Summary
この記事では、動物実験用のグシュカン顆粒およびインビトロ実験用血清を含むGSK顆粒の作業溶液を調製するための詳細なプロトコルを提供する。このプロトコルは、生体内およびインビトロ実験の両方の処方箋と同様に、漢方薬の薬理学的調査に適用することができます。
Abstract
伝統的な漢方薬は、閉経後骨粗鬆症(POP)などの多くの疾患を治療する代替方法としての役割を果たしています。中国で販売されている処方箋であるグシュカン(GSK)顆粒は、POPの治療に骨保護効果があります。体内に投与する前に、1つの標準的な調製手順が一般的に必要とされ、生ハーブからの活性成分の放出を促進し、薬理学的効果と治療結果を高めることを目的とする。本研究では、生体内およびインビトロ実験アッセイにおいてGSK顆粒を用いるための詳細なプロトコルを提案する。著者らはまず、生体内調査のための顆粒の動物に適した投与量を計算するための詳細なプロトコルを提供する:計量、溶解、貯蔵、および投与。次に、マイクロ CT スキャンのプロトコルと骨パラメータの測定について説明します。試料調製、マイクロCTマシンを実行するためのプロトコル、および骨パラメータの定量化を評価した。第3に、血清含有GSK顆粒が調製され、かつ、インビトロ破骨形成および骨芽形成のために薬物含有血清が抽出される。GSK顆粒を1日2回ラットに3日間連続して投与した。その後、血液を採取し、遠心分離し、不活性化し、濾過した。最後に、血清を希釈し、破骨形成および骨芽細胞形成を行うための使用を行った。ここで説明するプロトコルは、顆粒などの漢方薬の薬理学的調査のための参照と考えることができる。
Introduction
伝統的な中国医学(TCM)は、骨粗鬆症1、2を治療するための重要な補完的かつ代替的なアプローチの一つである。水の煎じりは、式3の基本的で最も一般的に使用される形態です。しかし、欠点も存在します:悪い味、キャリッジのための不便さ、短い貯蔵寿命と一貫性のないプロトコル、使用だけでなく、治癒効果を制限します。上記の欠点を避け、より良い効果を追求するために、顆粒が開発され、広く使用されている4.多くの研究は、顆粒5、6、7から1つ以上の有効な成分の薬理学的メカニズムを探索しているが、正確なメカニズムと基礎となる薬理学的プロセスはまだある識別が困難です。これは、1つの顆粒からあまりにも多くの有効成分が同時に類似または反対効果を発揮する可能性があるためです4.したがって、体内に送送る前に顆粒を調造する1つの標準プロトコルの開発は、治療結果に大きな影響を与えるだけでなく、生体内およびインビトロアッセイの両方にも必要とされる。
さらに、クリニックにおける顆粒の治癒効果は、インビトロまたはエクスビボ研究を用いて正確に同定することは困難であり、薬理学的メカニズムが複雑すぎるため課題を生み出します。これを解決するために、1980年代8年にタシノが薬剤含有血清の調製を最初に提案した。それ以来、多くの研究者が顆粒9、10、11を含む漢方薬に薬物含有血清を適用しました。現在、インビトロ調査のための薬物含有血清の選択は、生理学的条件を密接に模倣する1つの戦略とみなされている。
グシュカン(GSK)顆粒は、TCMの理論に照らして臨床実践に基づいて閉経後骨粗鬆症(POP)を治療するために開発された。GSK顆粒は、生体内の卵巣切除(OVX)マウスにおける骨損失を防ぎ、骨細胞性骨吸収を阻害し、骨芽細胞性骨形成を刺激する4。その結果、Li et al. 12は、GSK顆粒が骨形成を刺激するカルシウム受容体の活性を増強することによってOVXマウスにおいて骨保護効果を有することを見出した。GSK顆粒の骨保護効果と薬理学的効果を確認するために、著者らは、作業溶液および薬剤(GSK顆粒)含有血清の調製のための詳細な手順を提供する。さらに、この記事では、OVX誘発骨粗鬆症マウスモデルにおけるGSK顆粒および体外形成/骨芽形成におけるGSK顆粒含有血清の適用について説明する。
GSK顆粒は、いくつかのハーブ13、14で構成され、生理生理生理生理に完全に溶解することができます。したがって、生理食は車両として機能する。シャム投与マウス(シャム)およびOVXマウスを、顆粒投与マウスと同じ量の生理生理生理生理を投与した。マウスに対するGSK顆粒の同等の用量は、Meeh-Rubner方程式15に基づいて計算された。この方程式は、安全な用量を得ることの利点を有するだけでなく、薬理学的効果を保証する 15.GSK顆粒の3つの用量は、次のように生成されました: (1) GSKL: OVX + 低用量GSK顆粒, 2 g/kg/日.(2)GSKM:OVX+中用量GSK顆粒、4 g/kg/日。(3) GSKH: OVX + 高用量 GSK 顆粒, 8 g/kg/日.GSKL、GSKMおよびGSKH群におけるマウスを、GSK顆粒を胃内投与した。ビタミンD3(125国際単位/錠剤)を含む炭酸カルシウム(600mg/錠剤)は、例えば、骨粗鬆症を治療および予防するための成熟した市販品(例えば、カルトレート[CAL])において、陽性対照として使用された。
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Protocol
すべての実験手順は、上海大学TCM(SZY201604005)の機関動物ケアおよび使用委員会の承認を得て行われました。
1. GSK作業ソリューションの準備と管理
- マウスのGSK顆粒の同等の用量を計算します。
- Meeh-Rubner 方程式15に基づいて体表面を計算する : ボディ サーフェス = K x (体重 2/3)/1000、K 値は人間の場合は 10.6、マウスの場合は 9.1 です。人間の体重が70kgであると仮定すると、人体表面(m2)=10.6 x(702/3)/1000= 1.8 m2.マウスの体重が 20 g (0.02 kg; 1 か月齢、メス、C57/BL6 など) であると仮定すると、マウス本体表面 (m2)= 9.1 x (0.022/3)/1000 = 0.0067 m2.
- 計算されたボディ表面に基づいて、人間とマウスの体の変形比を計算します。人間:70キロ/1.8メートル2 = 39。マウス:0.02キロ/0.0067 m2 = 3。GSK顆粒 = 20 g/70 kg x 39/3 = 3.72 g/kg ≥ 4 g/kg。
- マウスあたり20gの体重に基づいて、マウスの同等の投与量を計算します:4 g/kg x 0.02 kg = 0.08 g。
- グループあたり20匹のマウスに基づいて3つの同等の用量を計算し、3ヶ月間持続する介入(90日):(1)GSKL(OVX+低用量GSK顆粒[2g/kg/日]):0.04gマウス/日x20マウスx90日=72g(2)GSKM(OVX+ -中用量GSK)日):0.08gマウス/日x 20マウスx 90日=144g=(3)GSKH(OVX+高用量GSK顆粒[8g/kg/日]):0.12gマウス/日x20マウスx 90日=216g。
注:損失を相殺するために、実際にはGSK顆粒の20%を追加で準備します。
- 体重15に基づいてマウスあたりのGSK顆粒の体積を計算する:例えば、体積(V)=0.24 mL/マウス/日。
注:マウスの胃内投与の体積は0.12 mL/10 gである。 - GSK顆粒の3用量の10日分の重量を量る。GSK顆粒の8g、16g、および24gの重量を量り、それぞれGSKL、GSKM、およびGSKHとして機能します。
- ステップ1.1.1および1.1.2のステップのようにMeeh-Rubner方程式15に基づいてマウスのビタミンD3(CAL)を含む炭酸カルシウムの同等の用量を計算する:CAL投与量= 2錠/70 kg x 39/3 = 0.372錠/kg ≥ 0.4錠/kg。
- マウスあたり20gの体重(例えば、1ヶ月齢、雌、C57/BL6)に基づいて、マウスのCALの同等の投与量を計算します:0.4錠/kg x 0.02 kg = 0.008錠。次に、グループあたり20匹のマウスに基づいてCALの同等の用量を計算し、3ヶ月間持続する介入(90日):0.008錠x20 x 90 = 14.4錠。CAL(1.6錠)の10日間分の重量を量る。
- 解散
- 50 mLチューブにGSK顆粒の8gを入れます。48 mLの生理生理生理生理生理とシェイクチューブを加えて完全に溶解させます。
注:完全な溶解のための標準は、堆積物の不在です。完全な溶解は、ガベジ針が作業溶液を引き出し、スムーズにそれを排出することができれば、さらに確認することができます。 - GSK顆粒の16gと24gでステップ1.5.1を繰り返します。
- CALの1.6錠(10日分)を50mLチューブに入れます。48 mLの生理生理生理生理生理とシェイクチューブを加えて完全に溶解させます。
注:働く解決は-4 °Cで貯え、10日ごとに準備することができる。
- 50 mLチューブにGSK顆粒の8gを入れます。48 mLの生理生理生理生理生理とシェイクチューブを加えて完全に溶解させます。
- 胃内投与
- マウスの背面(生後1ヶ月、メス、C57/BL6)をマウスを前方に向けてつかみ、その位置にしっかりととどまるようにします。投与の前に2-3分間マウスを静かにしてください。
注: 研究者がマウスの前面をはっきりと見えるようにしてください。特に新しい研究者のために、マウスの咬傷を防ぐために手袋を着用してください。 - GSK顆粒の作業溶液にガバゲ針(サイズ:#12、40mm)を入れ、作業溶液の0.24 mLを引きます。
- ガバゲ針が胃に届くまで、口の片側を通してマウスにガバゲ針を入れます。
注:ガバゲ針が胃に達したことを確認するには:(1)ガバゲ針は抵抗感に遭遇する。一方、マウスは、ゲージ針が食道の物理的狭窄を通過する前に嚥下する作用を示す。(2)作業液を約0.5mLのマウスに注入し、1分間待ちます。マウスから溶液が出てこない場合は、ガバゲ針が胃に届いていることを意味します。 - GSK顆粒(0.24 mL/マウス)の作動溶液を胃に注入し、ガバゲ針を引き出します。マウスをケージに戻します。
- CAL 溶液でステップ 1.6.4 を繰り返し、マウスごとに 0.24 mL の CAL 溶液を注入します。
注: CAL ソリューションの体積は、ステップ 1.2 のように計算されます。
- マウスの背面(生後1ヶ月、メス、C57/BL6)をマウスを前方に向けてつかみ、その位置にしっかりととどまるようにします。投与の前に2-3分間マウスを静かにしてください。
2. マイクロCTスキャン
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Tイビア収穫と準備
- 90日目の介入の翌日に80mg/kgケタミンの300 mL/100gでマウスを精経内麻酔する。つま先の針のピンチを使用して、マウスが完全に麻酔されているかどうかを確認します。応答がない場合は、麻酔が成功した場合を示します。その後、子宮頸部脱臼でマウスを殺す。
- タックで泡の両腕と脚でマウスを固定します。
- 近位から遠位端まで脚のはさみ(サイズ:8.5cm)とピンセット(サイズ:10cm)で皮膚を切り取り、脛骨を収穫します。
- 直ちに脛間を70%エチルアルコールに入れ、3回洗います。
- マウスの左脛をスポンジフォームで包み、サンプルチューブ(直径35mm、長さ140mm)に入れます。
注:標本の長い軸は、サンプルチューブの長軸と一緒にする必要があります。脛下の近位端が上方に向かっていることを確認します。 -
マイクロCT 80スキャンマシンの実行
- 室温でマイクロCT 80スキャン機を起動します。
- サンプルチューブをmicro-CT 80に設定し、ピクセルサイズ15.6μm、チューブ電圧55kV、チューブ電流72μA、積分時間200ms、空間分解能15.6μm、ピクセル解像度15.6μm、画像マトリックスのスキャンを開始します。2048 x 2048
注:キャンセルス骨は、事前スキャンによって皮質骨と区別されます。脛骨のスキャン領域は、脛骨高原の下5mmから遠位端までのカンセラ骨面積として定義される。
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骨パラメータの定量化
- 断面スキャンを完了したら、左脛下の画像を取得します。
- 密度しきい値を 245−1000に設定します。マイクロCT評価プログラムV6.6を使用して、骨ミネラル密度(BMD)、全容積(BV/TV)以上の骨量(BV/TV)、線維柱帯骨数(Tb.N)、線維柱帯骨厚(Tb.Th)、骨線維柱帯骨分離(骨線維骨分離(Tb.Sp)。
3. インビトロ実験用血清の調製
- 計算
- ラットの体重0.2kg(生後1ヶ月、雌、スプラーグ・ドーリー)に基づいて、GSK顆粒の投与量を計算します:ラットのヒト投与量/日x体重x K/体重=ラット=20g/70kg/日x 70kg x K(K= 0.018)/0.2kg=2g/kg/日。
注:Kは、ヒトとマウス15の間の薬理学的変換係数である(K= 0.018)。 - ステップ 3.1.1 を繰り返し、次の投与量を計算します。.
- GSKL の投与量を計算する: 10 g/70 kg/日 x 70 kg x K/0.2 kg = 1 g/kg/日.
- GSKMの投与量を計算する: 20 g/70 kg/日 x 70 kg x K/0.2 kg = 2 g/kg/日.
- GSKL の投与量を計算する: 40 g/70 kg/日 x 70 kg x K/0.2 kg = 4 g/kg/日.
- CALの投与量を計算する: 2 錠 /70 kg/日 x 70 kg x K/0.2 kg = 0.2 錠/kg/日.
- GSK顆粒およびCALの総投与量を計算する。
- GSKLの総投与量を計算する: 1 g/kg/日 x 0.2 kg x 6 ラット x 3 日 = 3.6 g.
- GSKMの総投与量を計算します: 2 g/kg/日 x 0.2 kg x 6 ラット x 3 日 = 7.2 g.
- GSKHの総投与量を計算する: 4 g/kg/日 x 0.2 kg x 6 ラット x 3 日 = 14.4 g.
- CAL投与量 = 0.2 錠/kg/日 x 0.2 kg x 6 ラット x 3 日 = 0.72 錠を計算します。
注:100mL培養培地(20%GSK顆粒含有血清)を調製するには、合計10mLのGSK顆粒含有血清が必要です。各ラット(6ラット/群)は、遠心分離後にGSK顆粒含有血清の1.5−2 mLを提供することが期待される。
- 体重15に基づいてラット当たりのGSK顆粒の体積を計算する:例えば、体積(V)=2 mL/ラット/日。
注:ラットの胃内投与の体積は0.1 mL/10 gである。
- ラットの体重0.2kg(生後1ヶ月、雌、スプラーグ・ドーリー)に基づいて、GSK顆粒の投与量を計算します:ラットのヒト投与量/日x体重x K/体重=ラット=20g/70kg/日x 70kg x K(K= 0.018)/0.2kg=2g/kg/日。
- GSK顆粒の3用量の3日間の価値を量る。GSK顆粒の3.6g、7.2g、および14.4gの重量を量り、それぞれGSKL、GSKM、およびGSKHとして機能します。CALグループの重量は0.72錠。
- GSK顆粒の7.2 gを50 mLチューブに入れます。36 mLの生理生理生理生理生理とシェイクチューブを加えて完全に溶解させます。GSK顆粒の3.6 gと14.4 gでこれを繰り返します。
- GSK作動液の2 mLを用いて胃内投与のためのセクション1.6を繰り返す。
注:血清を調作するために同じ量の生理食生(ラット当たり2mL)を投与し、インビトロアッセイのためのブランク対照群として機能する。 - GSK含有血清の調製
- GSK顆粒の最後の投与後に80mg/kgケタミン1hの300 mL/100gでラットを食内麻酔する。つま先の針のピンチを使用して、ラットが完全に麻酔されているかどうかを確認します。応答がない場合は、麻酔が成功した場合を示します。
- 皮膚と腹膜を切開した後、まっすぐな手術はさみを使用してラットの胸郭の底に腹部を露出させる。
注:手術器具は、使用前に高温および高圧で殺菌する必要があります。外科区域は採血の間に70%のエタノールと殺菌されなければならない。 - 腹部大動脈の結合組織をティッシュペーパーで取り除き、血管をはっきりと露出させる。
- 10 mL、22 G注射器を使用して腹部大動脈から血液を採取する。その後、針を取り出し、血液を15 mLの滅菌チューブに移します。通常、1匹のラットから6−8mLの血液を得ることができる。
注:各ラットは、血液を描画するときに生き続ける必要があります。一つの指標は、ラットが生きているときに腹部大動脈が脈動するということです。ネズミは採血後に死んでいる。 - チューブがチューブ内に凝固するまで、室温で30~60分間直立してください。次に、チューブを500−600 x gで20分間遠心分離し、1つのグループ(6匹のラット)からすべての上清(血清)を1つの50 mL無菌チューブに移し、混ぜ合わせるために振ります。
- 56°Cの水浴で30分間インキュベートして血清を不活性化し、0.22μm-poreサイズの親水性ポリエーテルスルホンシリンジフィルターを使用して血清を濾過します。長期使用(1年未満)のために-80 °Cで保管してください。
注:濾過された血清は、インビトロ破骨形成および骨芽形成に使用することができる。
- アプリケーション
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インビトロ破砕形成
- L-グルタミン、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシドを含む最小イーグル培地(α-MEM)との1:4の比率でGSK含有血清(GSKL、GSKM、GSKH)の3つの用量を希釈する。
注:インビトロ破骨形成および骨芽形成のためのGSK含有血清の最終濃度が20%であることを確認してください。 - 希釈されたGSK含有血清(200 μL/ウェル)をステップ3.6.1.1から骨髄マクロファージ(BMS)に4−6週齢のC57BL/6マウスから骨形成に加え、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF、10ng/mL)でBMを刺激する前述の核因子-κBリガンド(RANKL、100 ng/mL)の場合2.
- L-グルタミン、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシドを含む最小イーグル培地(α-MEM)との1:4の比率でGSK含有血清(GSKL、GSKM、GSKH)の3つの用量を希釈する。
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インビトロ骨芽形成
- 手順 3.6.1.1 を繰り返します。
- 希釈されたGSK含有血清(2mL/ウェル)を骨間葉系幹細胞(BMSC)に4−6週齢のC57BL/6マウスから添加し、前述の16として骨芽細胞を生成する。
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インビトロ破砕形成
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Representative Results
マイクロCT走査の結果は、OVXマウスが生理生理生理用分掌マウスと比較して有意な骨損失を示したことを示した(図1A)。GSK顆粒の介入(90日)は、特にGSKM群においてBMDを大幅に増加させた(図1B)。BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Thなどの骨構造パラメータを定量化した。GSK顆粒治療は、BMD、BV/TV、Tb.NおよびTb.Th増加したが、Tb.Sp(図1C)を減少させた。
塩酸塩耐性酸ホスファターゼ(TRAP)染色は、対照マウスと比較してOVXマウスにおける破骨球数の増加を示した(図2A)。GSK顆粒治療は、OVX群と比較してTRAP陽性破骨トラストを減少させた。これらの知見は、線維柱帯骨表面に対するTRAP陽性領域の比率(AC/BS%)を算出することによって確認された。骨領域に対する破骨数の比率(OC/mm 2)。これらの定量的結果は、OVX群と比較してGSK群における破骨球数の有意な減少を示した(図2B,C)。
GSK顆粒含有血清を4-6週齢のC57BL/6マウスから骨髄マクロファージ(BMS)に投与し、破骨を生成し、破骨の数をTRAP染色により分析した。その結果、GSK顆粒含有血清は対照群と比較してGSK群におけるTRAP陽性破骨の数を減少させた(図3A,B)。
アルカリホスファターゼ(ALP)染色は、GSK顆粒薬用血清がC57BL/6マウスのMSCによる骨芽形成に対して刺激効果を発揮することを示した。ALP染色は、GSK顆粒薬血清の3群すべてが対照群と比較してALP(図4A,B)の活性を増加させたことを示した。
図 1:GSK顆粒は、OVX誘発マウスの骨損失を防ぎます。(A)マウスをGSK顆粒で3ヶ月間処理し、左脛間を採取し、マイクロCT分析を行った。左脛骨の線維柱骨の代表的な立体(3D)再構成画像を示した。スケールバー= 0.5 mm. (B) 骨ミネラル密度(BMD)を測定し定量した。(C) 線維柱帯骨数(Tb.N)、骨容積以上の骨量(BV/TV)、線維柱帯骨厚(Tb.Th)、線維柱帯骨分離(Tb.Sp)など、左脛骨の骨パラメータは、すべてのグループの線維柱骨構造に関連する。が示されました。GSKL、GSKM、およびGSKHグループを対照(Con;sham+ 生理生理)およびOVX群(n = 6、*P < 0.05、対コントロール、*P < 0.05、OVX)と比較した。CAL:ビタミンD3の炭酸カルシウム。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:GSK顆粒は、OVXマウスにおける破骨球数を抑制する。(A)TRAP染色は、GSK処理マウスを採取した後、腰椎3(L3)に対して行った。CONTROL(シャム+生理食生)、OVX(OVX+生理食生)、CAL(OVX+低用量GSK、2g/kg/日)、GSKM(OVX+中用量GSK、4g/kg/日)、およびGSKH(OVX+高用量GSK、8g/kg/日)からのTRAP結果を測定し、分析した。スケールバー = 100 μm (上の画像) または 50 μm (下の画像)(B) 骨表面上の破骨クラストで覆われた表面の定量化。(C) 破骨トランク番号。値は平均±標準誤差(SEM)として表した。*P < 0.05, OVX 対コントロール (Con);*P < 0.05、CAL または GSKL/GSKM/GSKH のグループと OVX グループ。全てのアッセイを少なくとも3匹のマウスで繰り返した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:GSK顆粒薬用血清は、骨髄マクロファージ(BMS)からの破骨形成を減少させる。(A) C57BL/6マウス(4−6週齢)のBMSを採取し、M-CSF(10ng/mL)およびRANKL(100 ng/mL)(対照)、M-CSF及びRANKLプラスGSK、またはCAL薬用血清を培養した。破骨形成はTRAP染色により4日目−6日目に評価した。スケールバー = 100 μm。(B) 破骨の数を定量した。*P < 0.05、GSKL/GSKM/GSKH対制御のグループ。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:GSK顆粒薬血清は骨芽形成を促進する。(A) C57BL/6マウス(4−6週齢)由来の骨間葉系幹細胞(MSC)を、GSKまたはCAL薬用血清で単離して処理した。ALP染色は、骨芽形成を評価するために7日目に行った。スケールバー = 100 μm。(B) 骨芽球の数を定量した。*P < 0.05、CAL または GSKL/GSKM/GSKH 対制御のグループ。全てのアッセイを少なくとも3匹のマウスまたは3回繰り返した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
TCM剤の顆粒は、製剤や処方箋のための一般的な選択肢の一つとなっています.GSK顆粒は、臨床経験またはTCM理論に基づいていくつかの漢方薬で構成され、副作用が少ないより良い治癒効果を発揮する4.水の煎じと比較して、顆粒はこれらの利点を有する:良い味、配達の利便性、長期貯蔵、標準的なプロトコルおよび一貫した治癒効果、ならびにより高い生産性。現在、顆粒は、TCMで最も一般的に使用される薬局の形成の一つです。しかし、薬理学的効果の根本的なメカニズムはまだめったに研究されていません。基礎となる薬理学的メカニズムを調査するために、顆粒の調製における重要なステップを決定する必要があります。
過去数十年の間に、漢方薬の1つ以上の代表的な有効成分は、通常、その構造的な明快さのために分子アッセイおよび薬理学的結果を実行するために使用されてきました。多くの調査は、TCMハーブ5、6、7から有効成分を用いた治癒効果を理解するために行われている。しかし、多くの効果的なコンポーネントが一緒に働いて、複雑な環境のために患者で何が起こるかを模倣することは依然として困難です。この問題を解決するために、顆粒を用いた調査は薬理学的プロセスを探索することができ、有効成分を用いた調査と比較して分子研究を行う際の選択肢の1つです。
顆粒のための働く解決の準備は4つの基本的なステップを含んでいる。最初のステップは解散です。顆粒は、一般的にさらなる調査の前に溶解を完了するために攪拌した後、生理生理生理生理物で混合されます。顆粒の量および特性は、溶解プロセス中の顆粒の時間および安定性に影響を与える。溶解時間および安定性の変動は、その物理的、化学的、および薬理学的特性に起因するハーブに依存する17.適切な揺れとより高い温度は、通常、顆粒の完全な溶解を促進し、確保します。次のステップは集中力です。動物のためのゲージ投与の適切な容積は慎重に考慮され、働く溶液の容積によって決定される。10mL/kg以上のような高濃度での経口ガバジは、いくつかの吸収関連の問題を引き起こす可能性があります。十二指腸への顆粒の働く溶液の急速なシャントは、一般的な問題の1つです。吸引性肺炎などの他の問題は、食道への顆粒の働く溶液の受動的逆流に起因し、また18が観察される。濾過は、ゲージ針の体積を減少させ、ハーブ顆粒で詰まるのを防ぎ、顆粒の消化を助ける第3のステップです。4 番目のステップはストレージです。低温(-20°C)での顆粒の作業溶液の貯蔵はよりよい結果を保証する。
動物の生体同等用量を計算するアプローチは、TCMの実践における顆粒の効果を決定するために重要である。体重 (mg/kg) と種は一般的に考慮されます。.代謝率は個々の動物の大きさに関連しているため、体表面積(mg/m2)は、計算19を実行するために頻繁に使用される。体表面積と体重の両方を考慮するのが常識であり、したがって、Meeh-Rubner方程式が使用され、これは薬理学的研究19、20における生体内調査で一般的である。
ウサギ、モルモット、ラット、マウスなどの薬物含有血清製剤には、いくつかの種類の動物が選ばれています。生体内調査では、同じ種が好ましい。ラットは、マウスよりも多くの血清を提供するだけでなく、他の動物よりも進化の面でマウスに近いために選択されました。生体内での用量相当量(ラット:同等の用量の7倍)および患者のための臨床使用も推奨される。処理された細胞または器官が潜在的な毒性反応を引き起こす可能性があるため、血清提供動物の10倍の用量は、生体内調査には一般的に適用されない21。注射、皮膚投与、吸入などの方法は、生体内投与に従って一般的に使用される投与手順である。本研究では、ガビジ針による経口投与を選択した。顆粒投与頻度は1日1回から2回、介入期間は3~14日です。血液の最終的な採取は、通常、前回投与22、23の後2時間以内に行われ、血液中の顆粒の濃度が比較的安定であり、前の研究24によるとピークレベルである場合。
使用前のインビトロアッセイ用薬物含有血清は依然として論争の的である。一部の研究者は、酵素、ホルモン、抗体、および補体25を含む血清中の多数の活性成分の存在のために結果に影響を与える予期しない反応や副作用をもたらす可能性があると考えています。しかし、一部の研究者は、活性成分も不活性化プロセス26によって除去されるかもしれないという反対の意見を持っている。中間地盤に到達するために、本研究では、56°Cの水浴中のインキュベーション前に30分間不活性化した。さらに、生理生理生の血清を使用して潜在的な副作用を排除するブランク血清群が含まれていた。したがって、薬物含有血清は、薬理学的メカニズムまたは治療結果を調べるための潜在的な方法として役立ちでありうる。
同様の方法と比較して、ここでのプロトコルには、次の利点があります: (1) 包括的性。インビトロとインビボ法の両方が同時に使用され、薬理学的効果でお互いをサポートすることができます。(2) 適合性。マウスとラットだけが含まれています。(3)再現性。マウスとラットの両方を低コストで簡単に購入でき、方法を簡単に繰り返すことができます。(4)低コスト。OVX誘発骨粗鬆症マウスモデルは、一般的に使用され、信頼性の高い27、28であり、簡単に作るか、購入することができます。したがって、ここでのプロトコルは、顆粒などの漢方薬の薬理学的効果を研究するための他の方法と比較してより適しています。
ただし、GSK 顆粒を使用するプロトコルにはいくつかの制限があります。まず、3つの用量を投与したが、顆粒は生体内調査において有意な用量依存傾向を示さなかった。その理由は、動物研究のための投与量が敏感ではなく、介入時間が十分に長くないため、さらなる検査が必要である可能性があります。次に、インビトロ並列調査には、より長い期間の介入が必要である。薬物含有血清は、不活性化されるが、長期介入後に副作用を引き起こす可能性がある。第三に、動物の投与に使用される作業溶液の1つのボリュームのみが使用され、将来の研究で変更することができます。最後に、薬物含有血清および投与ルーチンの調製のために選択された動物種は変更することができ、さらなる研究で試験される。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(81804116、81673991、81770107、81603643、81330085)、中国科学技術省革新的チームのためのプログラム(2015RA4002からWYJ)の助成金によって支援されました。中国教育省の革新的なチーム(IRT1270 to WYJ)、上海TCM医療センター(2017ZZ01010 to WYJ)、伝統的な中国医学計画の開発を加速する3年間の行動(ZY(2018-2020)-CCCX-3003からWYJへ、国家主要な研究開発プロジェクト(2018YFC1704302)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | Hyclone laboratories |
SH30265.018 | For cell culture |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G5422 | Osteoblastogenesis |
| Caltrate (CAL) | Wyeth | L96625 | Animal interventation |
| C57BL/6 mice | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Ainimal preparation |
| Dexamethsome | Sigma | D4902 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | Cell frozen |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Sangon Biotech | 60-00-4 | Samples treatmnet |
| Fetal bovine serum | Gibco | FL-24562 | For cell culture |
| Gushukang granules | kangcheng companyin china | Z20003255 | Herbal prescription |
| Light microscope | Olympus BX50 | Olympus BX50 | Images for osteoclastogenesis |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate | Sigma | A8960-5G | Osteoblastogenesis |
| Microscope | Leica | DMI300B | Osteocast and osteoblast imagine |
| M-CSF | Peprotech | AF-300-25-10 | Osteoclastogenesis |
| Μicro-CT | Scanco Medical AG |
μCT80 radiograph microtomograph | Bone Structural analsysis |
| RANKL | Peprotech | 11682-HNCHF | Osteoclastogenesis |
| Sprague Dawley | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Blood serum collection |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | TRAP staining |
References
- Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).
- Zhao, D., et al. The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice. Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).
- Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments. Journal of Visualized Experiments. (123), e55654 (2017).
- Wang, Q., et al. The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).
- Bian, Q., et al. Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro. Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).
- Zhao, D., et al. Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).
- Tang, D. Z., et al. Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of β-Catenin-BMP Signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).
- Tashino, S. "Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).
- Fu, L., et al. Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439 (2016).
- Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).
- Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).
- Li, X. L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice. Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).
- Cui, S. Q., et al. Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis. Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).
- Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study. Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).
- Zhang, Y. P. Pharmacology Experiment. , 2nd edition, People’s medical publishing house. Beijing, China. (1996).
- Zhao, D. F., et al. Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).
- Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
- Zhang, D. Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
- Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human). Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).
- Jiang, Y. R., et al. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells. Chinese Journal of Integrative Medicine. 18 (1), 30-33 (2012).
- Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
- Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
- Li, Y. K. Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
- Zhang, L., et al. A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
- Pacifici, R. Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis. Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).
- Ammann, P., et al. Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency. Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).
- Kimble, R. B., et al. Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period. Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).
