インビボおよびインビトロ実験用グシュカン(GSK)顆粒の調製
Summary
この記事では、動物実験用のグシュカン顆粒およびインビトロ実験用血清を含むGSK顆粒の作業溶液を調製するための詳細なプロトコルを提供する。このプロトコルは、生体内およびインビトロ実験の両方の処方箋と同様に、漢方薬の薬理学的調査に適用することができます。
Abstract
伝統的な漢方薬は、閉経後骨粗鬆症(POP)などの多くの疾患を治療する代替方法としての役割を果たしています。中国で販売されている処方箋であるグシュカン(GSK)顆粒は、POPの治療に骨保護効果があります。体内に投与する前に、1つの標準的な調製手順が一般的に必要とされ、生ハーブからの活性成分の放出を促進し、薬理学的効果と治療結果を高めることを目的とする。本研究では、生体内およびインビトロ実験アッセイにおいてGSK顆粒を用いるための詳細なプロトコルを提案する。著者らはまず、生体内調査のための顆粒の動物に適した投与量を計算するための詳細なプロトコルを提供する:計量、溶解、貯蔵、および投与。次に、マイクロ CT スキャンのプロトコルと骨パラメータの測定について説明します。試料調製、マイクロCTマシンを実行するためのプロトコル、および骨パラメータの定量化を評価した。第3に、血清含有GSK顆粒が調製され、かつ、インビトロ破骨形成および骨芽形成のために薬物含有血清が抽出される。GSK顆粒を1日2回ラットに3日間連続して投与した。その後、血液を採取し、遠心分離し、不活性化し、濾過した。最後に、血清を希釈し、破骨形成および骨芽細胞形成を行うための使用を行った。ここで説明するプロトコルは、顆粒などの漢方薬の薬理学的調査のための参照と考えることができる。
Introduction
伝統的な中国医学(TCM)は、骨粗鬆症1、2を治療するための重要な補完的かつ代替的なアプローチの一つである。水の煎じりは、式3の基本的で最も一般的に使用される形態です。しかし、欠点も存在します:悪い味、キャリッジのための不便さ、短い貯蔵寿命と一貫性のないプロトコル、使用だけでなく、治癒効果を制限します。上記の欠点を避け、より良い効果を追求するために、顆粒が開発され、広く使用されている4.多くの研究は、顆粒5、6、7から1つ以上の有効な成分の薬理学的メカニズムを探索しているが、正確なメカニズムと基礎となる薬理学的プロセスはまだある識別が困難です。これは、1つの顆粒からあまりにも多くの有効成分が同時に類似または反対効果を発揮する可能性があるためです4.したがって、体内に送送る前に顆粒を調造する1つの標準プロトコルの開発は、治療結果に大きな影響を与えるだけでなく、生体内およびインビトロアッセイの両方にも必要とされる。
さらに、クリニックにおける顆粒の治癒効果は、インビトロまたはエクスビボ研究を用いて正確に同定することは困難であり、薬理学的メカニズムが複雑すぎるため課題を生み出します。これを解決するために、1980年代8年にタシノが薬剤含有血清の調製を最初に提案した。それ以来、多くの研究者が顆粒9、10、11を含む漢方薬に薬物含有血清を適用しました。現在、インビトロ調査のための薬物含有血清の選択は、生理学的条件を密接に模倣する1つの戦略とみなされている。
グシュカン(GSK)顆粒は、TCMの理論に照らして臨床実践に基づいて閉経後骨粗鬆症(POP)を治療するために開発された。GSK顆粒は、生体内の卵巣切除(OVX)マウスにおける骨損失を防ぎ、骨細胞性骨吸収を阻害し、骨芽細胞性骨形成を刺激する4。その結果、Li et al. 12は、GSK顆粒が骨形成を刺激するカルシウム受容体の活性を増強することによってOVXマウスにおいて骨保護効果を有することを見出した。GSK顆粒の骨保護効果と薬理学的効果を確認するために、著者らは、作業溶液および薬剤(GSK顆粒)含有血清の調製のための詳細な手順を提供する。さらに、この記事では、OVX誘発骨粗鬆症マウスモデルにおけるGSK顆粒および体外形成/骨芽形成におけるGSK顆粒含有血清の適用について説明する。
GSK顆粒は、いくつかのハーブ13、14で構成され、生理生理生理生理に完全に溶解することができます。したがって、生理食は車両として機能する。シャム投与マウス(シャム)およびOVXマウスを、顆粒投与マウスと同じ量の生理生理生理生理を投与した。マウスに対するGSK顆粒の同等の用量は、Meeh-Rubner方程式15に基づいて計算された。この方程式は、安全な用量を得ることの利点を有するだけでなく、薬理学的効果を保証する 15.GSK顆粒の3つの用量は、次のように生成されました: (1) GSKL: OVX + 低用量GSK顆粒, 2 g/kg/日.(2)GSKM:OVX+中用量GSK顆粒、4 g/kg/日。(3) GSKH: OVX + 高用量 GSK 顆粒, 8 g/kg/日.GSKL、GSKMおよびGSKH群におけるマウスを、GSK顆粒を胃内投与した。ビタミンD3(125国際単位/錠剤)を含む炭酸カルシウム(600mg/錠剤)は、例えば、骨粗鬆症を治療および予防するための成熟した市販品(例えば、カルトレート[CAL])において、陽性対照として使用された。
Protocol
Representative Results
Discussion
TCM剤の顆粒は、製剤や処方箋のための一般的な選択肢の一つとなっています.GSK顆粒は、臨床経験またはTCM理論に基づいていくつかの漢方薬で構成され、副作用が少ないより良い治癒効果を発揮する4.水の煎じと比較して、顆粒はこれらの利点を有する:良い味、配達の利便性、長期貯蔵、標準的なプロトコルおよび一貫した治癒効果、ならびにより高い生産性。現在、顆粒は…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(81804116、81673991、81770107、81603643、81330085)、中国科学技術省革新的チームのためのプログラム(2015RA4002からWYJ)の助成金によって支援されました。中国教育省の革新的なチーム(IRT1270 to WYJ)、上海TCM医療センター(2017ZZ01010 to WYJ)、伝統的な中国医学計画の開発を加速する3年間の行動(ZY(2018-2020)-CCCX-3003からWYJへ、国家主要な研究開発プロジェクト(2018YFC1704302)。
Materials
| α-MEM | Hyclone laboratories |
SH30265.018 | For cell culture |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G5422 | Osteoblastogenesis |
| Caltrate (CAL) | Wyeth | L96625 | Animal interventation |
| C57BL/6 mice | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Ainimal preparation |
| Dexamethsome | Sigma | D4902 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | Cell frozen |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Sangon Biotech | 60-00-4 | Samples treatmnet |
| Fetal bovine serum | Gibco | FL-24562 | For cell culture |
| Gushukang granules | kangcheng companyin china | Z20003255 | Herbal prescription |
| Light microscope | Olympus BX50 | Olympus BX50 | Images for osteoclastogenesis |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate | Sigma | A8960-5G | Osteoblastogenesis |
| Microscope | Leica | DMI300B | Osteocast and osteoblast imagine |
| M-CSF | Peprotech | AF-300-25-10 | Osteoclastogenesis |
| Μicro-CT | Scanco Medical AG |
μCT80 radiograph microtomograph | Bone Structural analsysis |
| RANKL | Peprotech | 11682-HNCHF | Osteoclastogenesis |
| Sprague Dawley | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Blood serum collection |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | TRAP staining |
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