הכנת הגרגירים של גושוקאנג (GSK) בגרגרים בVivo ובניסויים חוץ-גופית
Summary
מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט להכנת פתרון העבודה של בגרגרים gushukang עבור לימודי בעלי חיים, גרגר עושה המכיל סרום עבור ניסויים מבחנה. פרוטוקול זה ניתן להחיל על חקירות תרופתי של תרופות צמחיות, כמו גם מרשמים הן בvivo והן בניסויים מבחנה.
Abstract
צמחי מרפא סיניים מסורתיים ממלאים תפקיד כשיטה חלופית בטיפול במחלות רבות, כגון אוסטאופורוזיס בגיל המעבר (POP). Gushukang (GSK) בגרגרים, מרשם משווק בסין, יש השפעות מגן העצם בטיפול POP. לפני המינהל לגוף, אחד הליך ההכנה הסטנדרטי נדרש בדרך כלל, אשר מטרתו לקדם את שחרורו של המרכיבים הפעילים מצמחי מרפא גולמיים ולשפר את ההשפעות תרופתי, כמו גם תוצאות טיפוליות. מחקר זה מציע פרוטוקול מפורט עבור שימוש בגרגרים GSK ב vivo ו ניסיוני מחוץ לבית הספר. המחברים מספקים תחילה פרוטוקול מפורט לחישוב המינונים המתאימים לבעלי חיים של גרגירים בחקירה vivo: שקילה, המסת, אחסון ואדמיניסטרציה. שנית, מאמר זה מתאר פרוטוקולים עבור סריקת מיקרו-CT ומדידת פרמטרי העצם. הכנה לדוגמה, פרוטוקולים להפעלת מכונת מיקרו-CT וכימות של פרמטרי עצם הוערכו. שלישית, סרום, המכיל גרגרי GSK מוכנים, והסרום המכיל תרופות מופק עבור בתוך מבחנה ואוסטאופלסטובגנזה. גרגרי GSK היו intragastrically מנוהל פעמיים ביום לחולדות במשך שלושה ימים רצופים. בלאד נאסף לאחר מכן, מcentrifuged, מופעל ומסונן. לבסוף, הסרום היה מדולל ומשמש לביצוע אוסטאופלסטובגנזה ואוסטאופהסטובגנזה. הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיחשב התייחסות לחקירות תרופתי של תרופות מרשם צמחים, כגון גרגירים.
Introduction
הרפואה הסינית המסורתית (TCM) היא אחת מגישות משלימות וחלופיות חשובות לטיפול באוסטאופורוזיס1,2. רתח מים היא הצורה הבסיסית הנפוצה ביותר של הנוסחה3. עם זאת, החסרונות קיימים גם: טעם רע, אי נוחות לתובלה, חיי מדף קצרים פרוטוקולים לא עקביים, הגבלת השימושים, כמו גם את ההשפעות המרפא. כדי למנוע את החסרונות הנ ל, כמו גם לשאוף להשפעות טובות יותר, הגרגירים פותחו והיה בשימוש נרחב4. למרות מחקרים רבים חקרו את מנגנוני הפרמקולוגית של רכיבים יעילים אחד או יותר מן הגרגירים5,6,7, המנגנון המדויק תהליכים תרופתי הבסיסי עדיין קשה לזהות. הסיבה לכך היא שרכיבים יעילים יותר מדי מגרריר אחד עשויים להפעיל בו השפעות דומות או מנוגדים4. לכן, ההתפתחות של פרוטוקול רגיל אחד כדי להכין את הגרגירים לפני האספקה לגוף לא רק תהיה השפעה רבה על התוצאות הטיפוליות, אלא גם נדרש עבור שניהם בvivo וגם מבחנה.
יתר על כן, את ההשפעות המרפא של גרגירים במרפאה קשה לאשר ולזהות בדיוק באמצעות לימודי חוץ גופית או לשעבר vivo, אשר יוצר אתגר כי מנגנוני הפרמקולוגית מורכבים מדי. כדי לפתור את זה, הכנת סרום המכיל סמים הוצע לראשונה על ידי טסטינוב שנות ה-80. מכאן והלאה, חוקרים רבים מיושמים סרום המכיל תרופות לצמחי מרפא, כולל גרגירים9,10,11. כיום, הבחירה של סרום המכיל תרופות לחקירות מבחנה נחשבת כאסטרטגיה אחת הקרובה מחקה את התנאים הפיזיולוגיים.
גושוקאנג (GSK) בגרגרים פותחו לטיפול באוסטאופורוזיס בגיל המעבר (POP) מבוסס על פרקטיקה קלינית לאור התאוריה של TCM. גרגירים GSK למנוע אובדן העצם ב ovariectomized (OVX) עכברים ב vivo, לעכב את העצם האוסטאופתית ספיגת עצמות, ולעורר osteoblastic עצם היווצרות4. כתוצאה מכך, לי ואח ‘12 מצאו כי גרגירים gsk יש השפעות מגן העצם ב ovx עכברים על ידי שיפור הפעילות של קולטן סידן כדי לעורר את היווצרות העצם. כדי לאשר את ההשפעות העצם מגן, כמו גם את ההשפעות הפרמקולוגית של גרגרי GSK, המחברים כאן לספק הליך מפורט להכנת פתרונות עבודה ותרופות (granule)-המכיל סרום. יתר על כן, מאמר זה מתאר את היישום של בגרגרים GSK במודל עכבר osteoporotic המושרה ו GSK מכיל סרום לתוך מבחנה מחוץ למבחנה/אוסטאופהסטובגנזה.
גרגרי gsk מורכבים מכמה צמחי מרפא13,14 והוא יכול להיות מומס לחלוטין בקלות מלוחים. לכן, תמיסת מלח משמשת כרכב. עכברים מופעלים (שאם) ועכברים OVX היו בעלי אותו נפח של תמיסת מלח כמו עכברים מנוהל. המינון המקביל של גרגרי GSK עבור העכבר חושבו על בסיס משוואת Meeh-Rubner15. משוואה זו לא רק יש את היתרון של קבלת מינונים בטוחים אלא גם ערבויות השפעות פרמקולוגית15. שלושת המינונים של גרגרים GSK נוצרו כדלקמן: (1) GSKL: OVX + מינון נמוך בגרגרים GSK, 2 g/ק”ג/יום. (2) GSKM: OVX + בינוני מינון בגרגרים GSK, 4 ג’/ק”ג/יום. (3) GSKH: OVX + מינון גבוה בגרגרים GSK, 8 ג’/ק”ג/יום. עכברים בקבוצות GSKL, GSKL ו GSKL היו intragastrically מנוהלים בגרגרים GSK. סידן פחמתי (600 mg/tablet) עם ויטמין D3 (125 יחידה בינלאומית/tablet), למשל, במוצר בוגר ומשווק (g., Caltrate [CAL]) לטיפול ומניעת אוסטאופורוזיס, שימש כשליטה חיובית.
Protocol
Representative Results
Discussion
גרגירים של סוכני TCM הפכו לאחת הבחירות הנפוצות עבור ניסוחים או מרשמים. גרגירים GSK מורכבים מספר תרופות צמחיות מבוסס על חוויות קליניות או התיאוריה TCM, והם להפעיל אפקטים מרפא טוב יותר עם פחות תופעות לוואי4. לעומת decoction מים, הגרגירים יש יתרונות אלה: טעם טוב, נוחות של משלוח, אחסון לטווח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים הלאומי המדע הטבעי הקרן של סין (81804116, 81673991, 81770107, 81603643, ו 81330085), התוכנית עבור צוות חדשני, משרד המדע וטכנולוגיה של סין (2015RA4002 כדי WYJ), התוכנית עבור צוות חדשני, משרד החינוך של סין (IRT1270 to WYJ), שנגחאי TCM מרכז רפואי של מחלה כרונית (2017ZZ01010 to WYJ), שלוש שנים פעולה כדי להאיץ את ההתפתחות של תוכנית הרפואה הסינית המסורתית (ZY (2018-2020)-CCCX-3003 כדי WYJ), ו פרויקטים של פיתוח מחקר מפתח לאומי (2018YFC1704302).
Materials
| α-MEM | Hyclone laboratories |
SH30265.018 | For cell culture |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G5422 | Osteoblastogenesis |
| Caltrate (CAL) | Wyeth | L96625 | Animal interventation |
| C57BL/6 mice | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Ainimal preparation |
| Dexamethsome | Sigma | D4902 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | Cell frozen |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Sangon Biotech | 60-00-4 | Samples treatmnet |
| Fetal bovine serum | Gibco | FL-24562 | For cell culture |
| Gushukang granules | kangcheng companyin china | Z20003255 | Herbal prescription |
| Light microscope | Olympus BX50 | Olympus BX50 | Images for osteoclastogenesis |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate | Sigma | A8960-5G | Osteoblastogenesis |
| Microscope | Leica | DMI300B | Osteocast and osteoblast imagine |
| M-CSF | Peprotech | AF-300-25-10 | Osteoclastogenesis |
| Μicro-CT | Scanco Medical AG |
μCT80 radiograph microtomograph | Bone Structural analsysis |
| RANKL | Peprotech | 11682-HNCHF | Osteoclastogenesis |
| Sprague Dawley | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Blood serum collection |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | TRAP staining |
References
- Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).
- Zhao, D., et al. The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice. Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).
- Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments. Journal of Visualized Experiments. (123), e55654 (2017).
- Wang, Q., et al. The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).
- Bian, Q., et al. Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro. Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).
- Zhao, D., et al. Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).
- Tang, D. Z., et al. Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of β-Catenin-BMP Signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).
- Tashino, S. “Serum pharmacology” and “serum pharmaceutical chemistry”: from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).
- Fu, L., et al. Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439 (2016).
- Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).
- Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).
- Li, X. L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice. Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).
- Cui, S. Q., et al. Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis. Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).
- Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study. Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).
- Zhang, Y. P. . Pharmacology Experiment. , (1996).
- Zhao, D. F., et al. Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).
- Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
- Zhang, D. Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
- Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human). Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).
- Jiang, Y. R., et al. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors’ expression in endothelial cells. Chinese Journal of Integrative Medicine. 18 (1), 30-33 (2012).
- Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
- Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
- Li, Y. K. Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
- Zhang, L., et al. A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
- Pacifici, R. Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis. Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).
- Ammann, P., et al. Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency. Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).
- Kimble, R. B., et al. Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period. Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).
