Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Bereiding van Gushukang (GSK) granulaat voor in vivo en in vitro experimenten

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59171
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education, 4School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding van een werkoplossing van Gushukang granulaat voor dierproeven en GSK-submodule die serum voor in vitro experimenten bevat. Dit protocol kan worden toegepast op farmacologische onderzoeken van kruidengeneesmiddelen, alsmede op recepten voor zowel in vivo als in vitro experimenten.

Abstract

Traditionele Chinese kruidengeneeskunde speelt een rol als een alternatieve methode bij de behandeling van vele ziekten, zoals postmenopauzale osteoporose (POP). Gushukang (GSK) korrels, een op de markt gebrachte recept in China, hebben bot-beschermende effecten in de behandeling van POP. Vóór toediening aan het lichaam, een standaard voorbereidingsprocedure is vaak nodig, die tot doel heeft de vrijlating van actieve bestanddelen van rauwe kruiden bevorderen en verbeteren van de farmacologische effecten, alsmede therapeutische uitkomsten. In deze studie wordt een gedetailleerd protocol voorgesteld voor het gebruik van GSK-korrels in in-vivo-en in-vitro-experimentele testen. De auteurs geven eerst een gedetailleerd protocol voor het berekenen van de dier geschikte doseringen van korrels voor in vivo onderzoek: wegen, oplossen, opslag en administratie. Ten tweede worden in dit artikel de protocollen voor micro-CT-scans en de meting van botparameters beschreven. Monstervoorbereiding, protocollen voor het uitvoeren van de micro-CT-machine en kwantificering van botparameters werden geëvalueerd. Ten derde worden serum bevattende GSK-korrels bereid en wordt het geneesmiddel bevattende serum geëxtraheerd voor in vitro osteoclastogenese en osteoblastogenese. GSK-korrels werden gedurende drie opeenvolgende dagen tweemaal per dag intragastrisch toegediend aan ratten. Vervolgens werd bloed verzameld, gecentrifugeerd, geïnactiveerd en gefilterd. Ten slotte werd serum verdund en gebruikt voor het uitvoeren van osteoclastogenese en osteoblastogenese. Het hier beschreven protocol kan worden beschouwd als een referentie voor farmacologische onderzoeken van geneesmiddelen op kruiden voorschrift, zoals korrels.

Introduction

Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) is een van de belangrijke complementaire en alternatieve benaderingen voor de behandeling van osteoporose1,2. Water afkooksel is de basis en meest gebruikte vorm van de formule3. Echter, nadelen bestaan ook: slechte smaak, ongemak voor het vervoer, korte houdbaarheid en inconsistente protocollen, beperken van het gebruik, evenals de curatieve effecten. Om te voorkomen dat de bovenstaande nadelen en om te streven naar betere effecten, korrels werden ontwikkeld en zijn op grote schaal gebruikt4. Hoewel veel studies hebben onderzocht de farmacologische mechanismen van een of meer effectieve componenten uit de korrels5,6,7, de exacte mechanismen en onderliggende farmacologische processen zijn nog steeds moeilijk te identificeren. Dit komt doordat te veel effectieve componenten uit één korrel gelijktijdig vergelijkbare of tegengestelde effecten4kunnen uitoefenen. Daarom zou de ontwikkeling van een standaardprotocol om de korrels voor te bereiden voordat het aan het lichaam wordt gegeven, niet alleen een grote invloed hebben op de therapeutische resultaten, maar is het ook nodig voor zowel in vivo als in vitro testen.

Bovendien zijn de curatieve effecten van granulaat in de kliniek moeilijk te bevestigen en exact te identificeren met behulp van in vitro-of ex vivo-studies, wat een uitdaging creëert omdat de farmacologische mechanismen te complex zijn. Om dit op te lossen, de voorbereiding van drug-bevattende serum werd voor het eerst voorgesteld door Tashino in de jaren 19808. Vanaf dat moment, talrijke onderzoekers toegepast drug-bevattende serum aan kruidengeneeskunde, met inbegrip van korrels9,10,11. Momenteel wordt de keuze van het medicijn bevattende serum voor in-vitro onderzoeken beschouwd als één strategie die de fysiologische omstandigheden nauwlettend nabootst.

Gushukang (GSK) granulaat werd ontwikkeld om postmenopauzale osteoporose (POP) te behandelen op basis van de klinische praktijk in het licht van de theorie van de TCM. GSK-korrels voorkomen botverlies bij muizen met ovariectomized (OVX) in vivo, remmen osteoclastische botresorptie en stimuleren osteoblastische botvorming4. Bijgevolg constateerden Li et al.12 dat GSK-korrels botbeschermende effecten in ovx-muizen hebben door de activiteiten van de calcium receptor te verbeteren om botvorming te stimuleren. Om de botbeschermende effecten en de farmacologische effecten van GSK-korrels te bevestigen, bieden de auteurs hier een gedetailleerde procedure voor de bereiding van werkoplossingen en geneesmiddelen (GSK-granule) die serum bevatten. Bovendien beschrijft dit artikel de toepassing van GSK-korrels in een OVX-geïnduceerde osteoporotische Mouse-model en GSK-granule-bevattende serum voor in vitro osteoclastogenese/osteoblastogenese.

GSK korrels zijn samengesteld uit verschillende kruiden13,14 en kunnen volledig worden opgelost in zoutoplossing gemakkelijk. Daarom dient Saline als het voertuig. Sham-bediende muizen (Sham) en OVX-muizen werden dezelfde hoeveelheid zoutoplossing toegediend als de met korrels toegediende muizen. De equivalente doses van GSK korrels voor de muis werden berekend op basis van de Meeh-Rubner vergelijking15. Deze vergelijking heeft niet alleen het voordeel van het verkrijgen van veilige doseringen, maar garandeert ook farmacologische effecten15. De drie doseringen van GSK-korrels werden als volgt gegenereerd: (1) GSKL: OVX + low-dose GSK granulaat, 2 g/kg/dag. (2) GSKM: OVX + middel-dosis GSK korrels, 4 g/kg/dag. (3) GSKH: OVX + hoge dosis GSK-korrels, 8 g/kg/dag. Muizen in de GSKL-, GSKM-en GSKH-groepen waren intragastrisch toegediende GSK-korrels. Calcium carbonaat (600 mg/tablet) met vitamine D3 (125 internationale eenheid/Tablet), bijvoorbeeld in een volwassen en op de markt gebracht product (bijvoorbeeld Caltraat [CAL]) voor de behandeling en preventie van osteoporose, werd gebruikt als een positieve controle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Shanghai Universiteit van TCM (SZY201604005).

1. voorbereiding en toediening van de werkoplossing van GSK

  1. Bereken de equivalente doses van GSK granulaat voor muis.
    1. Bereken het lichaamsoppervlak op basis van de Meeh-Rubner vergelijking15: lichaamsoppervlak = K x (lichaamsgewicht2/3)/1000, waarbij de K-waarden 10,6 zijn voor de mens en 9,1 voor de muis. Uitgaande van een menselijk lichaamsgewicht van 70 kg, dan is het menselijk lichaamsoppervlak (m2) = 10,6 x (702/3)/1000 = 1,8 m2. Uitgaande van een muis lichaamsgewicht van 20 g (0,02 kg; bijv., 1 maand oud, vrouwelijk, C57/BL6), dan is het lichaamsoppervlak van de muis (m2) = 9,1 x (0,022/3)/1000 = 0,0067 m2.
    2. Bereken op basis van het berekende lichaamsoppervlak de lichaams transformatie ratio voor mens en muis. Menselijk: 70 kg/1.8 m2 = 39. Muis: 0,02 kg/0.0067 m2 = 3. GSK-submodule = 20 g/70 kg x 39/3 = 3,72 g/kg ≈ 4 g/kg.
    3. Bereken op basis van een lichaamsgewicht van 20 g per muis de equivalente dosering voor de muis: 4 g/kg x 0,02 kg = 0,08 g.
    4. Bereken drie equivalente doses GSK-korrels op basis van 20 muizen per groep en een tussenkomst van 3 maanden (90 dagen): (1) GSKL (OVX + low-dose GSK-korrels [2 g/kg/dag]): 0,04 g muis/dag x 20 muizen x 90 dagen = 72 g. (2) GSKM (OVX + middel-dosis GSK korrels [4 g/kg/ dag]): 0,08 g muis/dag x 20 muizen x 90 dagen = 144 g. (3) GSKH (OVX + hoge dosis GSK korrels [8 g/kg/dag]): 0,12 g muis/dag x 20 muizen x 90 dagen = 216 g.
      Opmerking: bereid 20% van de GSK-korrels in de praktijk voor om het verlies te compenseren.
  2. Bereken het volume van de GSK-korrel per muis op basis van het lichaamsgewicht15: bijvoorbeeld volume (V) = 0,24 ml/muis/dag.
    Opmerking: het volume voor intragastrische toediening voor de muis is 0,12 mL/10 g.
  3. Weeg 10 dagen aan drie doses GSK-korrels af. Weeg 8 g, 16 g en 24 g GSK-korrels af en dienen respectievelijk als GSKL, GSKM en GSKH.
  4. Bereken de equivalente dosis calciumcarbonaat met vitamine D3 (CAL) voor de muis op basis van de Meeh-Rubner vergelijking15 zoals in de stappen 1.1.1 en 1.1.2: CAL dosering = 2 Tablet/70 kg x 39/3 = 0,372 Tablet/kg ≈ 0,4 Tablet/kg.
  5. Op basis van een lichaamsgewicht van 20 g per muis (bijv. 1 maand oud, vrouwelijk, C57/BL6), bereken de equivalente dosering van CAL voor muis: 0,4 Tablet/kg x 0,02 kg = 0,008 Tablet. Bereken vervolgens de equivalente dosis CAL op basis van 20 muizen per groep en een tussenkomst van 3 maanden (90 dagen): 0,008 Tablet x 20 x 90 = 14,4 tabletten. Weeg 10 dagen aan CAL (1,6 tabletten).
  6. Ontbinding
    1. Plaats 8 g GSK-korrels in een buis van 50 mL. Voeg 48 mL zoutoplossing en schud buis toe om volledig op te lossen.
      Opmerking: de standaard voor volledige ontbinding is de afwezigheid van sediment. Volledige ontbinding kan verder worden bevestigd als een maagsonde de werkoplossing kan opstellen en deze vervolgens soepel uitzetten.
    2. Herhaal stap 1.5.1 met 16 g en 24 g GSK-korrels.
    3. Plaats 1,6 tabletten (10-dagen ' Worth) CAL in een tube van 50 mL. Voeg 48 mL zoutoplossing en schud buis toe om volledig op te lossen.
      Opmerking: de werkoplossingen kunnen bij-4 °C worden bewaard en elke 10 dagen worden klaargemaakt.
  7. Intragastrische toediening
    1. Pak de achterkant van de muis (1 maand oud, vrouwelijk, C57/BL6) met de muis naar voren gericht en zorg ervoor dat deze stevig in die positie blijft. Houd de muis 2 − 3 minuten voor toediening kalm.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de onderzoeker duidelijk de voorkant van de muis kan zien. Draag handschoenen om muis beten te voorkomen, met name voor nieuwe onderzoekers.
    2. Plaats de maagsonde naald (grootte: #12, 40 mm) in de werkoplossing van GSK-korrels en trek 0,24 ml van de werkoplossing.
    3. Plaats de maagsonde naald in de muis door één kant van de mond totdat de maag met de maagsonde naald is bereikt.
      Opmerking: om te bevestigen dat de naald van de maagsonde de buik heeft bereikt: (1) de maagsonde naald stuit op het gevoel van weerstand. Ondertussen, de muis toont de actie van slikken voordat de sonde naald passeert de fysieke vernauwing van de slokdarm. (2) Injecteer ongeveer 0,5 mL van de werkoplossing in de muis en wacht 1 minuut. Als er geen oplossing komt uit de muis, betekent dit dat de maagsonde naald de maag heeft bereikt.
    4. Injecteer de werkoplossing van GSK-korrel (0,24 ml/muis) in de maag en trek vervolgens de naald van de maagsonde op. Keer de muis in de kooi.
    5. Herhaal stap 1.6.4 met de CAL-oplossing en Injecteer 0,24 mL CAL-oplossing per muis.
      Opmerking: het volume van de CAL-oplossing wordt berekend zoals in stap 1,2.

2. micro-CT Scanning

  1. T ibia oogsten en voorbereiding
    1. Intraperitoneaal verdoven muis met 300 ml/100 g van 80 mg/kg ketamine de dag na de interventie van de 90 dag. Gebruik een naald knijpen van de tenen om te bevestigen of de muis volledig verdoof. Geen reactie duidt op succesvolle anesthesie. Dan dood de muis met cervicale dislocatie.
    2. Bevestig de muis met de armen en benen op schuim met kopspijkers.
    3. Knip de huid af met een schaar (maat: 8,5 cm) en pincet (grootte: 10 cm) van de benen van de proximale tot het distale uiteinde en oogst vervolgens tibias.
    4. Zet de scheen onmiddellijk in 70% ethylalcohol en was 3 keer.
  2. Wikkel de linker Tibia van de muis met spons schuim en zet het in een monsterbuis (35 mm diameter, 140 mm lengte).
    Opmerking: de lange as van het preparaat moet samen met die van de monsterbuis zijn. Zorg ervoor dat het proximale uiteinde van de Tibia punten omhoog is.
  3. De micro-CT 80 scan machine uitvoeren
    1. Start de micro-CT 80 scan machine bij kamertemperatuur.
    2. Stel de sample tube in micro-CT 80 en start cross-section scanning met de volgende Scanparameters: pixelgrootte 15,6 μm, buis spanning 55 kV, buis stroom 72 μA, integratie tijd 200 MS, ruimtelijke resolutie 15,6 μm, pixel resolutie 15,6 μm, en afbeeldings matrix 2048 x 2048.
      Opmerking: het geporeuze bot onderscheidt zich van het corticale bot door vooraf te scannen. Het scangebied van de tibia wordt gedefinieerd als het poreuze botgebied vanaf 5 mm onder het tibiale plateau tot aan het distale uiteinde.
  4. Kwantificering van de botparameter
    1. Na het voltooien van cross-section Scanning, het verkrijgen van de afbeeldingen van de linker tibias.
    2. Stel de dichtheids drempel in op 245 − 1000. Gebruik het micro-CT-evaluatieprogramma V 6.6 om de volgende botparameters te meten: botmineraal dichtheden (BMD), botvolume over totaal volume (BV/TV), Trabeculair botnummer (TB. N), trabeculaire botdikte (Tb.Th), evenals bot trabeculaire botscheiding ( TB. SP).

3. bereiding van het bloed serum voor in vitro experimenten

  1. Berekening
    1. Op basis van een rat lichaamsgewicht van 0,2 kg (1 maand oud, vrouwelijk, Sprague-Dawley), bereken de dosering van GSK-submodule: humane dosering/dag x lichaamsgewicht van humane x K/lichaamsgewicht van Rat = 20 g/70 kg/dag x 70 kg x K (K = 0,018)/0,2 kg = 2 g/kg/dag.
      Opmerking: K is de farmacologische transformatie coëfficiënt tussen mens en muis15 (k = 0,018).
    2. Herhaal stap 3.1.1 en bereken de volgende doseringen.
      1. Bereken de dosering van GSKL: 10 g/70 kg/dag x 70 kg x K/0.2 kg = 1 g/kg/dag.
      2. Bereken de dosering van GSKM: 20 g/70 kg/dag x 70 kg x K/0.2 kg = 2 g/kg/dag.
      3. Bereken de dosering van GSKL: 40 g/70 kg/dag x 70 kg x K/0.2 kg = 4 g/kg/dag.
      4. Bereken de dosering van CAL: 2 Tablet/70 kg/dag x 70 kg x K/0.2 kg = 0,2 Tablet/kg/dag.
    3. Bereken de totale dosering van GSK-submodule en CAL.
      1. Bereken de totale dosering voor GSKL: 1 g/kg/dag x 0,2 kg x 6 ratten x 3 dagen = 3,6 g.
      2. Bereken de totale dosering voor GSKM: 2 g/kg/dag x 0,2 kg x 6 ratten x 3 dagen = 7,2 g.
      3. Bereken de totale dosering voor GSKH: 4 g/kg/dag x 0,2 kg x 6 ratten x 3 dagen = 14,4 g.
      4. Bereken de CAL-dosering = 0,2 Tablet/kg/dag x 0,2 kg x 6 ratten x 3 dagen = 0,72 Tablet.
        NB: er is in totaal 10 mL GSK-granule-bevattende serum nodig om 100 mL kweekmedium (20% GSK granule-bevattende serum) te bereiden. Er wordt verwacht dat elke rat (6 ratten/groep) na centrifugeren 1,5 − 2 mL GSK-granule-bevattende serum levert.
    4. Bereken het volume van de GSK-korrels die per rat zijn toegepast op basis van het lichaamsgewicht15: bv. volume (V) = 2 ml/rat/dag.
      Opmerking: het volume voor intragastrische toediening voor rat is 0,1 mL/10 g.
  2. Weeg 3-dagen aan drie doses GSK-korrels af. Weeg 3,6 g, 7,2 g en 14,4 g van GSK-korrels af en dienen respectievelijk als GSKL, GSKM en GSKH. Weeg 0,72 Tablet af voor de CAL-groep.
  3. Plaats 7,2 g GSK-korrels in een buis van 50 mL. Voeg 36 mL zoutoplossing en schud buis toe om volledig op te lossen. Herhaal dit met 3,6 g en 14,4 g GSK-korrels.
  4. Herhaal paragraaf 1,6 voor intragastrische toediening met 2 mL van de werkoplossing van GSK.
    Opmerking: dien hetzelfde volume zoutoplossing (2 mL per rat) toe om serum te bereiden en dient als een blanco controlegroep voor in vitro assays.
  5. Bereiding van het GSK-bevattende serum
    1. Intraperitoneaal anesthetiseren de ratten met 300 mL/100 g van 80 mg/kg ketamine 1 h na de laatste toediening van GSK granulaat. Gebruik een naald knijpen van de tenen om te bevestigen of de rat volledig anesthetized is. Geen reactie duidt op succesvolle anesthesie.
    2. Bloot de buik aan de onderkant van de thorax van ratten met behulp van rechte schaar na het gebeuren van de huid en peritoneum.
      Opmerking: het chirurgische instrument moet vóór gebruik gesteriliseerd worden bij hoge temperaturen en hoge drukken. Het chirurgische gebied moet worden gesteriliseerd met 70% ethanol tijdens het verzamelen van bloed.
    3. Verwijder het bindweefsel van de abdominale aorta met tissuepapier om het vat duidelijk te blootstellen.
    4. Trek bloed uit de abdominale aorta met behulp van een 10 mL, 22 G spuit. Verwijder vervolgens de naald en breng het bloed over in een steriele buis van 15 mL. Gewoonlijk kan 6 − 8 mL bloed worden verkregen van één rat.
      Opmerking: elke rat moet levend worden gehouden bij het tekenen van bloed. Een indicator is dat de abdominale aorta pulseert wanneer de rat leeft. De rat is dood na bloed loting.
    5. Houd de buis gedurende 30 − 60 minuten rechtop bij kamertemperatuur totdat het bloed in de buis is geclopt. Centrifugeer vervolgens de buis op 500 − 600 x g gedurende 20 min. Breng alle supernatant (serum) van de ene groep (6 ratten) naar 1 50 ml steriele buis en schud om te mengen.
    6. Het serum inactiveren door gedurende 30 minuten in een waterbad van 56 °c te incuberen. Filtreer het serum met een 0,22-μm-Pore-formaat hydrofiele polyethersulfon spuit filter. Bewaren bij-80 °C voor langdurig gebruik (minder dan 1 jaar).
      Opmerking: het gefilterde serum kan worden gebruikt voor in vitro osteoclastogenese en osteoblastogenese.
  6. Toepassing
    1. In vitro osteoclastogenese
      1. Verdun de drie doseringen van het GSK-bevattende serum (GSKL, GSKM, GSKH) met een verhouding van 1:4 met minimaal Eagle's medium (α-MEM) met L-glutamine, ribonucleosides en deoxyribonucleosides.
        Let op: Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van het serum dat GSK bevat voor in vitro osteoclastogenese en osteoblastogenese 20% is.
      2. Voeg het verdunde GSK-bevattende serum (200 μL/goed) toe van stap 3.6.1.1 tot het beenmerg macrofagen (BMMs) van 4 − 6 weken oude C57BL/6 muizen voor osteoclastogenese en stimuleer BMMs met macrofaag kolonie-stimulerende factor (M-CSF, 10 ng/mL) en receptor Activator voor nucleaire factor-κB ligand (RANKL, 100 ng/mL) zoals eerder beschreven2.
    2. In vitro osteoblastogenese
      1. Herhaal stap 3.6.1.1.
      2. Voeg het verdunde GSK-bevattende serum (2 mL/put) toe aan botmesenchymale stamcellen (BMSCs) van 4 − 6 weken oude C57BL/6 muizen om osteoblast te genereren zoals eerder beschreven16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Micro-CT-scanresultaten gaven aan dat de OVX-muizen significant botverlies vertoonden in vergelijking met zout bestrijdings muizen (Figuur 1a). De interventie (90 dagen) van GSK-korrels heeft de BMD sterk verhoogd, met name in de GSKM-groep (Figuur 1b). De parameters van de botstructuur, zoals BMD, BV/TV, TB. N en Tb.Th, werden gekwantificeerd. De submodules van GSK leidden tot verhoogde BMD, BV/TV, TB. N en Tb.Th, maar daalden met TB. SP (afbeelding 1c).

Tartraat resistente zure fosfatase (TRAP) kleuring toonde een toename van het aantal osteoclasten in OVX-muizen in vergelijking met controle muizen (Figuur 2a). De submodules van GSK hebben een verminderde val-positieve osteoclasten vergeleken met de OVX-groep. Deze bevindingen werden bevestigd door het berekenen van de verhouding van de TRAP-positieve oppervlakte naar Trabeculair botoppervlak (OCs/BS%) en de verhouding van het osteoclast getal tot het botgebied (OCs/mm2). Deze kwantitatieve resultaten toonden een significante afname van het aantal osteoclasten in GSK-groepen ten opzichte van de OVX-groep (Figuur 2b, C).

Het serum bevattende GSK werd toegediend aan beenmerg macrofagen (BMMs) van 4 − 6 weken oude C57BL/6 muizen om osteoclast te genereren en het aantal osteoclasten werd geanalyseerd door VALKLEURING. Uit de resultaten bleek dat het serum van GSK bevattende het aantal VALPOSITIEVE osteoclasten in GSK-groepen heeft verlaagd ten opzichte van de controlegroep (Figuur 3a, B).

Alkalische fosfatase (ALP) kleuring toonde aan dat GSK granule-gemedicineerde serum stimulerende effecten uitoefende op osteoblastogenese met MSCs van C57BL/6 muizen. De kleuring van ALP toonde aan dat alle drie de groepen van GSK-gemedicineerde serum de activiteit van ALP (Fig. 4a, B) in vergelijking met de controlegroep hadden verhoogd.

Figure 1
Figuur 1: De GSK-submodule voorkomt botverlies bij muizen met een OVX-geïnduceerde. A) muizen werden gedurende 3 maanden met GSK-korrels behandeld en de linker-scheen werden geoogst om micro-CT-analyse uit te voeren. Er werden representatieve driedimensionale (3D) reconstructie beelden van het trabeculaire bot van de linker scheen getoond. Schaalbalk = 0,5 mm.B) de botmineraaldichtheid (BMD) werd gemeten en gekwantificeerd. C) botparameters van linker tibias, zoals het trabeculaire Botnummer (TB. N), botvolume over het totale volume (bv/TV), trabeculaire botdikte (TB.th) en trabeculaire Botscheiding (TB. SP), gerelateerd aan de trabeculaire botstructuur in alle groepen werden getoond. GSKL-, GSKM-en GSKH-groepen werden vergeleken met controle (CON; Sham + Saline) en de OVX-groep (n = 6, *p < 0,05, versus-controle; *p < 0,05, versus ovx). CAL: calcium carbonaat met vitamine D3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: GSK-korrels onderdrukken het aantal osteoclasten in OVX-muizen. A) de valkleuring werd uitgevoerd op lumbale wervel 3 (L3) nadat de met GSK behandelde muizen werden geoogst. TRAP resultaten van Control (Sham + Saline), OVX (OVX + Saline), CAL (ovx + Caltraat), GSKL (ovx + lage dosis GSK, 2 g/kg/dag), GSKM (OVX + middelgrote dosis GSK, 4 g/kg/dag) en GSKH (OVX + hoge dosis GSK, 8 g/kg/dag) werden gemeten en geanalyseerd. Schaalbalk = 100 μm (bovenste afbeeldingen) of 50 μm (onderste afbeeldingen). B) kwantificering van het met osteoclast bedekte oppervlak over het botoppervlak. C) osteocallergetal. Waarden werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). *P < 0,05, ovx versus Control (CON); *P < 0,05, de groepen van CAL of GSKL/gskm/GSKH versus de ovx-groep. Alle assays werden herhaald met minstens 3 muizen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: GSK-submodule Medicated-serum verlaagt osteoclastogenese uit beenmerg macrofagen (bmms). A) bmms van C57BL/6 muizen (4 − 6 weken oud) werden geoogst en gekweekt met M-CSF (10 ng/ml) en rankl (100 ng/ml) (controle), M-CSF en Rankl plus GSK, of CAL medicinale serums. Osteoclastogenese werd beoordeeld op dag 4 − 6 door VALKLEURING. Schaalbalk = 100 μm. B) het aantal osteoclasten is gekwantificeerd. *P < 0,05, de groepen van GSKL/gskm/GSKH versus controle. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: GSK-granule-gemedicineerde serum bevordert osteoblastogenese. (A) bot mesenchymale stamcellen (MSCS) van C57BL/6 muizen (4 − 6 weken oud) werden geïsoleerd en behandeld met GSK of CAL medicinale serum. ALP kleuring werd uitgevoerd op dag 7 om de osteoblastogenese te beoordelen. Schaalbalk = 100 μm. B) het aantal osteoblasten is gekwantificeerd. *P < 0,05, de groepen van CAL of GSKL/gskm/GSKH versus controle. Alle assays werden herhaald met minstens 3 muizen of 3 keer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Korrels van TCM agenten zijn uitgegroeid tot een van de gemeenschappelijke keuzes voor formuleringen of recepten. GSK-korrels zijn samengesteld uit verschillende kruidengeneesmiddelen op basis van klinische ervaringen of de TCM-theorie, en ze oefenen betere curatieve effecten uit met minder bijwerkingen4. Vergeleken met water afkooksel hebben de korrels deze voordelen: goede smaak, gemak van levering, lange termijn opslag, standaardprotocol en consistente curatieve effecten, evenals een hogere productiviteit. Momenteel zijn granules een van de meest gebruikte apothekers formaties in TCM. Echter, de onderliggende mechanismen van farmacologische effecten zijn nog steeds zelden bestudeerd. Het is noodzakelijk om de kritische stappen in de voorbereiding van korrels te bepalen om de onderliggende farmacologische mechanismen te onderzoeken.

In de afgelopen decennia, een of meer representatieve effectieve componenten uit de kruidengeneeskunde zijn meestal gebruikt voor het uitvoeren van moleculaire assays en farmacologische uitkomsten als gevolg van hun structurele helderheid. Veel onderzoeken zijn uitgevoerd om te begrijpen van de curatieve effecten met effectieve componenten van TCM kruiden5,6,7. Echter, het is nog steeds moeilijk om na te bootsen wat er zal gebeuren bij een patiënt als gevolg van de complexe omgeving, met veel effectieve componenten samenwerken. Om dit probleem op te lossen, onderzoeken met korrels kunnen farmacologische processen verkennen en zijn een keuze in het uitvoeren van moleculaire studies in vergelijking met onderzoeken met effectieve componenten.

Voorbereiding van werkoplossingen voor korrels bevat vier basisstappen. De eerste stap is ontbinding. Korrels worden vaak gemengd in zoutoplossing na roeren om te voltooien oplossen voordat verder onderzoek. De hoeveelheid en eigenschap van submodules beïnvloedt de tijd en stabiliteit van de korrels tijdens het oplossen van het proces. De variatie in de oplostijd en stabiliteit is afhankelijk van de kruiden, vanwege hun fysische, chemische en farmacologische kenmerken17. Goede schudden en hogere temperatuur meestal bevorderen en zorgen voor volledige ontbinding van korrels. De volgende stap is concentratie. De juiste hoeveelheid maagsonde toediening voor dieren wordt zorgvuldig overwogen en wordt bepaald door het volume van de werkoplossing. Orale gavages met hoge concentraties, zoals 10 mL/kg of meer, kunnen leiden tot verschillende absorptieproblemen. Een snel rangeer systeem van de werkoplossing van korrels in de twaalfvingerige darm is een veelvoorkomend probleem. Andere problemen, zoals aspiratiepneumonie, als gevolg van de passieve reflux van de werkoplossing van korrels in de slokdarm, worden ook waargenomen18. Filtratie is de derde stap, die helpt de maagsonde naald te verminderen in volume en voorkomt dat het wordt verstopt met kruiden korrels, evenals aids de vertering van korrels. De vierde stap is opslag. De opslag van werkoplossingen van korrels bij lage temperaturen (-20 °C) garandeert betere resultaten.

De benadering voor het berekenen van de Bioequivalente dosis van het dier is belangrijk om de effecten van korrels in de praktijk van TCM te bepalen. Het lichaamsgewicht (mg/kg) en soorten worden vaak overwogen. Het lichaamsoppervlak (mg/m2) wordt vaak gebruikt om de berekening uit te voeren19 omdat de stofwisseling gerelateerd is aan de grootte van het individuele dier. Het is gebruikelijk om zowel het lichaamsoppervlak als het lichaamsgewicht te overwegen, en daarom is de meeh-Rubner-vergelijking gebruikt, wat gebruikelijk is bij in-vivo-onderzoeken in farmacologische studies19,20.

Verschillende soorten dieren worden gekozen voor medicijn bevattende serum voorbereiding, zoals konijnen, cavia's, ratten en muizen. Voor in vivo onderzoeken heeft dezelfde soort de voorkeur. Ratten werden geselecteerd omdat ze niet alleen meer serum dan muizen bieden, maar ook dichter bij muizen zijn in termen van evolutie dan andere dieren. De dosis equivalent in vivo (rat: 7-voudige van de equivalente dosis) en klinisch gebruik voor patiënten worden ook aanbevolen. Tien maal de equivalente dosis van de in het serum geleverde dieren wordt in vivo onderzoek niet vaak toegepast omdat behandelde cellen of organen kunnen leiden tot potentiële toxische reacties21. Methoden zoals injectie, huid toediening en inhalatie zijn de algemeen gebruikte toedieningsprocedures in overeenstemming met in vivo administraties. In de huidige studie werd een orale toediening met een maagsonde gekozen. De administratie frequentie van de submodule varieert van één tot twee keer per dag en de interventieperiode is 3 − 14 dagen. De uiteindelijke inzameling van bloed wordt gewoonlijk uitgevoerd binnen 2 uur na de laatste toediening22,23, wanneer de concentratie van korrels in het bloed relatief stabiel is en op het piekniveau volgens een eerdere studie24.

Drug-bevattende serum voor in vitro assays voor gebruik is nog steeds controversieel. Sommige onderzoekers houden dat het kan resulteren in onverwachte reacties of bijwerkingen, die invloed hebben op de resultaten vanwege de aanwezigheid van talrijke actieve componenten in het serum, met inbegrip van enzymen, hormonen, antilichamen, en vult25. Echter, sommige onderzoekers houden de tegenovergestelde mening dat actieve componenten ook kunnen worden verwijderd door de inactivatie proces26. Om een middenweg te bereiken, werd het serum in deze studie geïnactiveerd vóór incubatie in een waterbad van 56 °C gedurende 30 minuten. Bovendien werd een blanco serum groep opgenomen, waarin het serum van met zout behandelde dieren wordt gebruikt, om mogelijke bijwerkingen te voorkomen. Daarom, drug-bevattende serum kan dienen als een mogelijke methode om te onderzoeken van de farmacologische mechanismen of therapeutische resultaten.

In vergelijking met soortgelijke methoden heeft het protocol hier de volgende voordelen: (1) volledigheid. Zowel in vitro en in vivo methoden worden gelijktijdig gebruikt en kunnen elkaar wederzijds ondersteunen in farmacologische effecten. (2) geschiktheid. Alleen muizen en ratten worden opgenomen omdat ze nauw verwant zijn. (3) reproduceerbaarheid. Zowel muizen als ratten zijn gemakkelijk te kopen tegen lage kosten, en de methoden kunnen gemakkelijk worden herhaald. (4) lage kosten. De ovx-geïnduceerde osteoporotische Mouse model wordt vaak gebruikt en betrouwbare27,28 en kan gemakkelijk worden gemaakt of gekocht. Daarom zijn de protocollen hier meer geschikt in vergelijking met andere methoden voor het bestuderen van de farmacologische effecten van kruidengeneeskunde, zoals korrels.

Er zijn echter verschillende beperkingen voor de protocollen met GSK-korrels. Eerste, drie doseringen werden toegediend, hoewel de korrels toonde geen significante dosis-afhankelijke neiging voor in vivo onderzoeken. De reden kan zijn dat doseringen voor dierproeven niet gevoelig zijn en de interventietijd niet lang genoeg is, wat verder moet worden getest. Vervolgens is een langere periode van interventie nodig voor in-vitro parallelle onderzoeken. Het medicijn bevattende serum, hoewel geïnactiveerd, kan bijwerkingen veroorzaken na langdurige interventie. Ten derde wordt slechts één volume werkoplossing gebruikt voor de toediening van dieren, die in toekomstige studies kan worden gewijzigd. Ten slotte kunnen de diersoorten die zijn gekozen voor de bereiding van het medicijn bevattende serum en de toedienings routines worden gewijzigd en in verdere studies worden getest.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Deze studie werd gesteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 en 81330085), het programma voor innovatief team, ministerie van Wetenschappen en technologie van China (2015RA4002 naar WYJ), het programma voor Innovatief team, ministerie van onderwijs van China (IRT1270 naar WYJ), Shanghai TCM Medical Center van chronische ziekte (2017ZZ01010 naar WYJ), drie jaar actie om de ontwikkeling van de traditionele Chinese geneeskunde plan (ZY (2018-2020)-CCCX-3003 naar WYJ) te versnellen, en nationale belangrijke onderzoeks-ontwikkelingsprojecten (2018YFC1704302).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM Hyclone
laboratories		 SH30265.018 For cell culture
β-Glycerophosphate Sigma G5422 Osteoblastogenesis
Caltrate (CAL) Wyeth L96625 Animal interventation
C57BL/6 mice SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Ainimal preparation
Dexamethsome Sigma D4902
Dimethyl sulfoxide Sigma D2438 Cell frozen
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Sangon Biotech 60-00-4 Samples treatmnet
Fetal bovine serum Gibco FL-24562 For cell culture
Gushukang granules kangcheng companyin china Z20003255 Herbal prescription
Light microscope Olympus BX50 Olympus BX50 Images for osteoclastogenesis
L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate Sigma A8960-5G Osteoblastogenesis
Microscope Leica DMI300B Osteocast and osteoblast imagine
M-CSF Peprotech AF-300-25-10 Osteoclastogenesis
Μicro-CT Scanco
Medical AG		 μCT80 radiograph microtomograph Bone Structural analsysis
RANKL Peprotech 11682-HNCHF Osteoclastogenesis
Sprague Dawley SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Blood serum collection
Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT TRAP staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).
  2. Zhao, D., et al. The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice. Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).
  3. Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments. Journal of Visualized Experiments. (123), e55654 (2017).
  4. Wang, Q., et al. The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).
  5. Bian, Q., et al. Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro. Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).
  6. Zhao, D., et al. Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).
  7. Tang, D. Z., et al. Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of β-Catenin-BMP Signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).
  8. Tashino, S. "Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).
  9. Fu, L., et al. Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439 (2016).
  10. Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).
  11. Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).
  12. Li, X. L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice. Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).
  13. Cui, S. Q., et al. Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis. Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).
  14. Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study. Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).
  15. Zhang, Y. P. Pharmacology Experiment. , 2nd edition, People’s medical publishing house. Beijing, China. (1996).
  16. Zhao, D. F., et al. Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).
  17. Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
  18. Zhang, D. Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
  19. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human). Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  20. Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).
  21. Jiang, Y. R., et al. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells. Chinese Journal of Integrative Medicine. 18 (1), 30-33 (2012).
  22. Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
  23. Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
  24. Li, Y. K. Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
  25. Zhang, L., et al. A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
  26. Pacifici, R. Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis. Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).
  27. Ammann, P., et al. Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency. Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).
  28. Kimble, R. B., et al. Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period. Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).

Tags

Geneeskunde uitgave 147 traditionele Chinese geneeskunde Gushukang granule drug-bevattende serum serum farmacologie osteoclastogenese muizen ovariectomized osteoblastogenese in vivo in vitro
Bereiding van Gushukang (GSK) granulaat voor in vivo en in vitro experimenten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y., Wang, Q., Liu, S., Wang,… More

Zhao, Y., Wang, Q., Liu, S., Wang, Y., Shu, B., Zhao, D. Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments. J. Vis. Exp. (147), e59171, doi:10.3791/59171 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter