Bereiding van Gushukang (GSK) granulaat voor in vivo en in vitro experimenten
Summary
Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding van een werkoplossing van Gushukang granulaat voor dierproeven en GSK-submodule die serum voor in vitro experimenten bevat. Dit protocol kan worden toegepast op farmacologische onderzoeken van kruidengeneesmiddelen, alsmede op recepten voor zowel in vivo als in vitro experimenten.
Abstract
Traditionele Chinese kruidengeneeskunde speelt een rol als een alternatieve methode bij de behandeling van vele ziekten, zoals postmenopauzale osteoporose (POP). Gushukang (GSK) korrels, een op de markt gebrachte recept in China, hebben bot-beschermende effecten in de behandeling van POP. Vóór toediening aan het lichaam, een standaard voorbereidingsprocedure is vaak nodig, die tot doel heeft de vrijlating van actieve bestanddelen van rauwe kruiden bevorderen en verbeteren van de farmacologische effecten, alsmede therapeutische uitkomsten. In deze studie wordt een gedetailleerd protocol voorgesteld voor het gebruik van GSK-korrels in in-vivo-en in-vitro-experimentele testen. De auteurs geven eerst een gedetailleerd protocol voor het berekenen van de dier geschikte doseringen van korrels voor in vivo onderzoek: wegen, oplossen, opslag en administratie. Ten tweede worden in dit artikel de protocollen voor micro-CT-scans en de meting van botparameters beschreven. Monstervoorbereiding, protocollen voor het uitvoeren van de micro-CT-machine en kwantificering van botparameters werden geëvalueerd. Ten derde worden serum bevattende GSK-korrels bereid en wordt het geneesmiddel bevattende serum geëxtraheerd voor in vitro osteoclastogenese en osteoblastogenese. GSK-korrels werden gedurende drie opeenvolgende dagen tweemaal per dag intragastrisch toegediend aan ratten. Vervolgens werd bloed verzameld, gecentrifugeerd, geïnactiveerd en gefilterd. Ten slotte werd serum verdund en gebruikt voor het uitvoeren van osteoclastogenese en osteoblastogenese. Het hier beschreven protocol kan worden beschouwd als een referentie voor farmacologische onderzoeken van geneesmiddelen op kruiden voorschrift, zoals korrels.
Introduction
Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) is een van de belangrijke complementaire en alternatieve benaderingen voor de behandeling van osteoporose1,2. Water afkooksel is de basis en meest gebruikte vorm van de formule3. Echter, nadelen bestaan ook: slechte smaak, ongemak voor het vervoer, korte houdbaarheid en inconsistente protocollen, beperken van het gebruik, evenals de curatieve effecten. Om te voorkomen dat de bovenstaande nadelen en om te streven naar betere effecten, korrels werden ontwikkeld en zijn op grote schaal gebruikt4. Hoewel veel studies hebben onderzocht de farmacologische mechanismen van een of meer effectieve componenten uit de korrels5,6,7, de exacte mechanismen en onderliggende farmacologische processen zijn nog steeds moeilijk te identificeren. Dit komt doordat te veel effectieve componenten uit één korrel gelijktijdig vergelijkbare of tegengestelde effecten4kunnen uitoefenen. Daarom zou de ontwikkeling van een standaardprotocol om de korrels voor te bereiden voordat het aan het lichaam wordt gegeven, niet alleen een grote invloed hebben op de therapeutische resultaten, maar is het ook nodig voor zowel in vivo als in vitro testen.
Bovendien zijn de curatieve effecten van granulaat in de kliniek moeilijk te bevestigen en exact te identificeren met behulp van in vitro-of ex vivo-studies, wat een uitdaging creëert omdat de farmacologische mechanismen te complex zijn. Om dit op te lossen, de voorbereiding van drug-bevattende serum werd voor het eerst voorgesteld door Tashino in de jaren 19808. Vanaf dat moment, talrijke onderzoekers toegepast drug-bevattende serum aan kruidengeneeskunde, met inbegrip van korrels9,10,11. Momenteel wordt de keuze van het medicijn bevattende serum voor in-vitro onderzoeken beschouwd als één strategie die de fysiologische omstandigheden nauwlettend nabootst.
Gushukang (GSK) granulaat werd ontwikkeld om postmenopauzale osteoporose (POP) te behandelen op basis van de klinische praktijk in het licht van de theorie van de TCM. GSK-korrels voorkomen botverlies bij muizen met ovariectomized (OVX) in vivo, remmen osteoclastische botresorptie en stimuleren osteoblastische botvorming4. Bijgevolg constateerden Li et al.12 dat GSK-korrels botbeschermende effecten in ovx-muizen hebben door de activiteiten van de calcium receptor te verbeteren om botvorming te stimuleren. Om de botbeschermende effecten en de farmacologische effecten van GSK-korrels te bevestigen, bieden de auteurs hier een gedetailleerde procedure voor de bereiding van werkoplossingen en geneesmiddelen (GSK-granule) die serum bevatten. Bovendien beschrijft dit artikel de toepassing van GSK-korrels in een OVX-geïnduceerde osteoporotische Mouse-model en GSK-granule-bevattende serum voor in vitro osteoclastogenese/osteoblastogenese.
GSK korrels zijn samengesteld uit verschillende kruiden13,14 en kunnen volledig worden opgelost in zoutoplossing gemakkelijk. Daarom dient Saline als het voertuig. Sham-bediende muizen (Sham) en OVX-muizen werden dezelfde hoeveelheid zoutoplossing toegediend als de met korrels toegediende muizen. De equivalente doses van GSK korrels voor de muis werden berekend op basis van de Meeh-Rubner vergelijking15. Deze vergelijking heeft niet alleen het voordeel van het verkrijgen van veilige doseringen, maar garandeert ook farmacologische effecten15. De drie doseringen van GSK-korrels werden als volgt gegenereerd: (1) GSKL: OVX + low-dose GSK granulaat, 2 g/kg/dag. (2) GSKM: OVX + middel-dosis GSK korrels, 4 g/kg/dag. (3) GSKH: OVX + hoge dosis GSK-korrels, 8 g/kg/dag. Muizen in de GSKL-, GSKM-en GSKH-groepen waren intragastrisch toegediende GSK-korrels. Calcium carbonaat (600 mg/tablet) met vitamine D3 (125 internationale eenheid/Tablet), bijvoorbeeld in een volwassen en op de markt gebracht product (bijvoorbeeld Caltraat [CAL]) voor de behandeling en preventie van osteoporose, werd gebruikt als een positieve controle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Korrels van TCM agenten zijn uitgegroeid tot een van de gemeenschappelijke keuzes voor formuleringen of recepten. GSK-korrels zijn samengesteld uit verschillende kruidengeneesmiddelen op basis van klinische ervaringen of de TCM-theorie, en ze oefenen betere curatieve effecten uit met minder bijwerkingen4. Vergeleken met water afkooksel hebben de korrels deze voordelen: goede smaak, gemak van levering, lange termijn opslag, standaardprotocol en consistente curatieve effecten, evenals een hogere pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gesteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 en 81330085), het programma voor innovatief team, ministerie van Wetenschappen en technologie van China (2015RA4002 naar WYJ), het programma voor Innovatief team, ministerie van onderwijs van China (IRT1270 naar WYJ), Shanghai TCM Medical Center van chronische ziekte (2017ZZ01010 naar WYJ), drie jaar actie om de ontwikkeling van de traditionele Chinese geneeskunde plan (ZY (2018-2020)-CCCX-3003 naar WYJ) te versnellen, en nationale belangrijke onderzoeks-ontwikkelingsprojecten (2018YFC1704302).
Materials
| α-MEM | Hyclone laboratories |
SH30265.018 | For cell culture |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G5422 | Osteoblastogenesis |
| Caltrate (CAL) | Wyeth | L96625 | Animal interventation |
| C57BL/6 mice | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Ainimal preparation |
| Dexamethsome | Sigma | D4902 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | Cell frozen |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Sangon Biotech | 60-00-4 | Samples treatmnet |
| Fetal bovine serum | Gibco | FL-24562 | For cell culture |
| Gushukang granules | kangcheng companyin china | Z20003255 | Herbal prescription |
| Light microscope | Olympus BX50 | Olympus BX50 | Images for osteoclastogenesis |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate | Sigma | A8960-5G | Osteoblastogenesis |
| Microscope | Leica | DMI300B | Osteocast and osteoblast imagine |
| M-CSF | Peprotech | AF-300-25-10 | Osteoclastogenesis |
| Μicro-CT | Scanco Medical AG |
μCT80 radiograph microtomograph | Bone Structural analsysis |
| RANKL | Peprotech | 11682-HNCHF | Osteoclastogenesis |
| Sprague Dawley | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Blood serum collection |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | TRAP staining |
References
- Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).
- Zhao, D., et al. The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice. Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).
- Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments. Journal of Visualized Experiments. (123), e55654 (2017).
- Wang, Q., et al. The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).
- Bian, Q., et al. Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro. Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).
- Zhao, D., et al. Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).
- Tang, D. Z., et al. Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of β-Catenin-BMP Signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).
- Tashino, S. “Serum pharmacology” and “serum pharmaceutical chemistry”: from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).
- Fu, L., et al. Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439 (2016).
- Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).
- Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).
- Li, X. L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice. Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).
- Cui, S. Q., et al. Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis. Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).
- Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study. Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).
- Zhang, Y. P. . Pharmacology Experiment. , (1996).
- Zhao, D. F., et al. Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).
- Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
- Zhang, D. Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
- Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human). Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).
- Jiang, Y. R., et al. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors’ expression in endothelial cells. Chinese Journal of Integrative Medicine. 18 (1), 30-33 (2012).
- Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
- Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
- Li, Y. K. Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
- Zhang, L., et al. A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
- Pacifici, R. Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis. Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).
- Ammann, P., et al. Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency. Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).
- Kimble, R. B., et al. Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period. Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).
