Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Подготовка Гушукан (GSK) Гранулы для In Vivo и In Vitro Эксперименты

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59171
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education, 4School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

Summary

В этой статье содержится подробный протокол для подготовки рабочего решения гранул Гущукана для исследований на животных и гранул ГСК, содержащих сыворотку для экспериментов in vitro. Этот протокол может быть применен к фармакологическим исследованиям травяных лекарств, а также рецепты как для in vivo, так и для экспериментов in vitro.

Abstract

Традиционная китайская травяная медицина играет роль альтернативного метода в лечении многих заболеваний, таких как постменопаузальный остеопороз (POP). Gushukang (GSK) гранулы, на рынке рецепт в Китае, имеют кости защитные эффекты в лечении Pop. Перед введением в организм, одна стандартная процедура подготовки обычно требуется, которая направлена на содействие освобождению активных компонентов из сырых трав и повышения фармакологических эффектов, а также терапевтических результатов. Это исследование предлагает подробный протокол для использования GSK гранулы в in vivo и in vitro экспериментальных анализов. Сначала авторы предоставляют подробный протокол для расчета соответствующих животным доз гранул для исследования in vivo: взвешивания, растворения, хранения и администрирования. Во-вторых, в этой статье описаны протоколы микро-КТ сканирования и измерения параметров костей. Была проведена оценка подготовки образцов, протоколов работы микроКТ-машины и количественной оценки параметров костей. В-третьих, готовятся гранулы ГСК, содержащие сыворотку, а наркосодержащая сыворотка добываема для экстракорпорированного остеокластогенеза и остеобластогенеза. Гранулы ГСК вводили два раза в день крысам в течение трех дней подряд. Затем кровь собирали, центрифугировали, инактивировали и отфильтровывали. Наконец, сыворотка была разбавлена и используется для выполнения остеокластогенеза и остеобластогенеза. Описанный здесь протокол можно считать эталоном фармакологических исследований фитотравных рецептурных препаратов, таких как гранулы.

Introduction

Традиционная китайская медицина (ТКМ) является одним из важных дополнительных и альтернативных подходов к лечению остеопороза1,2. Отвар воды является основной и наиболеечасто используемой формой формулы 3. Однако есть и недостатки: плохой вкус, неудобства для перевозки, короткий срок годности и непоследовательные протоколы, ограничивающие использование, а также лечебные эффекты. Чтобы избежать вышеуказанных недостатков, а также проводить лучшие эффекты, гранулы были разработаны и широко используются4. Хотя многие исследования исследовали фармакологические механизмы одного или более эффективных компонентов из гранул5,6,7, точные механизмы и основные фармакологические процессы по-прежнему трудно определить. Это потому, что слишком много эффективных компонентов из одного гранулы могут одновременно оказывать аналогичные или противоположные эффекты4. Таким образом, разработка одного стандартного протокола для подготовки гранул перед доставкой в организм не только будет иметь большое влияние на терапевтические результаты, но также требуется как для in vivo и in vitro анализы.

Кроме того, лечебные эффекты гранул в клинике трудно подтвердить и точно определить с помощью in vitro или ex vivo исследований, что создает проблему, потому что фармакологические механизмы являются слишком сложными. Для решения этой проблемы, препарат-содержащей сыворотки был впервые предложен Ташино в 1980-х8. С тех пор, многочисленные исследователи применяются препарат-содержащей сыворотки для фитотерапии, в том числе гранулы9,10,11. В настоящее время выбор сыворотки, содержащей наркотики, для исследования in vitro рассматривается как одна из стратегий, которая тесно имитирует физиологические условия.

Гранулы Гушуканга (ГСК) были разработаны для лечения постменопаузального остеопороза (POP) на основе клинической практики в свете теории ТКМ. Гранулы GSK предотвращают потерю костной массы у озвиэктомизированных (OVX) мышей in vivo, подавляют остеокластическую резорбцию костей и стимулируют остеобластическое формирование костей4. Следовательно, Li et al.12 обнаружили, что гранулы GSK обладают костными защитными эффектами у мышей OVX, повышая активность рецепторов кальция для стимуляции формирования костей. Для подтверждения костно-защитного эффекта, а также фармакологических эффектов гранул ГСК авторы здесь предоставляют детальную процедуру подготовки рабочих растворов и препарата (GSK granule)-содержащей сыворотки. Кроме того, в этой статье описывается применение гранул ГСК в модели остеопоротической мыши OVX и Гранул-содержащей GSK сыворотке для экстракорпорированного остеокластогенеза/остеобластогенеза.

Гранулы GSK состоят из нескольких трав13,14 и могут быть полностью растворены в сольном легко. Таким образом, солин служит в качестве транспортного средства. Шам-управляемых мышей (Шам) и OVX мышей вводили такой же объем сольника, как гранулы управляемых мышей. Эквивалентные дозы гранул ГСК для мыши были рассчитаны на основе уравнения Meeh-Rubner15. Это уравнение не только имеет преимущество получения безопасных дозах, но и гарантирует фармакологические эффекты15. Три дозы гранул ГСК были созданы следующим образом: (1) GSKL: OVX - низкодозированные гранулы ГСК, 2 г/кг/день. (2) GSKM: OVX - среднедозные гранулы ГСК, 4 г/кг/день. (3) ГСКХ: OVX - высокодозные гранулы ГСК, 8 г/кг/день. Мыши в группах GSKL, GSKM и GSKH интрагастрически вводили гранулы ГСК. Карбонат кальция (600 мг/таблетка) с витамином D3 (125 международных единиц/таблетка), например, в зрелом и продаваемый продукт (например, кальтрат «CAL» для лечения и профилактики остеопороза, был использован в качестве положительного контроля.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все экспериментальные процедуры были выполнены с одобрения Институционального комитета по уходу и использованию животных Шанхайского университета ТКМ (SY2016040005).

1. Подготовка и администрирование рабочего решения ГСК

  1. Рассчитайте эквивалентные дозы гранул GSK для мыши.
    1. Рассчитайте поверхность тела на основе уравнения Meeh-Rubner15: поверхность тела К х (вес тела2/3)/1000, где значения K 10,6 для человека и 9,1 для мыши. Предполагая, что вес человеческого тела 70 кг, то поверхность человеческого тела (м2) 10,6 х (702/3)/1000 1,8 м2. Предполагая, что вес тела мыши 20 г (0,02 кг; например, 1 месяц, женщина, C57/BL6), затем поверхность тела мыши (м2) 9,1 х (0,022/3)/1000 й 0,0067 м2.
    2. На основе расчетной поверхности тела вычислите коэффициент преобразования тела для человека и мыши. Человек: 70 кг/1,8 м2 и 39. Мышь: 0,02 кг/0,0067 м2 и 3. Гранулы ГСК 20 г/70 кг х 39/3 х 3,72 г/кг 4 г/кг.
    3. Основываясь на массе тела 20 г на мышь, вычислите эквивалентную дозировку для мыши: 4 г/кг х 0,02 кг и 0,08 г.
    4. Рассчитайте три эквивалентные дозы гранул ГСК на основе 20 мышей на группу и вмешательство продолжительностью 3 месяца (90 дней): (1) GSKL (OVX ) низкодозированные гранулы ГСК (2 г/кг/день): 0,04 г мыши/день х 20 мышей х 90 дней день): 0,08 г мыши/день х 20 мышей х 90 дней, 144 г. (3) ГСК (OVX - высокодозные гранулы ГСК, 8 г/кг/день): 0,12 г мыши/день х 20 мышей х 90 дней
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте дополнительные 20% гранул ГСК на практике, чтобы компенсировать потери.
  2. Рассчитайте объем гранул ЫГК на мышь на основе массы тела15:например, объем (V) 0,24 мл/мышь/день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем внутрижелудочного администрирования для мыши составляет 0,12 мл/10 г.
  3. Взвесить 10-дневные суммы трех доз гранул ГСК. Взвешивание 8 г, 16 г и 24 г гранул ГСК и служить в качестве GSKL, GSKM и GSKH, соответственно.
  4. Рассчитайте эквивалентную дозу карбоната кальция с витамином D3 (CAL) для мыши на основе уравнения Meeh-Rubner15, как в шагах 1.1.1 и 1.1.2: Дозировка CAL 2 таблетки/70 кг х 39/3 и 0.372 таблетки/кг 0.4 таблетки/кг.
  5. На основе массы тела 20 г на мышь (например, 1 месяц, женщины, C57/BL6), вычислить эквивалентную дозировку CAL для мыши: 0,4 таблетки/кг х 0,02 кг и 0,008 таблетки. Затем вычислите эквивалентную дозу CAL на основе 20 мышей на группу и вмешательства продолжительностью 3 месяца (90 дней): 0,008 таблетки х 20 х 90 и 14,4 таблетки. Взвесить 10-дневный стоимость CAL (1,6 таблетки).
  6. Растворения
    1. Поместите 8 г гранул ГСК в трубку 50 мл. Добавьте 48 мл сольяила и встряхните трубку, чтобы полностью раствориться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартом для полного растворения является отсутствие отложений. Полное роспуск может быть дополнительно подтверждено, если gavage игла может составить рабочий раствор, а затем изгнать его плавно.
    2. Повторите шаг 1.5.1 с 16 г и 24 г гранул ГСК.
    3. Поместите 1,6 таблетки (стоимость 10 дней) CAL в трубку 50 мл. Добавьте 48 мл сольяила и встряхните трубку, чтобы полностью раствориться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочие решения могут храниться при -4 градусов и готовиться каждые 10 дней.
  7. Интрагастрическое администрирование
    1. Возьмитесь за задней части мыши (1 месяц, женщина, C57/BL6) с мышью вперед и убедитесь, что она остается твердо в этом положении. Держите мышь спокойной в течение 2'3 минут до администрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что исследователь может четко видеть переднюю часть мыши. Носите перчатки, чтобы предотвратить укусы мышей, особенно для новых исследователей.
    2. Поместите иглу гаважа (размер: #12, 40 мм) в рабочий раствор гранул GSK и нарисуйте 0,24 мл рабочего раствора.
    3. Положите gavage иглы в мышь через одну сторону рта, пока gavage иглы достигает желудка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для подтверждения gavage игла достигла желудка: (1) Gavage игла сталкивается с чувством сопротивления. Между тем, мышь показывает действие глотания до gavage игла проходит физическое сужение пищевода. (2) Введите около 0,5 мл рабочего раствора в мышь и подождите 1 минуту. Если нет раствора выходит из мыши, это означает, что gavage игла достигла желудка.
    4. Введите рабочий раствор гранулы ГСК (0,24 мл/мышь) в желудок, а затем вытяните иглу гаваге. Верните мышь в клетку.
    5. Повторите шаг 1.6.4 с раствором CAL и введите 0,24 мл раствора CAL на мышь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем решения CAL рассчитывается как шаг 1.2.

2. Микро-КТ сканирование

  1. T Ибия уборка и подготовка
    1. Интраперитонетически анестезирует мышь 300 мл/100 г 80 мг/кг кетамина на следующий день после 90-дневного вмешательства. Используйте щепотку иглы ног, чтобы подтвердить, является ли мышь полностью обезглавлина. Отсутствие ответа не указывает на успешную анестезию. Затем убить мышь с вывихом шейки матки.
    2. Закрепите мышь руками и ногами на пене с галсами.
    3. Отрежьте кожу ножницами (размер: 8,5 см) и пинцетом (размер: 10 см) ног от проксимальной до дистального конца, а затем собирайте tibias.
    4. Сразу же положить тибии в 70% этилового спирта и вымыть в течение 3 раз.
  2. Оберните левую голени мыши губкой пеной и положите ее в пробную трубку (диаметр 35 мм, длина 140 мм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Длинная ось образца должна быть вместе с осязаевой трубкой образца. Убедитесь, что проксимальный конец голени указывает вверх.
  3. Запуск скан-машины micro-CT 80
    1. Запустите скан-машину микро-CT 80 при комнатной температуре.
    2. Установите образец трубки в микро-CT 80 и начните сканирование поперечного сечения со следующими параметрами сканирования: размер пикселя 15,6 мкм, напряжение трубки 55 кВ, ток трубки 72 мз, время интеграции 200 мс, пространственное разрешение 15,6 мкм, разрешение пикселей 15,6 мкм и матрица изображения 2048 x 2048.
      ПРИМЕЧАНИЕ: отверждающая кость отличается от корковой кости путем предварительного сканирования. Область сканирования голени определяется как отвертки костной области от 5 мм ниже косой плато до дистального конца.
  4. Количественная оценка параметра кости
    1. После завершения сканирования поперечного сечения, получить изображения левой тибиас.
    2. Установите порог плотности до 245–1000. Используйте программу оценки микро-КТ V6.6 для измерения следующих параметров кости: плотность костного минерала (BMD), объем костной ткани над общим объемом (BV/TV), трабекулярный номер кости (Tb.N), трабекулярная толщина костей (Tb.Th), а также разделение костной трабекулярной кости ( Tb.Sp).

3. Подготовка сыворотки крови для экспериментов in vitro

  1. Расчет
    1. На основе крысиного тела вес 0,2 кг (1 месяц, женщина, Sprague-Dawley), рассчитать дозировку ГСК гранулы: человеческая дозировка / день х вес тела человека х К / вес тела крысы 20 г / 70 кг / день х 70 кг х K (K 0,018) / 0,2 кг 2 г/ кг/ кг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: K является фармакологическим коэффициентом трансформации между человеком и мышью15 (K no 0.018).
    2. Повторите шаг 3.1.1 и вычислите следующие дозы.
      1. Рассчитайте дозировку GSKL: 10 г/70 кг/день х 70 кг x K/0.2 кг 1 г/кг/день.
      2. Рассчитайте дозировку GSKM: 20 г/70 кг/день х 70 кг x K/0.2 кг 2 г/кг/день.
      3. Рассчитайте дозировку GSKL: 40 г/70 кг/день х 70 кг x K/0.2 кг 4 г/кг/день.
      4. Рассчитайте дозировку CAL: 2 таблетки /70 кг/день х 70 кг x K/0.2 кг и 0,2 таблетки/кг/день.
    3. Рассчитайте общую дозировку гранул GSK и CAL.
      1. Рассчитайте общую дозировку для GSKL: 1 г/кг/день х 0,2 кг х 6 крыс х 3 дня и 3,6 г.
      2. Рассчитайте общую дозировку для GSKM: 2 г/кг/д/д/днх 0,2 кг х 6 крыс х 3 дня и 7,2 г.
      3. Рассчитайте общую дозировку для GSKH: 4 г/кг/день х 0,2 кг х 6 крыс х 3 дня и 14,4 г.
      4. Рассчитайте дозировку CAL 0,2 таблетки/кг/день х 0,2 кг х 6 крыс х 3 дня и 0,72 таблетки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В общей сложности 10 мл GSK гранулы содержащие сыворотки необходимо подготовить 100 мл культуры среды (20% ГСК гранул-содержащих сыворотки). Каждая крыса (6 крыс/группа), как ожидается, обеспечит 1,5-2 мл Гранулсодержащих Сыворотки GSK после центрифугации.
    4. Рассчитайте объем гранул ГСК на одну крысу на основе массы тела15: например, объем (V) 2 мл/крыса/день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем внутрижелудочного введения для крыс составляет 0,1 мл/10 г.
  2. Взвесить 3-дневные стоит три дозы гранул ГСК. Взвешивание 3,6 г, 7,2 г и 14,4 г гранул ГСК и служить гскл, GSKM и GSKH, соответственно. Взвешивание 0,72 таблетки для группы CAL.
  3. Поместите 7,2 г гранул ГСК в трубку 50 мл. Добавьте 36 мл сольяила и встряхните трубку, чтобы полностью раствориться. Повторите это с 3,6 г и 14,4 г гранул ГСК.
  4. Повторите раздел 1.6 для внутрижелудочного администрирования с рабочим решением 2 мл ГСК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Администрирование того же объема солимного (2 мл на крысу) для подготовки сыворотки и служит пустой контрольной группой для пробирки.
  5. Приготовление Сыворотки, содержащей ГСК
    1. Интраперитонетически обезопажывает крыс 300 мл/100 г 80 мг/кг кетамина 1 ч после последней введения гранул ГСК. Используйте щепотку иглы ног, чтобы подтвердить, является ли крыса полностью обезглавлина. Отсутствие ответа не указывает на успешную анестезию.
    2. Выставить живот на дно грудной клетки крыс с помощью прямых действующих ножниц после обрезки кожи и брюшной полости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургический инструмент должен быть стерилизован при высоких температурах и высоком давлении перед использованием. Хирургическая область должна быть стерилизована с 70% этанола во время сбора крови.
    3. Удалите соединительную ткань брюшной аорты с помощью бумажной бумаги, чтобы подвергнуть сосуду четко.
    4. Нарисуйте кровь из брюшной аорты с помощью шприца 10 мл, 22 G. Затем снимите иглу и перенесите кровь в стерильную трубку 15 мл. Обычно, 6'8 мл крови могут быть получены от одной крысы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая крыса должна быть сохранена жизни при рисовании крови. Одним из показателей является то, что брюшной аорты пульсирует, когда крыса жива. Крыса мертва после того, как кровь срисована.
    5. Держите трубку в вертикальном положении при комнатной температуре в течение 30-60 минут, пока кровь не сгустиется в трубке. Затем центрифуги трубки на 500-600 х г в течение 20 мин. Перенесите все супернатанты (сыворотки) из одной группы (6 крыс) в одну стерильную трубку 50 мл и встряхните, чтобы перемешать.
    6. Инактивируйте сыворотку, инкубируя в водяной бане 56 градусов по Цельсию в течение 30 мин. Фильтруй сыворотку с помощью гидрофильных фильтров для хранения политетерсульфона размером 0,22 мкм. Хранить при -80 градусах по Цельсию для длительного использования (менее 1 года).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отфильтрованная сыворотка может быть использована для витро остеокластогенеза и остеобластогенеза.
  6. Приложения
    1. В пробирке остеокластогенез
      1. Разбавить три дозы ГСК-содержащих сыворотки (GSKL, GSKM, GSKH) в соотношении 1:4 с минимальным среды Орла (з-МЭМ), содержащих L-глутамин, рибонуклеозиды, и деоксирибонуклеозы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что конечная концентрация ГСК-содержащей сыворотки для витро остеокластогенеза и остеообластогенеза составляет 20%.
      2. Добавьте разбавленную ГСК-содержащую сыворотку (200 л/с. ) от шага 3.6.1.1 к макрофагам костного мозга (BMM) от 4-6 недельных мышей C57BL/6 для остеокластогенеза и стимулируют BMM с макрофагом колонии-стимулирующего фактора (M-CSF, 10 ng/mL) и активатера для ядерного фактора-КБ лиганд (RANKL, 100 нг/мл), как уже говорилось ранее2.
    2. В пробирке остеобластогенез
      1. Повторите шаг 3.6.1.1.
      2. Добавьте разбавленную ГСК-содержащую сыворотку (2 мл/ну) к костной мезенхимальной стволовым клеткам (BMSCs) от 4-6 недельных мышей C57BL/6 для генерации остеобласта, как ранее описано16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Результаты микро-КТ сканирования показали, что мыши OVX показали значительную потерю костной массы по сравнению с мышами сольников(рисунок 1A). Вмешательство (90 дней) гранул ГСК значительно увеличило ПРО, особенно в группе ГСКМ(рисунок 1B). Параметры костной структуры, такие как BMD, BV/TV, Tb.N и Tb.Th, были количественно оценены. ГСК granule лечения привело к увеличению BMD, BV / ТВ, Tb.N и Tb.Th но уменьшилась Tb.Sp(рисунок 1C).

Тартрат устойчивых кислотфосфатазы (TRAP) окрашивание показало увеличение числа остеокластов в OVX мышей по сравнению с контрольных мышей (Рисунок 2A). ГСК granul лечения снижение TRAP-положительных остеокластов по сравнению с группой OVX. Эти выводы были подтверждены путем расчета соотношения TRAP-положительной области к трабекулярной костной поверхности (OCs/BS%) и отношение числа остеокластов к области костей (OCs/mm2). Эти количественные результаты показали значительное снижение числа остеокластов в группах ГСК по сравнению с группой OVX(рисунок 2B,C).

GSK гранулы содержащие сыворотки вводили макрофагов костного мозга (BMMs) от 4'6 недель C57BL/6 мышей для получения остеокласта и количество остеокластов был проанализирован TRAP окрашивания. Результаты показали, что ГСК гранулсодержащих сыворотки уменьшили количество TRAP-положительных остеокластов в группах ГСК по сравнению с контрольной группой(рисунок 3A, B).

Окрашивание алкалиной фосфатазы (ALP) показало, что ГСК granule-медикаментозной сыворотки оказывает стимулирующее воздействие на остеобластогенез с MSCs от C57BL/6 мышей. Окрашивание ALP показало, что все три группы GSK гранул-медикаментозной сыворотки увеличили активность ALP(рисунок 4A,B) по сравнению с контрольной группой.

Figure 1
Рисунок 1: Гранулы GSK предотвращает потерю костной массы у мышей, индуцированных OVX. (A) Мыши были обработаны с гранулами GSK в течение 3 месяцев и левой tibias были собраны для выполнения микро-Ct анализа. Были показаны представительные трехмерные (3D) изображения трабекулярной кости левой тибиаса. Шкала бар 0,5 мм. (B) Минеральная плотность костей (BMD) была измерена и количественно. (C) Параметры кости левой тибиас, такие как трабекулярный номер кости (Tb.N), объем кости над общим объемом (BV/TV), трабекулярная толщина костей (Tb.Th) и трабекулярное разделение костей (Tb.Sp), связанные с трабекулярной структурой костей во всех группах были показаны. Группы GSKL, GSKM и GSKH сравнивались с группами управления (Con; sham) и группой OVX (n No 6, P qlt; 0,05, по сравнению с контролем; CAL: Карбонат кальция с витамином D3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Гранулы ГСК подавляют количество остеокластов у мышей OVX. (A) TRAP окрашивание было выполнено на поясничных позвонков 3 (L3) после ГСК лечение мышей были собраны. Trap результаты контроля (фиктивный солен), OVX (OVX ) сольник), CAL (OVX ) кальтрат), GSKL (OVX , низкая доза ГСК, 2 г/кг/день), GSKM (OVX - средняя доза ГСК, 4 г/кг/день) и GSKH (OVX ) высокая доза ГСК, 8 г/кг/день) были измерены и проанализированы. Шкала бар 100 мкм (верхние изображения) или 50 мкм (нижние изображения). (B) Количественная оценка покрытой остеокластами поверхности над поверхностью кости. (C) Остеокласт номер. Значения были выражены как средняя - стандартная ошибка среднего значения (SEM). -П Злт; 0,05, OVX против контроля (Con); P qlt; 0.05, группы CAL или GSKL/GSKM/GSKH против группы OVX. Все анализы были повторены, по крайней мере, с 3 мышами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: GSK гранулы лекарственной сыворотки уменьшает остеокластогенез из макрофагов костного мозга (BMMs). (A) BMMs из C57BL/6 мышей (4-6 недель) были собраны, и культивируется с M-CSF (10 нг/мл) и RANKL (100 нг/мл) (контроль), M-CSF и RANKL плюс GSK, или CAL лекарственные сыворотки. Остеокластогенез был оценен в день 4'6 по TRAP окрашивания. Шкала бар 100 мкм. (B) Количество остеокластов было количественно. -П Злт; 0,05, группы GSKL/GSKM/GSKH против контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: ГСК гранул-медикаментозная сыворотка способствует остеобластогенезу. (A) Костные мезенхимальные стволовые клетки (MSC) от мышей C57BL/6 (4-6 недель) были изолированы и обработаны ССК или CAL лекарственные сыворотки. ALP окрашивание было выполнено в день 7 для оценки остеобластогенеза. Шкала бар 100 мкм. (B) Количество остеобластов было количественно. -П Злт; 0,05, группы CAL или GSKL/GSKM/GSKH против контроля. Все анализы были повторены, по крайней мере 3 мышей или 3 раза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Гранулы агентов ТКМ стали одним из распространенных вариантов для формулировок или рецептов. Гранулы GSK состоят из нескольких травяных лекарств, основанных на клиническом опыте или теории ТКМ, и они оказывают лучшие лечебные эффекты с меньшим количеством побочных эффектов4. По сравнению с отваром воды, гранулы имеют такие преимущества: хороший вкус, удобство доставки, длительное хранение, стандартный протокол и последовательные лечебные эффекты, а также более высокую производительность. В настоящее время гранулы являются одним из наиболее часто используемых аптечных образований в ТКМ. Тем не менее, основные механизмы фармакологических эффектов до сих пор редко изучены. Необходимо определить критические шаги в подготовке гранул для исследования основных фармакологических механизмов.

В последние десятилетия, один или несколько репрезентативных эффективных компонентов из фитотерапии, как правило, используются для выполнения молекулярных анализов и фармакологических результатов из-за их структурной ясности. Многие исследования были проведены, чтобы понять лечебные эффекты с эффективными компонентами из трав TCM5,6,7. Тем не менее, все еще трудно имитировать то, что произойдет у пациента из-за сложной среды, со многими эффективными компонентами, работающими вместе. Чтобы решить эту проблему, исследования с гранулами могут исследовать фармакологические процессы и являются одним из вариантов в проведении молекулярных исследований по сравнению с исследованиями с эффективными компонентами.

Подготовка рабочих решений для гранул содержит четыре основных этапа. Первым шагом является роспуск. Гранулы обычно смешиваются в солей после перемешивания, чтобы полностью раствориться перед дальнейшими исследованиями. Количество и свойство гранул влияет на время и стабильность гранул в процессе растворения. Изменение времени растворения и стабильности зависит от трав, из-за их физических, химических и фармакологических характеристик17. Правильное встряхивание и более высокая температура обычно способствуют и обеспечивают полное растворение гранул. Следующим шагом является концентрация. Надлежащий объем администрирования гаважа для животных тщательно продуман и определяется объемом рабочего раствора. Устные гаважи при высоких концентрациях, таких как 10 мл/кг или более, могут привести к ряду проблем, связанных с поглощением. Быстрый шунтирование рабочего раствора гранул в двенадцатиперстную кишу является одной из распространенных проблем. Другие проблемы, такие как аспирационная пневмония, из-за пассивного рефлюкса рабочего раствора гранул в пищевод, также наблюдаются18. Фильтрация является третьим шагом, который помогает gavage иглы уменьшить объем и предотвращает его от закупорки с травяными гранулами, а также помогает переваривание гранул. Четвертым шагом является хранение. Хранение рабочих растворов гранул при низкой температуре (-20 градусов по Цельсию) гарантирует лучшие результаты.

Подход к расчету биоэквивалентной дозы животных имеет важное значение для определения влияния гранул в практике ТКМ. Вес тела (мг/кг) и видов обычно считаются. Площадь поверхности тела (мг/м2)часто используется для выполнения расчета19, потому что скорость обмена веществ связана с размером отдельного животного. Это здравый смысл, чтобы рассмотреть как площадь поверхности тела и массы тела, и, следовательно, уравнение Meeh-Rubner был использован, который является общим в in vivo исследований в фармакологических исследований19,20.

Несколько видов животных выбираются для приготовления сыворотки, такие как кролики, морские свинки, крысы и мыши. Для исследований in vivo, тот же вид является предпочтительным. Крысы были выбраны, потому что они не только обеспечивают больше сыворотки, чем мышей, но также ближе к мышам с точки зрения эволюции, чем другие животные. Также рекомендуется доза, эквивалентная vivo (крыса: 7-кратная эквивалентная доза) и клиническое использование для пациентов. В десять раз эквивалентная доза сыворотки животных обычно не применяется для исследования in vivo, потому что обработанные клетки или органы могут привести к потенциальным токсическим реакциям21. Такие методы, как инъекция, введение кожи и ингаляция являются широко используемыми процедурами администрирования в соответствии с in vivo администраций. Устное администрирование gavage иглами было выбрано в настоящем изучении. Частота введения гранул варьируется от одного до двух дней в день, а период вмешательства составляет 3–14 дней. Окончательный сбор крови, как правило, осуществляется в течение 2 ч после последней администрации22,23, когда концентрация гранул в крови является относительно стабильным и на пиковом уровне в соответствии с предыдущим исследованием24.

Наркотики содержащие сыворотку для in vitro анализы перед использованием по-прежнему спорным. Некоторые исследователи считают, что это может привести к неожиданным реакциям или побочным эффектам, которые влияют на результаты из-за присутствия многочисленных активных компонентов в сыворотке, в том числе ферментов, гормонов, антител, и дополняет25. Тем не менее, некоторые исследователи придерживаются противоположного мнения, что активные компоненты также могут быть удалены в процессе инактивации26. Чтобы достичь середины земли, сыворотка в этом исследовании была инактивирована перед инкубации в водяной бане при 56 градусах По Цельсия в течение 30 мин. Кроме того, была включена пустая группа сыворотки, в которой используется сыворотка от сольнённо-обработанных животных, чтобы исключить потенциальные побочные эффекты. Таким образом, препарат-содержащей сыворотки может служить в качестве потенциального метода для исследования фармакологических механизмов или терапевтических результатов.

По сравнению с аналогичными методами, протокол здесь имеет следующие преимущества: (1) Всеобъемлющий характер. Методы in vitro и in vivo используются одновременно и могут взаимно поддерживать друг друга в фармакологических эффектах. (2) Пригодность. Только мыши и крысы включены, потому что они тесно связаны между собой. (3) Повторяемость. И мышей, и крыс легко приобрести по низкой цене, и методы могут быть легко повторены. (4) Низкая стоимость. МОДЕЛЬ остеопоротической мыши, индуцированной OVX, широко используется и надежна27,28 и может быть легко сделана или приобретена. Поэтому протоколы здесь более подходят по сравнению с другими методами изучения фармакологических эффектов фитотерапии, таких как гранулы.

Тем не менее, есть несколько ограничений для протоколов с гранулами ГСК. Во-первых, три дозы были введены, хотя гранулы показали не значительные дозо-зависимые тенденции для исследования in vivo. Причина может быть в том, что дозы для исследований на животных не чувствительны и время вмешательства не является достаточно длинным, что требует дальнейшего тестирования. Далее, более длительный период вмешательства необходим для параллельных исследований in vitro. Препарат-содержащей сыворотки, хотя инактивирован, может вызвать побочные эффекты после длительного вмешательства. В-третьих, только один объем рабочего решения используется для управления животными, которые могут быть изменены в будущих исследованиях. Наконец, виды животных, отобранные для приготовления наркосодержащей сыворотки и административных процедур, могут быть изменены и будут протестированы в дальнейших исследованиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 и 81330085), программой инновационной команды, Министерством науки и технологий Китая (2015RA4002 к WYJ), программе для инновационной команды, Министерство науки и технологий Китая (2015RA4002 к WYJ), программе для инновационной команды, Министерство науки и технологий Китая (2015RA4002 к WYJ), программе для инновационной команды, Министерство науки и технологий Китая (2015RA4002 к WYJ), программе для инновационной команды, Министерство науки и технологий Китая (2015RA4002 к WYJ), программа для Инновационная команда, Министерство образования Китая (IRT1270 в WYJ), Шанхайский медицинский центр хронических заболеваний TCM (2017-01010 до WYJ), Три года действий по ускорению разработки плана традиционной китайской медицины (2018-2020)-CCCX-3003 в WYJ), и национальные ключевые проекты в области научно-исследовательских разработок (2018YFC1704302).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM Hyclone
laboratories		 SH30265.018 For cell culture
β-Glycerophosphate Sigma G5422 Osteoblastogenesis
Caltrate (CAL) Wyeth L96625 Animal interventation
C57BL/6 mice SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Ainimal preparation
Dexamethsome Sigma D4902
Dimethyl sulfoxide Sigma D2438 Cell frozen
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Sangon Biotech 60-00-4 Samples treatmnet
Fetal bovine serum Gibco FL-24562 For cell culture
Gushukang granules kangcheng companyin china Z20003255 Herbal prescription
Light microscope Olympus BX50 Olympus BX50 Images for osteoclastogenesis
L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate Sigma A8960-5G Osteoblastogenesis
Microscope Leica DMI300B Osteocast and osteoblast imagine
M-CSF Peprotech AF-300-25-10 Osteoclastogenesis
Μicro-CT Scanco
Medical AG		 μCT80 radiograph microtomograph Bone Structural analsysis
RANKL Peprotech 11682-HNCHF Osteoclastogenesis
Sprague Dawley SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Blood serum collection
Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT TRAP staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).
  2. Zhao, D., et al. The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice. Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).
  3. Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments. Journal of Visualized Experiments. (123), e55654 (2017).
  4. Wang, Q., et al. The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).
  5. Bian, Q., et al. Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro. Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).
  6. Zhao, D., et al. Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).
  7. Tang, D. Z., et al. Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of β-Catenin-BMP Signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).
  8. Tashino, S. "Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).
  9. Fu, L., et al. Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439 (2016).
  10. Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).
  11. Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).
  12. Li, X. L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice. Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).
  13. Cui, S. Q., et al. Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis. Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).
  14. Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study. Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).
  15. Zhang, Y. P. Pharmacology Experiment. , 2nd edition, People’s medical publishing house. Beijing, China. (1996).
  16. Zhao, D. F., et al. Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).
  17. Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
  18. Zhang, D. Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
  19. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human). Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  20. Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).
  21. Jiang, Y. R., et al. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells. Chinese Journal of Integrative Medicine. 18 (1), 30-33 (2012).
  22. Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
  23. Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
  24. Li, Y. K. Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
  25. Zhang, L., et al. A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
  26. Pacifici, R. Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis. Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).
  27. Ammann, P., et al. Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency. Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).
  28. Kimble, R. B., et al. Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period. Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).

Tags

Медицина Выпуск 147 Традиционная китайская медицина гранулы Гушукан лекарственная сыворотка сывороточную фармакологию остеокластогенез овариэктомизированные мыши остеобластогенез in vivo in vitro
Подготовка Гушукан (GSK) Гранулы для In Vivo и In Vitro Эксперименты
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y., Wang, Q., Liu, S., Wang,… More

Zhao, Y., Wang, Q., Liu, S., Wang, Y., Shu, B., Zhao, D. Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments. J. Vis. Exp. (147), e59171, doi:10.3791/59171 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter