות ההתערבות יום 90. השתמש בצביטה במחט של הבהונות כדי לאשר אם העכבר מורדם לחלוטין. . אין תגובה מצביעה על הרדמה מוצלחת ואז להרוג את העכבר עם נקע בצוואר הרחם.
    2. לתקן את העכבר עם שתי הזרועות והרגליים על קצף עם נעצים.
    3. חותכים את העור עם מספריים (גודל: 8.5 ס מ) ו מלקחיים (גודל: 10 ס מ) של הרגליים מן האבותיים לקצה המרוחק ולאחר מכן בציר הקציר.
    4. מיד לשים את הטיטיה לתוך 70% אתיל אלכוהול ולשטוף 3 פעמים.
  2. לעטוף את השוקה השמאלית של העכבר עם קצף ספוג ולשים אותו לתוך צינור לדוגמה (35 מ"מ קוטר, 140 mm אורך).
    הערה: הציר הארוך של הדגימה צריך להיות יחד עם זה של הצינורית לדוגמה. הקפידו על הקצה האבובי של נקודות השוקה למעלה.
  3. הפעלת מכונת הסריקה 80 מיקרו-CT
    1. הפעל את מכונת הסריקה 80 מיקרו-CT בטמפרטורת החדר.
    2. הגדר את הצינורית לדוגמה לתוך מיקרו-CT 80 ולהתחיל סריקה חוצת-חתך עם פרמטרי הסריקה הבאים: גודל פיקסל 15.6 μm, צינור מתח 55 kV, צינור הנוכחי 72 μA, שילוב זמן 200 ms, רזולוציה מרחבית 15.6 μm, פיקסלים ברזולוציה 15.6 μm, מטריצה תמונה 2048 x 2048.
      הערה: עצם הספוגית הוא נבדל מן העצם קליפת העצמות על ידי סריקה מראש. אזור הסריקה של השוקה מוגדר כאזור עצם הספוגית מ 5 מ"מ מתחת לרמת העצמות לקצה המרוחק.
  4. הכמת של פרמטר העצם
    1. לאחר השלמת סריקת חתך מדור, לקבל את התמונות של tibias שמאל.
    2. הגדר את סף הצפיפות ל-245 ל-1000. השתמש בתוכנית מיקרו-CT הערכה V 6.6 למדוד את העצם הבאים פרמטרים: העצם מינרל צפיפות (BMD), העצם נפח מעל נפח הכולל (BV/טלוויזיה), מספר העצם המכונה (Tb. N), בעובי עצם טרבלסי (Tb.Th), כמו גם עצם טרבלסי ההפרדה עצם ( Tb. Sp).

3. הכנת סרום דם לניסויים במבחנה

  1. חישוב
    1. מבוסס על משקל גוף חולדה של 0.2 ק ג (1 חודש בן, נקבה, ספראג-דאולי), לחשב את המינון של granule המינון האנושי/יום x משקל גוף של האדם x K/גוף משקל של עכברוש = 20 גרם/70 ק"ג/יום x 70 ק"ג x K (K = 0.018)/0.2 ק"ג = 2 גר'/ק"ג/
      הערה: K הוא מקדם הטרנספורמציה פרמקולוגית בין האדם והעכבר15 (K = 0.018).
    2. חזור על שלב 3.1.1 וחשב את המינונים הבאים.
      1. חישוב המינון של GSKL: 10 גרם/70 ק"ג/יום x 70 ק"ג x K/0.2 ק ג = 1 g/ק"ג/יום.
      2. חישוב המינון של GSKM: 20 גרם/70 ק"ג/יום x 70 ק"ג x K/0.2 ק ג = 2 g/ק"ג/יום.
      3. חישוב המינון של GSKL: 40 g/70 ק ג/יום x 70 ק"ג x K/0.2 ק"ג = 4 g/ק"ג/יום.
      4. חישוב המינון של CAL: 2 לוח/70 ק ג/יום x 70 ק"ג x K/0.2 ק"ג = 0.2 לוח/ק"ג/יום.
    3. לחשב את המינון הכולל של הגראולה GSK ו-CAL.
      1. לחשב את המינון הכולל של GSKL: 1 g/ק"ג/יום x 0.2 ק"ג x 6 חולדות x 3 ימים = 3.6 g.
      2. לחשב את המינון הכולל של GSKM: 2 g/ק"ג/יום x 0.2 ק"ג x 6 חולדות x 3 ימים = 7.2 g.
      3. לחשב את המינון הכולל של GSKH: 4 g/ק"ג/יום x 0.2 ק"ג x 6 חולדות x 3 ימים = 14.4 g.
      4. חישוב מינון CAL = 0.2 לוח/ק"ג/יום x 0.2 ק"ג x 6 חולדות x 3 ימים = 0.72 לוח.
        הערה: סך של 10 מ ל של הנסיוב GSK המכילים סרום נדרש כדי להכין 100 mL בינונית תרבות (20% GSK מכיל סרום). כל עכברוש (6 חולדות/קבוצה) צפוי לספק 1.5 ל 2 מ ל של הנסיוב GSK מכיל לאחר צנטריפוגה.
    4. לחשב את הנפח של גרגירים GSK להחיל על מבוסס על משקל גוף15: למשל, נפח (V) = 2 מ"ל/עכברוש/יום.
      הערה: נפח הניהול הפנימי של החולדה הוא 0.1 mL/10 g.
  2. שוקלים 3 ימים ' בשווי שלוש מנות של גרגרי GSK. שוקלים 3.6 g, 7.2 g, ו 14.4 g של גרגרי GSK ולשמש GSKL, GSKM, ו GSKH, בהתאמה. שוקל 0.72 מחשב לוח עבור קבוצת ה-CAL.
  3. מניחים 7.2 גרם של גרגרי GSK לתוך צינור 50 mL. הוסף 36 מ ל של מלוחים ושפופרת לנער להמיס לחלוטין. חזור על זה עם 3.6 g ו 14.4 g של גרגרי GSK.
  4. חזור על סעיף 1.6 עבור מינהל הקיבה הפנימי עם 2 מ ל של פתרון עבודה GSK.
    הערה: מנהל את אותו נפח של תמיסת מלח (2 מ ל לעכברוש) כדי להכין סרום ומשמש כקבוצת בקרה ריקה עבור בעלי מבחנה.
  5. הכנת הסרום המכיל GSK
    1. Intraperitoneally את החולדות עם 300 mL/100 גרם של 80 mg/ק"ג 1 h לאחר הממשל האחרון של בגרגרים GSK. כדי לוודא אם החולדה. מורדם לחלוטין . אין תגובה מצביעה על הרדמה מוצלחת
    2. לחשוף את הבטן לתחתית החזה של חולדות באמצעות מספריים הפעלה ישר לאחר לצמצם את העור ואת צפק.
      הערה: כלי הניתוח חייב להיות מעוקר בטמפרטורות גבוהות ולחצים גבוהים לפני השימוש. אזור כירורגי חייב להיות מעוקר עם 70% אתנול במהלך איסוף הדם.
    3. להסיר את רקמת החיבור של אב העורקים הבטן עם נייר טישו כדי לחשוף את כלי הקיבול בבירור.
    4. למשוך דם מאבי העורקים הבטני באמצעות 10 מ"ל, 22 גרם מזרק. ואז להסיר את המחט ולהעביר את הדם 15 מ"ל צינור סטרילי. בדרך כלל, 6-8ml של דם ניתן לקבל מחולדה אחת.
      הערה: כל עכברוש חייב לחיות כאשר הוא מושך דם. מחוון אחד הוא שאבי העורקים הבטני פועם כאשר החולדה חיה. . החולדה מתה אחרי שהוא מושך דם
    5. שמרו על הצינורית זקופה בטמפרטורת החדר במשך 30 עד 60 דקות עד שהדם מתכלה בצינור. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינור ב 500-600 x g עבור 20 דקות. להעביר את כל supernatant (סרום) מקבוצה אחת (6 חולדות) כדי 1 50 מ"ל צינור סטרילי ולנענע כדי לערבב.
    6. הפוך את הסרום על-ידי דגירה ב-56 אמבט מים של ° c במשך 30 דקות. מסנן את הנסיוב באמצעות 0.22-μm-הנקבוביות-גודל הידרופיפילית מסנן polyethersulfone מזרק. חנות at-80 ° צ' לשימוש לטווח ארוך (פחות משנה אחת).
      הערה: ניתן להשתמש בסרום המסונן לאוסטאופהאוסטובגנזה ואוסטאופלסטוגנזה.
  6. יישום
    1. האוסטאופלסטוגנזה
      1. לדלל את שלושת המינונים של הסרום המכיל GSK (GSKL, GSKM, GSKH) ביחס של 1:4 עם המינימום של הנשר הבינוני (α-הגברת) המכיל L-גלוטמין, ribonucleosides, ו deoxyribonucleosides צדדים.
        הערה: יש לוודא שהריכוז הסופי של הסרום המכיל את GSK לצורך הגנה מפני מבחנה ואוסטאופלסטוגנזה הוא 20%.
      2. להוסיף את הסרום מדולל GSK המכילים (200 μL/ובכן) משלב 3.6.1.1 כדי מקרופאגים במח העצם (BMMs) מ 4 לפנות בשבוע הישן C57BL/6 עכברים עבור osteoclastogenesis ולעורר BMMs עם מקרופאג המושבה מגרה גורם (M-שדרתי, 10 ng/mL) והקולטן activator עבור גורמים גרעיניים-κB ליגנד (rankl, 100 ng/mL) כפי שמתואר בעבר2.
    2. מבחנה
      1. חזור על שלב ה3.6.1.1.
      2. להוסיף את הסרום מדולל GSK המכילים (2 מ ל/ובכן) כדי העצם בתאי גזע mesenchymal (BMSCs) מ 4 עד 6 שבועות בן C57BL/6 עכברים כדי ליצור אוסטאופא כמתואר בעבר16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות סריקת מיקרו-CT הראו כי העכברים OVX הראו אובדן עצם משמעותי לעומת עכברים שליטה מלוחים (איור 1A). ההתערבות (90 ימים) של גרגרי GSK הגדילה מאוד את BMD, במיוחד בקבוצת GSKM (איור 1B). הפרמטרים של מבנה העצם, כגון BMD, BV/TV, Tb. N, ו Tb.Th, היו כמותית. הטיפולים הגרתים של GSK הובילו להגדלת BMD, BV/TV, Tb. N ו Tb.Th אך ירד Tb. Sp (איור 1C).

Tartrate חומצה עמידים פוספספטאז (מלכודת) הראתה עלייה במספר האוסטאופתים בעכברים OVX לעומת עכברים לשלוט (איור 2A). הטיפולים הגרתיות של GSK ירדו למלכודת והאוסטאופה חיוביים לעומת קבוצת OVX. ממצאים אלה אושרו על ידי חישוב היחס של אזור מלכודת חיובית כדי משטח העצם טראקטלי (כמובן/BS%) ואת היחס של מספר אוסטאוקלסט לאזור העצם (כמובן/mm2). תוצאות כמותיים אלה הראו ירידה משמעותית במספר האוסטאופתים בקבוצות GSK בהשוואה לקבוצת OVX (איור 2B, C).

הסרום המכיל gsk מכיל את הנסיוב מקרופאגים של מח עצם (bmms) מ 4 עד 6 שבועות הישן C57BL/6 עכברים כדי ליצור אוסטאוקלסט ואת מספר האוסטאופאויום נותחו על ידי כתמים מלכודת. התוצאות הראו כי הסרום מכיל GSK המכיל את מספר האוסטאופה בקבוצות GSK בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 3 א, ב).

בסיס פוספספטאז (ALP) הראה כי GSK הסרום תרופות המופעל השפעות גירוי על osteoblastogenesis עם MSCs מ C57BL/6 עכברים. כתמים ALP הראה כי כל שלוש קבוצות של GSK הסרום תרופות הגדילו את הפעילות של ALP (איור 4A, B) בהשוואה לקבוצת הביקורת.

Figure 1
איור 1: גרגר Gsk מונע אובדן העצם בעכברים המושרה OVX. (א) התייחסו לעכברים בגרגרים gsk למשך 3 חודשים והטיה שמאלית נקצרו כדי לבצע ניתוח מיקרו-CT. הנציגה תלת ממדית (3D) תמונות שחזור של העצם הטראפקאני של הטטיה השמאלית הוצגו. סרגל בקנה מידה = 0.5 מ"מ. (ב) צפיפות מינרל העצם (bmd) נמדד וככמת. (ג) העצם פרמטרים של הטיה שמאל, כגון מספר העצם הטראקטאני (Tb. N), עוצמת העצם מעל הנפח הכולל (BV/TV), בעובי עצם מדומה (Tb.Th), והפרדת עצם הפרדה (Tb. Sp), הקשורים מבנה העצם הטראטיבי בכל הקבוצות הוצגו. GSKL, GSKL, ו GSKL קבוצות הושוו עם שליטה (Con; שאם מלוחים) ואת קבוצת OVX (n = 6, *P < 0.05, לעומת שליטה; *p < 0.05, מול ovx). קאל: סידן פחמתי עם ויטמין D3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: גרגרי GSK לדכא את מספר האוסטאופתיות בעכברים OVX. (א) מלכודת השמנה בוצעה על חוליית המותניים 3 (L3) לאחר העכברים שטופלו gsk נקצרו. מלכודת תוצאות מהפקד (שאם מלוחים), OVX (OVX + מלוחים), CAL (OVX + Caltrate), GSKL (OVX + מינון נמוך GSK, 2 g/ק ג/יום), GSKL (OVX + מינון בינוני GSK, 4 g/ק"ג/יום), ו GSKL (OVX + מינון גבוה GSK, 8 ג/ק"ג/יום) נמדדו ונותחו. סרגל סרגל = 100 יקרומטר (למעלה תמונות) או 50 יקרומטר (התמונות התחתונות). (ב) קוונפיקציה של משטח מכוסה אוסטאופתית מעל פני העצם. (ג) אוסטאוקלסט מספר. הערכים הוביעו כמשמעות של ± שגיאה סטנדרטית של הממוצע (SEM). *P < 0.05, ovx לעומת שליטה (Con); *P < 0.05, קבוצות של CAL או GSKL/GSKL/GSKL לעומת קבוצת ovx. כל הנאמר חזרו על עצמם עם שלושה עכברים לפחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: התרופות מפחיתות את הסרום מפחית את הנסיוב (bmoclastogenesis) מתוך מח עצם מקרופאגים. (א) bmms מ C57BL/6 עכברים (4-6 שבועות בן) נקצרו, ומתורבתים עם M-שדרתי (10 Ng/ml) ו rankl (100 Ng/ml) (שליטה), M-שדרתי ו rankl פלוס gsk, או מתרופות CAL. Osteoclastogenesis הוערך ביום 4 עד 6 על ידי כתמים מלכודת. סרגל קנה מידה = 100 μm. (ב) מספר האוסטאופה שנמשך ככמת. *P < 0.05, קבוצות של GSKL/GSKL/GSKL נגד בקרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הסרום התרופות מקדם אוסטאופלסטובגנזה. (א) העצם בתאי גזע (MSCs) מ C57BL/6 עכברים (4 עד 6 שבועות בן) היו מבודדים וטופלו עם סרום תרופות gsk או CAL. אלפ כתמים בוצע ביום 7 כדי להעריך אוסטאופלאפיסטוג'נסיס. סרגל קנה מידה = 100 μm. (ב) מספר האוסטאופי היה ככמת. *P < 0.05, קבוצות של CAL או GSKL/GSKL/GSKL נגד שליטה. כל הנאמר חזרו על עצמם עם לפחות 3 עכברים או 3 פעמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

גרגירים של סוכני TCM הפכו לאחת הבחירות הנפוצות עבור ניסוחים או מרשמים. גרגירים GSK מורכבים מספר תרופות צמחיות מבוסס על חוויות קליניות או התיאוריה TCM, והם להפעיל אפקטים מרפא טוב יותר עם פחות תופעות לוואי4. לעומת decoction מים, הגרגירים יש יתרונות אלה: טעם טוב, נוחות של משלוח, אחסון לטווח ארוך, פרוטוקול סטנדרטי ואפקטים מרפא עקביים, כמו גם פרודוקטיביות גבוהה יותר. כיום, גרגירים הם אחד מתצורות מרקחת הנפוץ ביותר בשימוש ב-TCM. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים של תופעות תרופתי לומדים עדיין לעתים נדירות. יש צורך לקבוע את הצעדים הקריטיים בהכנת גרגירים כדי לחקור את המנגנון התרופתי הבסיסי.

בעשורים האחרונים, אחד או יותר מרכיבים יעילים הנציג של צמחי מרפא השתמשו בדרך כלל כדי לבצע מולקולרית מאמר ותוצאות תרופתי בשל הבהירות המבנית שלהם. חקירות רבות בוצעו כדי להבין את ההשפעות המרפא עם רכיבים יעילים של TCM צמחים5,6,7. עם זאת, עדיין קשה לחקות מה יקרה בחולה בשל הסביבה המורכבת, עם רכיבים יעילים רבים עובדים יחד. כדי לפתור בעיה זו, חקירות עם גרגירים יכולים לחקור תהליכים תרופתי והינם בחירה אחת בביצוע מחקרים מולקולריים לעומת חקירות עם רכיבים יעילים.

הכנת פתרונות עבודה לגרגירים מכילה ארבעה שלבים בסיסיים. . הצעד הראשון הוא פירוק בגרגרים מעורבבים בדרך כלל מלוחים לאחר ערבוב כדי להשלים התמוססות לפני חקירות נוספות. כמות ורכוש של גרגירים משפיע על הזמן והיציבות של גרגירים בתהליך הפירוק. הווריאציה בזמן הפירוק והיציבות תלויה בצמחי התבלין, בשל המאפיינים הפיזיים, הכימיים והפרמקולוגיים שלהם17. לרעוד נכונה טמפרטורה גבוהה בדרך כלל לקדם ולהבטיח פירוק להשלים של גרגירים. . הצעד הבא הוא ריכוז הנפח המתאים של המינהל הgavage לבעלי חיים נחשב בזהירות והוא נקבע על פי עוצמת הקול של פתרון העבודה. גבנים אוראלי בריכוזים גבוהים, כגון 10 מ ל/ק"ג או יותר, יכול להוביל למספר בעיות הקשורות לקליטה. שונטינג מהיר של פתרון העבודה של גרגירים לתוך התריסריון הוא בעיה נפוצה אחת. בעיות אחרות, כגון שאיפה דלקת ריאות, בשל ריפלוקס פסיבי של פתרון העבודה של גרגירים לתוך הוושט, הם נצפו גם18. סינון הוא השלב השלישי, אשר מסייע המחט gavage להקטין נפח ומונע ממנו להיות סתומים עם גרגרים צמחים, כמו גם מסייע לעיכול של גרגירים. . השלב הרביעי הוא אחסון האחסון של פתרונות עבודה של גרגירים בטמפרטורה נמוכה ( -20 ° c) מבטיח תוצאות טובות יותר.

הגישה לחשב את המינון הביושווה בעלי חיים חשוב כדי לקבוע את ההשפעות של גרגירים בתרגול של TCM. משקל הגוף (mg/ק"ג) והמינים נחשבים בדרך כלל. שטח הגוף (mg/m2) משמש לעתים קרובות כדי לבצע את החישוב19 מכיוון שקצב חילוף החומרים קשור לגודל של בעל החיים הבודד. זה השכל הישר לשקול שני הגוף שטח משקל הגוף, ולכן, משוואת meeh-rubner היה בשימוש, אשר נפוץ בחקירות vivo במחקרים פרמקולוגית19,20.

מספר סוגים של בעלי חיים נבחרים עבור הכנת סרום המכיל תרופות, כגון ארנבים, שרקנים, חולדות ועכברים. עבור בחקירות vivo, אותו מין מועדף. חולדות נבחרו כי הם לא רק לספק נסיוב יותר מאשר עכברים אלא גם קרוב יותר לעכברים במונחים של אבולוציה מאשר בעלי חיים אחרים. המינון המקבילה ב vivo (עכברוש: 7-קיפול של המינון המקביל) ואת השימוש הקליני עבור חולים מומלצים גם. פי עשר המינון המקבילה של בעלי חיים שסופקו סרום אינו מיושם בדרך כלל עבור בחקירות vivo כי מטופלים תאים או איברים יכולים להוביל לתגובות רעילים פוטנציאליים21. שיטות כגון הזרקה, מינהל העור ואינהלציה הם ההליכים הניהוליים הנפוצים ביותר בהתאם לvivo. הממשל בעל פה מgavage. נבחר במחקר הנוכחי תדירות הניהול של האסמים משתנה בין פעם לפעמיים ביום, ותקופת ההתערבות היא 3-14 ימים. האוסף הסופי של דם מבוצע בדרך כלל בתוך 2 h אחרי המינהל האחרון22,23, כאשר ריכוז של גרגירים בדם הוא יציב יחסית ברמת שיא על פי המחקר הקודם24.

סרום מכיל תרופות לצורך מבחנה. לפני השימוש הוא עדיין שנוי במחלוקת חלק מהחוקרים מחזיקים בכך שהיא עלולה לגרום לתגובות בלתי צפויות או לתופעות לוואי, המשפיעות על התוצאות בשל נוכחותם של רכיבים פעילים רבים בסרום, כולל אנזימים, הורמונים, נוגדנים ומשלים25. עם זאת, כמה חוקרים להחזיק את הדעה הנגדית כי רכיבים פעילים יכולים גם להיות מוסרים על ידי תהליך חוסר הפעלה26. כדי להגיע לקרקע אמצעית, הסרום במחקר זה לא הופעל לפני דגירה באמבט מים ב 56 ° c עבור 30 דקות. יתר על כן, הקבוצה סרום ריק נכלל, שבו הסרום מבעלי חיים מלוחים שטופלו משמש, כדי לשלול את תופעות הלוואי האפשריות. לכן, סרום המכיל תרופות עשוי לשמש כשיטה פוטנציאלית לחקור את מנגנוני הפרמקולוגית או תוצאות טיפוליות.

בהשוואה לשיטות דומות, לפרוטוקול כאן יש את היתרונות הבאים: (1) ההבנה. הן במבחנה והן בשיטות vivo משמשות בו זמנית ויכולות לתמוך זו בזו בהשפעות פרמקולוגית. (2) התאמה. רק עכברים וחולדות כלולים כי הם קשורים הדוק. (3) חזרה ליכולת. שני העכברים והעכברושים נרכשים בקלות בעלות נמוכה, וניתן לחזור על השיטות בקלות. (4) עלות נמוכה. The ovx המושרה osteoporotic מודל העכבר משמש בדרך כלל אמין27,28 ניתן לבצע או לרכוש בקלות. לכן, הפרוטוקולים כאן מתאימים יותר לעומת שיטות אחרות לחקר ההשפעות הפרמקולוגית של רפואת צמחים, כגון גרגירים.

עם זאת, ישנן מספר מגבלות על הפרוטוקולים עם גרגרי GSK. ראשית, שלושה מינונים היו מנוהלים, למרות הגרגירים לא מראה נטייה משמעותית תלויי המינון עבור בחקירות vivo. הסיבה לכך עשויה להיות שמינונים למחקרים בעלי חיים אינם רגישים וזמן ההתערבות אינו ארוך מספיק, דבר הדורש בדיקה נוספת. לאחר מכן, נדרשת תקופה ארוכה יותר של התערבות בחקירות מקבילות באמצעות מבחנה. הסרום המכיל תרופות, למרות החוסר הפעלה, עלול לגרום לתופעות לוואי לאחר התערבות ממושכת. שלישית, רק נפח אחד של פתרון העבודה משמש לניהול בעלי חיים, אשר ניתן לשנות במחקרים עתידיים. לבסוף, מינים של בעלי חיים שנבחרו להכנת סרום המכיל תרופות ורוטינות הניהול ניתן לשנות ולהיבדק במחקרים נוספים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים הלאומי המדע הטבעי הקרן של סין (81804116, 81673991, 81770107, 81603643, ו 81330085), התוכנית עבור צוות חדשני, משרד המדע וטכנולוגיה של סין (2015RA4002 כדי WYJ), התוכנית עבור צוות חדשני, משרד החינוך של סין (IRT1270 to WYJ), שנגחאי TCM מרכז רפואי של מחלה כרונית (2017ZZ01010 to WYJ), שלוש שנים פעולה כדי להאיץ את ההתפתחות של תוכנית הרפואה הסינית המסורתית (ZY (2018-2020)-CCCX-3003 כדי WYJ), ו פרויקטים של פיתוח מחקר מפתח לאומי (2018YFC1704302).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM Hyclone
laboratories		 SH30265.018 For cell culture
β-Glycerophosphate Sigma G5422 Osteoblastogenesis
Caltrate (CAL) Wyeth L96625 Animal interventation
C57BL/6 mice SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Ainimal preparation
Dexamethsome Sigma D4902
Dimethyl sulfoxide Sigma D2438 Cell frozen
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Sangon Biotech 60-00-4 Samples treatmnet
Fetal bovine serum Gibco FL-24562 For cell culture
Gushukang granules kangcheng companyin china Z20003255 Herbal prescription
Light microscope Olympus BX50 Olympus BX50 Images for osteoclastogenesis
L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate Sigma A8960-5G Osteoblastogenesis
Microscope Leica DMI300B Osteocast and osteoblast imagine
M-CSF Peprotech AF-300-25-10 Osteoclastogenesis
Μicro-CT Scanco
Medical AG		 μCT80 radiograph microtomograph Bone Structural analsysis
RANKL Peprotech 11682-HNCHF Osteoclastogenesis
Sprague Dawley SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Blood serum collection
Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT TRAP staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).
  2. Zhao, D., et al. The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice. Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).
  3. Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments. Journal of Visualized Experiments. (123), e55654 (2017).
  4. Wang, Q., et al. The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).
  5. Bian, Q., et al. Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro. Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).
  6. Zhao, D., et al. Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).
  7. Tang, D. Z., et al. Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of β-Catenin-BMP Signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).
  8. Tashino, S. "Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).
  9. Fu, L., et al. Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439 (2016).
  10. Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).
  11. Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).
  12. Li, X. L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice. Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).
  13. Cui, S. Q., et al. Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis. Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).
  14. Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study. Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).
  15. Zhang, Y. P. Pharmacology Experiment. , 2nd edition, People’s medical publishing house. Beijing, China. (1996).
  16. Zhao, D. F., et al. Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).
  17. Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
  18. Zhang, D. Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
  19. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human). Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  20. Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).
  21. Jiang, Y. R., et al. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells. Chinese Journal of Integrative Medicine. 18 (1), 30-33 (2012).
  22. Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
  23. Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
  24. Li, Y. K. Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
  25. Zhang, L., et al. A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
  26. Pacifici, R. Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis. Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).
  27. Ammann, P., et al. Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency. Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).
  28. Kimble, R. B., et al. Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period. Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).

Tags

רפואה סוגיה 147 הרפואה הסינית המסורתית Gushukang granule סרום המכיל תרופות סרום פרמקולוגיה osteoclastogenesis עכברים ovariectomized האוסטאופהסטובגנזה ב vivo מבחנה
הכנת הגרגירים של גושוקאנג (GSK) בגרגרים בVivo ובניסויים חוץ-גופית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y., Wang, Q., Liu, S., Wang,… More

Zhao, Y., Wang, Q., Liu, S., Wang, Y., Shu, B., Zhao, D. Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments. J. Vis. Exp. (147), e59171, doi:10.3791/59171 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter