Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Klargøring af Gushukang (GSK) granulat til in vivo-og in vitro-forsøg

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59171
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education, 4School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Denne artikel indeholder en detaljeret protokol til forberedelse af en arbejdsopløsning af Gushukang granulat til dyreforsøg og GSK granulat indeholdende serum til in vitro eksperimenter. Denne protokol kan anvendes på farmakologiske undersøgelser af plantelægemidler samt recepter for både in vivo-og in vitro-forsøg.

Abstract

Traditionel kinesisk urtemedicin spiller en rolle som en alternativ metode til behandling af mange sygdomme, såsom postmenopausale osteoporose (POP). Gushukang (GSK) granulat, en markedsført recept i Kina, har knogle beskyttende virkninger i behandling af POP. Før administration til kroppen er en standard forberedelsesprocedure almindeligt påkrævet, som har til formål at fremme frigivelsen af aktive bestanddele fra rå urter og forbedre de farmakologiske virkninger samt terapeutiske resultater. Denne undersøgelse foreslår en detaljeret protokol for anvendelse af GSK granulat i in vivo og in vitro eksperimentelle undersøgelser. Forfatterne først give en detaljeret protokol til at beregne dyret passende doser af granulat til in vivo undersøgelse: vejning, opløsning, opbevaring, og administration. For det andet, denne artikel beskriver protokoller for mikro-CT-scanning og måling af knogle parametre. Prøveforberedelse, protokoller for kørsel af mikro-CT-maskine og kvantificering af knogle parametre blev evalueret. Tredje, serum-holdige GSK granulat er tilberedt, og stof-holdige serum ekstraheres for in vitro osteoclastogenesis og osteoblastogenesis. GSK granulat blev intragastrisk administreret to gange pr. dag til rotter i tre på hinanden følgende dage. Blodet blev derefter indsamlet, centrifugeret, inaktiveret og filtreret. Endelig blev serum fortyndet og anvendt til at udføre osteoclastogenesis og osteoblastogenesis. Den protokol, der er beskrevet her, kan betragtes som en reference for farmakologiske undersøgelser af plantelægemidler, såsom granulat.

Introduction

Traditionel kinesisk medicin (TCM) er en af de vigtige komplementære og alternative tilgange til behandling af osteoporose1,2. Vand afkog er den grundlæggende og mest almindeligt anvendte form af formlen3. Men, ulemper findes også: dårlig smag, ulejlighed for transport, kort holdbarhed og inkonsekvente protokoller, begrænse anvendelser samt helbredende virkninger. For at undgå de ovennævnte ulemper samt at forfølge bedre effekter, granulat blev udviklet og har været almindeligt anvendt4. Selv om mange undersøgelser har undersøgt de farmakologiske mekanismer af en eller flere effektive komponenter fra granulatet5,6,7, er de nøjagtige mekanismer og underliggende farmakologiske processer stadig vanskeligt at identificere. Dette skyldes, at for mange effektive komponenter fra et granul kan samtidig udøve lignende eller modsatrettede effekter4. Derfor vil udviklingen af en standardprotokol til klargøring af granulatet før levering til kroppen ikke kun have en stor indvirkning på de terapeutiske resultater, men er også påkrævet for både in vivo-og in vitro-assays.

Desuden er de helbredende virkninger af granulat i klinikken vanskeligt at bekræfte og præcist identificere ved hjælp af in vitro-eller ex vivo-undersøgelser, hvilket skaber en udfordring, fordi de farmakologiske mekanismer er for komplekse. For at løse dette blev forberedelsen af et stof indeholdende serum først foreslået af Tashino i 1980 ' erne8. Fra da af, talrige forskere anvendt stof-holdige serum til urtemedicin, herunder granulat9,10,11. I øjeblikket er valget af lægemiddel indeholdende serum til in vitro-undersøgelser betragtes som en strategi, der nøje efterligner fysiologiske forhold.

Gushukang (GSK) granulat blev udviklet til behandling af postmenopausale osteoporose (POP) baseret på klinisk praksis i lyset af teorien om TCM. GSK granulat forhindrer knogletab i ovariectomized (OVX) mus in vivo, hæmmer osteoklastisk knogleresorption, og stimulere osteoblastisk knogledannelse4. Derfor fandt Li et al.12 , at GSK granulat har knogle beskyttende virkninger i ovx mus ved at øge aktiviteterne af calcium receptor til at stimulere knogledannelse. For at bekræfte knogle beskyttende virkninger samt de farmakologiske virkninger af GSK granulat, forfatterne her giver en detaljeret procedure for udarbejdelse af arbejds løsninger og narkotika (GSK granule)-indeholdende serum. Desuden beskriver denne artikel anvendelsen af GSK granulat i en OVX-induceret osteoporotisk musemodel og GSK granule-holdige serum for in vitro osteoclastogenesis/osteoblastogenesis.

GSK granulat er sammensat af flere urter13,14 og kan helt opløses i saltvand nemt. Derfor, saltvand fungerer som køretøjet. Sham-opererede mus (Sham) og OVX-mus blev administreret med den samme mængde saltvand som de granule-administrerede mus. De ækvivalente doser af GSK granulat til mus blev beregnet på grundlag af Meeh-Rubner ligningen15. Denne ligning ikke kun har den fordel at opnå sikker doser, men også garanterer farmakologiske virkninger15. De tre doser af GSK granulat blev genereret som følger: (1) GSKL: OVX + lav-dosis GSK granulat, 2 g/kg/dag. (2) GSKM: OVX + medium-dosis GSK granulat, 4 g/kg/dag. (3) GSKH: OVX + højdosis GSK granulat, 8 g/kg/dag. Mus i GSKL, GSKM og GSKH grupper blev intragastrisk administreret GSK granulat. Calciumcarbonat (600 mg/tablet) med vitamin D3 (125 International enhed/Tablet), for eksempel i et modent og markedsført produkt (f. eks. Caltrat [CAL]) til behandling og forebyggelse af osteoporose, blev anvendt som en positiv kontrol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle de eksperimentelle procedurer blev udført med godkendelse af institutionel Animal Care og brug udvalg af Shanghai University of TCM (SZY201604005).

1. klargøring og administration af GSK'S arbejds løsning

  1. Beregn de ækvivalente doser af GSK granulat til mus.
    1. Beregn legemsoverflade baseret på Meeh-Rubner ligningen15: legemsoverflade = k x (legemsvægt2/3)/1000, hvor K-værdierne er 10,6 for mennesker og 9,1 for mus. Under forudsætning af en menneskelig legemsvægt på 70 kg, så menneskelige kroppens overflade (m2) = 10,6 x (702/3)/1000 = 1,8 m2. Under forudsætning af en mus kropsvægt på 20 g (0,02 kg; f. eks., 1 måned gammel, kvinde, C57/BL6), derefter musens legemsoverflade (m2) = 9,1 x (0,022/3)/1000 = 0,0067 m2.
    2. Baseret på den beregnede legemsoverflade beregnes krops transformerings forholdet for mennesker og mus. Menneske: 70 kg/1,8 m2 = 39. Mus: 0,02 kg/0.0067 m2 = 3. GSK granulet = 20 g/70 kg x 39/3 = 3,72 g/kg ≈ 4 g/kg.
    3. Baseret på en legemsvægt på 20 g pr. mus beregnes den ækvivalente dosis for mus: 4 g/kg x 0,02 kg = 0,08 g.
    4. Beregn tre ækvivalente doser af GSK granulat baseret på 20 mus pr. gruppe og en intervention, som varede i 3 måneder (90 dage): (1) GSKL (OVX + lavdosis GSK granulat [2 g/kg/dag]): 0,04 g mus/dag x 20 mus x 90 dage = 72 g. (2) GSKM (OVX + medium-dosis GSK granulat [4 g/kg/ dag]): 0,08 g mus/dag x 20 mus x 90 dage = 144 g. (3) GSKH (OVX + højdosis GSK granulat [8 g/kg/dag]): 0,12 g mus/dag x 20 mus x 90 dage = 216 g.
      Bemærk: Forbered yderligere 20% af GSK-granulatet i praksis for at udligne tabet.
  2. Beregn mængden af GSK granulet per mus baseret på kropsvægt15: f. eks volumen (V) = 0,24 ml/mus/dag.
    Bemærk: volumen for intragastrisk administration til mus er 0,12 mL/10 g.
  3. 10-dages tre doser af GSK granulat. Vejer 8 g, 16 g og 24 g GSK granulat og tjener som henholdsvis GSKL, GSKM og GSKH.
  4. Beregn den ækvivalente dosis af calciumcarbonat med vitamin D3 (CAL) til mus baseret på Meeh-Rubner ligningen15 som i trin 1.1.1 og 1.1.2: Cal dosering = 2 tablet/70 kg x 39/3 = 0,372 tablet/kg ≈ 0,4 tablet/kg.
  5. Baseret på en legemsvægt på 20 g pr. mus (f. eks. 1 måned gammel, kvinde, C57/BL6), beregnes den ækvivalente dosis af CAL til mus: 0,4 tablet/kg x 0,02 kg = 0,008 tablet. Derefter beregnes den ækvivalente dosis CAL baseret på 20 mus pr. gruppe og en intervention, som varer i 3 måneder (90 dage): 0,008 tablet x 20 x 90 = 14,4 tabletter. 10-dages værdi af CAL (1,6 tabletter).
  6. Opløsning
    1. 8 g GSK granulat placeres i et 50 mL rør. Tilsæt 48 mL saltvand, og ryst røret for at opløse det fuldstændigt.
      Bemærk: standarden for fuldstændig opløsning er fraværet af sediment. Fuldstændig opløsning kan bekræftes yderligere, hvis en sonde nål kan udarbejde arbejdsopløsningen og derefter udvise den uden problemer.
    2. Gentag trin 1.5.1 med 16 g og 24 g GSK granulat.
    3. Placer 1,6 tabletter (10-dages værdi) CAL i et 50 mL rør. Tilsæt 48 mL saltvand, og ryst røret for at opløse det fuldstændigt.
      Bemærk: arbejds løsningerne kan opbevares ved-4 °C og forberedes hver 10.
  7. Intragastrisk administration
    1. Tag fat i bagsiden af musen (1 måned gammel, kvinde, C57/BL6), mens musen vender fremad, og sørg for, at den forbliver fast i den position. Hold musen rolig i 2 − 3 minutter før administration.
      Bemærk: Sørg for, at forskeren tydeligt kan se forsiden af musen. Bær handsker for at forhindre muse bid, især for nye forskere.
    2. Placer sonde nålen (størrelse: #12, 40 mm) i arbejdsopløsningen af GSK granulat og træk 0,24 mL af arbejdsopløsningen.
    3. Sæt sonde nålen i musen gennem den ene side af munden, indtil sonde nålen når maven.
      Bemærk: for at bekræfte at sonde nålen har nået maven: (1) sonde nålen støder på følelsen af modstand. I mellemtiden, musen viser virkningen af synke før sonde nålen passerer den fysiske indsnævring af spiserøret. (2) Injicer ca. 0,5 mL af arbejdsopløsningen i musen og vent i 1 min. Hvis der ikke er nogen løsning, der kommer ud af musen, betyder det, at sonde nålen har nået maven.
    4. Injicer arbejdsopløsningen af GSK granulet (0,24 mL/mus) i maven, og træk derefter sonde nålen ud. Vend musen ind i buret.
    5. Gentag trin 1.6.4 med den CAL-opløsning, og Injicer 0,24 mL CAL-opløsning pr. mus.
      Bemærk: mængden af CAL-opløsning beregnes som i trin 1,2.

2. Micro-CT-scanning

  1. T af høst og tilberedning
    1. Intraperitonealt anæstetize mus med 300 mL/100 g 80 mg/kg ketamin dagen efter 90 dages intervention. Brug en nål knivspids tæerne til at bekræfte, om musen er helt bedøvet. Intet svar indikerer succesfuld anæstesi. Derefter dræbe musen med livmoderhalsen dislokation.
    2. Fastgør musen med både arme og ben på skum med tacks.
    3. Skær huden af med en saks (størrelse: 8,5 cm) og pincet (størrelse: 10 cm) af benene fra den proksimale til den distale ende og derefter høste tibias.
    4. Straks sætte forbenede i 70% ethylalkohol og vask for 3 gange.
  2. Wrap venstre skinneben af musen med svamp skum og sætte det i en prøve tube (35 mm diameter, 140 mm længde).
    Bemærk: prøvens lange akse skal være sammen med prøve rørets. Sørg for, at den proksimale ende af skinneben peger opad.
  3. Kørsel af Micro-CT 80 Scan Machine
    1. Start Micro-CT 80 scannings maskinen ved stuetemperatur.
    2. Sæt prøverøret i Micro-CT 80 og start tværsnit scanning med følgende scanningsparametre: pixelstørrelse 15,6 μm, rørspænding 55 kV, Rørstrøm 72 μA, integrations tidspunkt 200 MS, rumlig opløsning 15,6 μm, pixel opløsning 15,6 μm og billed matrix 2048 x 2048.
      Bemærk: den spongiøse knogle skelnes fra den kortikale knogle ved præ-scanning. Skinnebens scanningsområde defineres som det spongiøse knogle område fra 5 mm under tibialplateauet til den distale ende.
  4. Kvantificering af knogle parameter
    1. Når du har gennemført tværsnit scanning, kan du få billederne af venstre tibias.
    2. Indstil tætheds tærsklen til 245 − 1000. Brug Micro-CT-evalueringsprogrammet v 6.6 til at måle følgende knogle parametre: knoglemineraltætheden (BMD), knogle volumen i forhold til total volumen (BV/tv), trabekulær knogle nummer (TB. N), trabekulær knogle tykkelse (TB.th) samt knogle udskillelse af knogletrabecular ( TB. SP).

3. klargøring af blod serum til in vitro-eksperimenter

  1. Beregning
    1. Baseret på en rotte legemsvægt på 0,2 kg (1 måned gammel, kvinde, Sprague-Dawley), beregne doseringen af GSK granule: Human dosering/dag x kropsvægt af menneskelige x K/legemsvægt af rotte = 20 g/70 kg/dag x 70 kg x K (K = 0,018)/0,2 kg = 2 g/kg/dag.
      Bemærk: K er den farmakologiske Transformations koefficient mellem menneske og mus15 (K = 0,018).
    2. Gentag trin 3.1.1 og Beregn følgende doser.
      1. Beregn dosering af GSKL: 10 g/70 kg/dag x 70 kg x K/0,2 kg = 1 g/kg/dag.
      2. Beregn dosering af GSKM: 20 g/70 kg/dag x 70 kg x K/0,2 kg = 2 g/kg/dag.
      3. Beregn dosering af GSKL: 40 g/70 kg/dag x 70 kg x K/0,2 kg = 4 g/kg/dag.
      4. Beregn dosering af CAL: 2 tablet/70 kg/dag x 70 kg x K/0,2 kg = 0,2 tablet/kg/dag.
    3. Beregn den totale dosis af GSK granulet og CAL.
      1. Beregn den totale dosis for GSKL: 1 g/kg/dag x 0,2 kg x 6 rotter x 3 dage = 3,6 g.
      2. Beregn den totale dosis for GSKM: 2 g/kg/dag x 0,2 kg x 6 rotter x 3 dage = 7,2 g.
      3. Beregn den samlede dosis for GSKH: 4 g/kg/dag x 0,2 kg x 6 rotter x 3 dage = 14,4 g.
      4. Beregn CAL dosering = 0,2 tablet/kg/dag x 0,2 kg x 6 rotter x 3 dage = 0,72 tablet.
        Bemærk: i alt 10 mL af GSK granulat indeholdende serum er nødvendig for at tilberede 100 mL dyrkningsmedium (20% GSK granule-indeholdende serum). Hver rotte (6 rotter/gruppe) forventes at give 1,5 − 2 mL af GSK granulat indeholdende serum efter centrifugering.
    4. Beregn mængden af GSK granulat anvendt per rotte baseret på legemsvægt15: fx volumen (V) = 2 ml/rotte/dag.
      Bemærk: volumen for intragastrisk administration for rotte er 0,1 mL/10 g.
  2. Vejer 3-dages tre doser af GSK granulat. Vejer 3,6 g, 7,2 g og 14,4 g GSK granulat og tjener som henholdsvis GSKL, GSKM og GSKH. Vejer 0,72 tablet til den CAL gruppe.
  3. Placer 7,2 g GSK granulat i et 50 mL rør. Tilsæt 36 mL saltvand, og ryst røret for at opløse det fuldstændigt. Gentag dette med 3,6 g og 14,4 g GSK granulat.
  4. Gentag afsnit 1,6 for intragastrisk administration med 2 mL GSK-arbejdsopløsning.
    Bemærk: Administrer den samme mængde saltvand (2 mL pr. rotte) for at tilberede serum og fungerer som en blind kontrolgruppe for in vitro-assays.
  5. Klargøring af det GSK-holdige serum
    1. Intraperitonealt bedøve rotterne med 300 mL/100 g 80 mg/kg ketamin 1 h efter sidste administration af GSK granulat. Brug en nål knivspids tæerne til at bekræfte, om rotten er helt bedøvet. Intet svar indikerer succesfuld anæstesi.
    2. Udsætte maven til bunden af thorax af rotter ved hjælp af lige betjening saks efter incising huden og peritoneum.
      Bemærk: det kirurgiske instrument skal steriliseres ved høje temperaturer og høje tryk før brug. Operationsområdet skal steriliseres med 70% ethanol under blod indsamlingen.
    3. Fjern det bindevæv i abdominal aorta med silkepapir for at udsætte beholderen tydeligt.
    4. Tegn blod fra abdominal aorta ved hjælp af en 10 mL, 22 G sprøjte. Fjern derefter nålen og Overfør blodet til et 15 mL sterilt rør. Normalt kan der opnås 6 − 8 mL blod fra en rotte.
      Bemærk: hver rotte skal holdes levende ved tegning af blod. En indikator er, at abdominal aorta pulserer, når rotten er i live. Rotten er død efter blod lodtrækningen.
    5. Hold røret lodret ved stuetemperatur i 30 − 60 minutter, indtil blodet er clotted i røret. Derefter centrifugeres røret ved 500 − 600 x g i 20 min. Overfør alle supernatanten (serum) fra en gruppe (6 rotter) til 1 50 ml sterilt rør og ryst for at blande.
    6. Inaktivér serum ved at inkube i et 56 °c vandbad i 30 min. Filtrer serummet ved hjælp af et hydrofile polyethersulfonmembraner sprøjte filter med en porestørrelse på 0,22 μm. Opbevares ved-80 °C ved langvarig brug (mindre end 1 år).
      Bemærk: det filtrerede serum kan anvendes til in vitro osteoclastogenesis og osteoblastogenesis.
  6. Program
    1. In vitro osteoclastogenesis
      1. Fortynde de tre doser af det GSK-holdige serum (GSKL, GSKM, GSKH) i forholdet 1:4 med minimum Eagle's medium (α-MEM) indeholdende L-glutamin, ribonucleosides, og deoxyribonucleosides.
        Bemærk: Sørg for, at den endelige koncentration af GSK-holdige serum for in vitro osteoclastogenesis og osteoblastogenesis er 20%.
      2. Tilsæt det fortyndede GSK-holdige serum (200 μL/brønd) fra trin 3.6.1.1 til knoglemarv makrofager (BMMs) fra 4 − 6 uger gamle C57BL/6 mus til osteoclastogenesis og stimulere BMMs med makrofag kolonistimulerende faktor (M-CSF, 10 ng/mL) og receptor aktivator for nuklear faktor-κB ligand (RANKL, 100 ng/mL) som tidligere beskrevet2.
    2. In vitro osteoblastogenesis
      1. Gentag trin 3.6.1.1.
      2. Tilsæt det fortyndede GSK-holdige serum (2 mL/brønd) til knoglemesenchymale stamceller (BMSCs) fra 4 − 6 uger gamle C57BL/6-mus for at generere osteoblastdannelse som tidligere beskrevet16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultaterne af mikro-CT-scanning indikerede, at OVX-musene viste signifikant knogletab sammenlignet med salt kontrolmus (figur 1a). Den intervention (90 dage) af GSK granulat i høj grad øget BMD, især i GSKM gruppen (figur 1b). Knoglestruktur parametrene, såsom BMD, BV/TV, TB. N og Tb.Th, blev kvantificeret. GSK granulet behandlinger førte til øget BMD, BV/TV, TB. N og Tb.Th, men faldt TB. SP (figur 1c).

Tartrat resistent syre fosfatase (TRAP) farvning viste en stigning i antallet af osteoklaster i OVX mus sammenlignet med kontrol mus (figur 2a). GSK granulet-behandlinger reducerede FÆLDE positive osteoklaster sammenlignet med OVX-gruppen. Disse fund blev bekræftet ved at beregne forholdet mellem fælde-positiv område og trabekulær knogle overflade (OCs/BS%) og forholdet mellem osteoklast tallet og knogle området (OCs/mm2). Disse kvantitative resultater viste et signifikant fald i antallet af osteoklaster i GSK-grupperne sammenlignet med OVX-gruppen (figur 2b, C).

GSK-granule-holdige serum blev administreret til knoglemarvs makrofager (BMMs) fra 4 − 6 ugers gamle C57BL/6-mus til at generere osteoklast, og antallet af osteoklaster blev analyseret ved at FÆLDE farvning. Resultaterne viste, at GSK-granule-holdige serum reducerede antallet af FÆLDE positive osteoklaster i GSK-grupperne sammenlignet med kontrolgruppen (figur 3a, B).

Alkalisk fosfatase (ALP) farvning viste, at GSK granule-medicineret serum udøvede stimulerende virkninger på osteoblastogenesis med MSCs fra C57BL/6 mus. ALP-farvning viste, at alle tre grupper af GSK granule-medicineret serum havde øget aktiviteten af ALP (figur 4a, B) sammenlignet med kontrolgruppen.

Figure 1
Figur 1: GSK granulet forebygger knogletab i OVX-inducerede mus. (A) mus blev behandlet med GSK granulat i 3 måneder og venstre forbenede blev høstet for at udføre mikro-CT-analyse. Repræsentative tre-dimensionelle (3D) rekonstruktion billeder af trabekulær knogle af venstre forbenede blev vist. Scale bar = 0,5 mm.B) knoglemineraltætheden (BMD) blev målt og kvantificeret. (C) knogle parametre for venstre tibias, såsom trabekulær knogle nummer (TB. N), knogle volumen over total volumen (BV/tv), trabekulær knogle tykkelse (TB.th), og trabekulær knogle separation (TB. SP), relateret til trabekulær knoglestruktur i alle grupperne blev vist. GSKL-, GSKM-og GSKH-grupperne blev sammenlignet med kontrol (CON; Sham + Saline) og OVX-gruppen (n = 6, *p < 0,05, versus kontrol; *P < 0,05, versus ovx). CAL: calciumcarbonat med vitamin D3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: GSK granulat undertrykker antallet af osteoklaster i OVX-mus. (A) fælde farvning blev udført på lænde hvirvlen 3 (L3) efter at de GSK-behandlede mus blev høstet. FÆLDE resultater fra kontrol (Sham + saltvand), OVX (OVX + saltvand), CAL (OVX + Caltrat), GSKL (OVX + lavdosis GSK, 2 g/kg/dag), GSKM (OVX + medium dosis GSK, 4 g/kg/dag), og GSKH (OVX + høj dosis GSK, 8 g/kg/dag) blev målt og analyseret. Scale bar = 100 μm (top billeder) eller 50 μm (bund billeder). B) kvantificering af den osteoklast dækkede overflade over knogleoverfladen. C) osteoklast nummer. Værdier blev udtrykt som middelværdien ± standardfejl af middelværdien (SEM). *P < 0,05, ovx kontra kontrol (CON); *P < 0,05, grupperne af Cal eller GSKL/GSKM/gskh versus ovx gruppen. Alle assays blev gentaget med mindst 3 mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: GSK granulet medicineret serum nedsætter osteoklastogenese fra knoglemarvs makrofager (BMMs). (A) bmms fra C57BL/6 mus (4 − 6 uger gamle) blev høstet, og dyrkes med M-CSF (10 ng/ml) og rankl (100 ng/ml) (kontrol), M-CSF og rankl plus GSK, eller Cal medicineret serum. Osteoclastogenesis blev vurderet på dag 4 − 6 ved TRAP-farvning. Scale bar = 100 μm. B) antallet af osteoklaster blev kvantificeret. *P < 0,05, grupperne af GSKL/GSKM/GSKH kontra kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: GSK granule-medicineret serum fremmer osteoblastogenesis. (A) knogle mesenchymale stamceller (MSCS) fra C57BL/6 mus (4 − 6 uger gamle) blev isoleret og behandlet med GSK eller Cal medicineret serum. ALP farvning blev udført på dag 7 for at vurdere osteoblastogenesis. Scale bar = 100 μm. B) antallet af osteoblaster blev kvantificeret. *P < 0,05, grupperne Cal eller GSKL/GSKM/GSKH kontra kontrol. Alle assays blev gentaget med mindst 3 mus eller 3 gange. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Granulat af TCM agenter er blevet en af de fælles valg for formuleringer eller recepter. GSK granulat er sammensat af flere plantelægemidler baseret på kliniske erfaringer eller TCM teori, og de udøver bedre helbredende virkninger med færre bivirkninger4. Sammenlignet med vand afkog, granulatet har disse fordele: god smag, bekvemmelighed levering, langsigtet opbevaring, standardprotokol og konsekvente helbredende virkninger, samt højere produktivitet. I øjeblikket, granulat er en af de mest almindeligt anvendte apotek formationer i TCM. De underliggende mekanismer for farmakologiske virkninger er dog stadig sjældent undersøgt. Det er nødvendigt at bestemme de kritiske trin i forberedelsen af granulat til at undersøge de underliggende farmakologiske mekanismer.

I de seneste årtier, en eller flere repræsentative effektive komponenter fra urtemedicin er normalt blevet brugt til at udføre molekylære assays og farmakologiske resultater på grund af deres strukturelle klarhed. Mange undersøgelser er blevet udført for at forstå de helbredende virkninger med effektive komponenter fra TCM urter5,6,7. Men det er stadig svært at efterligne, hvad der vil ske i en patient på grund af det komplekse miljø, med mange effektive komponenter, der arbejder sammen. For at løse dette problem, undersøgelser med granulat kan udforske farmakologiske processer og er ét valg i at udføre molekylære undersøgelser sammenlignet med undersøgelser med effektive komponenter.

Klargøring af arbejds løsninger til granulater indeholder fire grundlæggende trin. Det første skridt er opløsning. Granulat blandes almindeligvis i saltvand efter omrøring for at fuldstændig opløse før yderligere undersøgelser. Mængden og egenskaben for granulatet påvirker tidspunktet og stabiliteten af granulatet under opløsnings processen. Variationen i opløsnings tiden og stabiliteten afhænger af urter, på grund af deres fysiske, kemiske og farmakologiske egenskaber17. Korrekt rystelser og højere temperatur normalt fremme og sikre fuldstændig opløsning af granulat. Det næste skridt er koncentration. Den korrekte mængde af sonde administration for dyr overvejes nøje og bestemmes af volumenet af arbejdsopløsningen. Orale gavages ved høje koncentrationer, såsom 10 mL/kg eller mere, kan føre til flere absorptions relaterede problemer. Hurtig rangning af den arbejdende opløsning af granulat i duodenum er et almindeligt problem. Andre problemer, såsom aspiration lungebetændelse, på grund af den passive refluks af arbejdsopløsningen af granulat i spiserøret, er også observeret18. Filtrering er det tredje trin, som hjælper sonde nålen til at falde i volumen og forhindrer det i at blive tilstoppet med urte granulat, samt aids fordøjelsen af granulat. Det fjerde trin er opbevaring. Opbevaring af arbejdsopløsninger af granulat ved lav temperatur (-20 °C) garanterer bedre resultater.

Tilgangen til beregning af den animalske bioækvivalente dosis er vigtig for at bestemme virkningerne af granulat i praksis af TCM. Legemsvægten (mg/kg) og arterne tages almindeligvis i betragtning. Legemsoverfladearealet (mg/m2) bruges ofte til at udføre beregningen19 , fordi metaboliseringsraten er relateret til størrelsen af det enkelte dyr. Det er sund fornuft at overveje både legemsoverfladeareal og legemsvægt, og derfor blev Meeh-rubner-ligningen anvendt, hvilket er almindeligt i in vivo-undersøgelser i farmakologiske undersøgelser19,20.

Flere slags dyr er valgt til stof-holdige serum præparat, såsom kaniner, marsvin, rotter, og mus. For in vivo undersøgelser foretrækkes den samme art. Rotter blev udvalgt, fordi de ikke kun give mere serum end mus, men er også tættere på mus i form af Evolution end andre dyr. Dosis ækvivalent in vivo (rotte: 7 gange den ækvivalente dosis) og klinisk anvendelse til patienter anbefales også. Ti gange den ækvivalente dosis af de serum-leverede dyr er ikke almindeligt anvendt til in vivo undersøgelser, fordi behandlede celler eller organer kan føre til potentielle toksiske reaktioner21. Metoder som injektion, hudadministration og indånding er de almindeligt anvendte administrationsprocedurer i overensstemmelse med in vivo-administrationer. Oral indgivelse ved sonde nåle blev valgt i nærværende undersøgelse. Administrations frekvensen for granulerne varierer fra én gang til to gange pr. dag, og interventionsperioden er 3 − 14 dage. Den endelige samling af blod er normalt udføres inden for 2 h efter den sidste administration22,23, når koncentrationen af granulat i blodet er forholdsvis stabil og på Peak niveau ifølge en tidligere undersøgelse24.

Stof indeholdende serum til in vitro-assays før brug er stadig kontroversiel. Nogle forskere holder, at det kan resultere i uventede reaktioner eller bivirkninger, som påvirker resultaterne på grund af tilstedeværelsen af talrige aktive komponenter i serum, herunder enzymer, hormoner, antistoffer, og supplerer25. Men, nogle forskere holder den modsatte opfattelse, at aktive komponenter kan også fjernes ved inaktiveringsprocessen26. For at nå en mellemvej blev serum i dette studie inaktiveret før inkubation i et vandbad ved 56 °C i 30 minutter. Desuden blev en tom serum gruppe inkluderet, hvor serum fra salt behandlede dyr anvendes, for at udelukke potentielle bivirkninger. Derfor kan stof-holdige serum fungere som en potentiel metode til at undersøge de farmakologiske mekanismer eller terapeutiske resultater.

Sammenlignet med lignende metoder har protokollen her følgende fordele: (1) fuldstændighed. Både in vitro og in vivo metoder anvendes samtidigt og kan gensidigt støtte hinanden i farmakologiske virkninger. (2) egnethed. Kun mus og rotter er inkluderet, fordi de er nært beslægtede. (3) repeterbarhed. Både mus og rotter er let købes til lave omkostninger, og metoderne kan let gentages. (4) lave omkostninger. Den ovx-inducerede osteoporotiske musemodel er almindeligt anvendt og pålidelig27,28 og kan nemt laves eller købes. Derfor er protokollerne her er mere velegnede i forhold til andre metoder til at studere de farmakologiske virkninger af urtemedicin, såsom granulat.

Der er dog flere begrænsninger for protokollerne med GSK granulat. For det første blev der administreret tre doser, selv om granulatet ikke viste nogen signifikant dosisafhængig tendens til in vivo-undersøgelser. Årsagen kan være, at doser for dyreforsøg ikke er følsomme, og interventions tiden er ikke tilstrækkelig lang, hvilket kræver yderligere testning. Dernæst er der behov for en længere interventionsperiode til in vitro-parallelle undersøgelser. Selvom det er inaktiveret, kan det stof, der indeholder serum, give bivirkninger efter længerevarende indgreb. For det tredje anvendes der kun én mængde arbejdsopløsning til dyre administration, som kan ændres i fremtidige undersøgelser. Endelig kan dyrearter, der er valgt til fremstilling af lægemiddel indeholdende serum og administrations rutiner, ændres og vil blive afprøvet i yderligere undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation i Kina (81804116, 81673991, 81770107, 81603643, og 81330085), programmet for innovative team, Ministeriet for videnskab og teknologi i Kina (2015RA4002 til WYJ), programmet for Innovativt team, Undervisningsministeriet i Kina (IRT1270 til WYJ), Shanghai TCM Medical Center for kronisk sygdom (2017ZZ01010 til WYJ), tre år handling for at fremskynde udviklingen af traditionel kinesisk medicin plan (ZY (2018-2020)-CCCX-3003 til WYJ), og nationale nøgle forsknings udviklingsprojekter (2018YFC1704302).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM Hyclone
laboratories		 SH30265.018 For cell culture
β-Glycerophosphate Sigma G5422 Osteoblastogenesis
Caltrate (CAL) Wyeth L96625 Animal interventation
C57BL/6 mice SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Ainimal preparation
Dexamethsome Sigma D4902
Dimethyl sulfoxide Sigma D2438 Cell frozen
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Sangon Biotech 60-00-4 Samples treatmnet
Fetal bovine serum Gibco FL-24562 For cell culture
Gushukang granules kangcheng companyin china Z20003255 Herbal prescription
Light microscope Olympus BX50 Olympus BX50 Images for osteoclastogenesis
L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate Sigma A8960-5G Osteoblastogenesis
Microscope Leica DMI300B Osteocast and osteoblast imagine
M-CSF Peprotech AF-300-25-10 Osteoclastogenesis
Μicro-CT Scanco
Medical AG		 μCT80 radiograph microtomograph Bone Structural analsysis
RANKL Peprotech 11682-HNCHF Osteoclastogenesis
Sprague Dawley SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Blood serum collection
Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT TRAP staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).
  2. Zhao, D., et al. The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice. Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).
  3. Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments. Journal of Visualized Experiments. (123), e55654 (2017).
  4. Wang, Q., et al. The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).
  5. Bian, Q., et al. Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro. Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).
  6. Zhao, D., et al. Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).
  7. Tang, D. Z., et al. Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of β-Catenin-BMP Signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).
  8. Tashino, S. "Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).
  9. Fu, L., et al. Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439 (2016).
  10. Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).
  11. Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).
  12. Li, X. L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice. Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).
  13. Cui, S. Q., et al. Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis. Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).
  14. Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study. Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).
  15. Zhang, Y. P. Pharmacology Experiment. , 2nd edition, People’s medical publishing house. Beijing, China. (1996).
  16. Zhao, D. F., et al. Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).
  17. Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
  18. Zhang, D. Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
  19. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human). Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  20. Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).
  21. Jiang, Y. R., et al. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells. Chinese Journal of Integrative Medicine. 18 (1), 30-33 (2012).
  22. Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
  23. Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
  24. Li, Y. K. Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
  25. Zhang, L., et al. A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
  26. Pacifici, R. Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis. Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).
  27. Ammann, P., et al. Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency. Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).
  28. Kimble, R. B., et al. Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period. Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).

Tags

Medicin traditionel kinesisk medicin Gushukang granule lægemiddel indeholdende serum serum farmakologi osteoclastogenesis ovariectomized mus osteoblastogenesis in vivo in vitro
Klargøring af Gushukang (GSK) granulat til in vivo-og in vitro-forsøg
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y., Wang, Q., Liu, S., Wang,… More

Zhao, Y., Wang, Q., Liu, S., Wang, Y., Shu, B., Zhao, D. Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments. J. Vis. Exp. (147), e59171, doi:10.3791/59171 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter