Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

In vivo ve In vitro deneyler için Gushukang (GSK) granül hazırlanması

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59171
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education, 4School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Bu makalede, hayvan çalışmaları için Gushukang granül ve in vitro deneyler için serum içeren GSK granül bir çalışma çözümü hazırlamak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu protokol, bitkisel ilaçların farmakolojik araştırmalarına ve hem in vivo hem de in vitro deneyler için reçete olarak uygulanabilir.

Abstract

Geleneksel Çinli bitkisel tıp, Postmenopozal Osteoporoz (POP) gibi birçok hastalığın tedavisinde alternatif bir yöntem olarak rol oynar. Gushukang (GSK) granüller, Çin 'de pazarlanmış bir reçete, POP tedavisinde kemik koruyucu etkileri var. Vücuda yönetim önce, bir standart hazırlama prosedürü yaygın olarak gereklidir, hangi ham otlar aktif bileşenlerin serbest bırakma teşvik etmek ve farmakolojik etkileri yanı sıra terapötik sonuçları geliştirmek amaçlamaktadır. Bu çalışmada in vivo ve in vitro deneysel olarak GSK granül kullanımı için ayrıntılı bir protokol öneriliyor. Yazarlar ilk in vivo soruşturma için granül hayvan uygun dozajlar hesaplamak için ayrıntılı bir protokol sağlamak: tartım, çözünme, depolama, ve yönetim. Ikinci olarak, bu makalede mikro-CT tarama ve kemik parametrelerinin ölçümü için protokoller açıklanır. Numune hazırlama, mikro-CT makinesini çalıştırmak için protokoller ve kemik parametrelerinin ölçülmesini değerlendirilmiştir. Üçüncü olarak, serum içeren GSK granül hazırlanır ve ilaç içeren serum in vitro osteoclastogenesis ve osteoblastogenesis için ayıklanır. GSK granül üç gün boyunca fareler için günde iki kez intragastrik uygulandı. Daha sonra kan toplanan, santrifübe, inaktive ve filtrelenmiş. Son olarak, serum seyreltilmiş ve osteoclastogenesis ve osteoblastogenesis gerçekleştirmek için kullanılır. Burada açıklanan protokol bitkisel reçete ilaçların farmakolojik araştırmalar için bir referans olarak kabul edilebilir, granül gibi.

Introduction

Geleneksel Çin tıbbı (TCM), osteoporoz tedavisi için önemli tamamlayıcı ve alternatif yaklaşımlardan biridir1,2. Su kaynatma formül3temel ve en sık kullanılan biçimidir. Ancak, dezavantajları da var: kötü tat, taşıma için rahatsızlık, kısa raf ömrü ve tutarsız protokoller, kullanımı yanı sıra iyileştirici etkileri sınırlandırmak. Yukarıdaki dezavantajları önlemek için yanı sıra daha iyi efektler sürdürmek için, granüller geliştirilmiştir ve yaygın olarak kullanılan4. Birçok çalışmada granül5,6,7, bir veya daha fazla etkili bileşenlerin farmakolojik mekanizmaları araştırılmış olsa da, tam mekanizmalar ve altta yatan farmakolojik süreçler hala tanımlamak zordur. Çünkü bir granül çok fazla etkili bileşenleri aynı anda benzer veya karşı etkileri4olabilir. Bu nedenle, gövdeye teslim etmeden önce granül hazırlamak için tek bir standart protokol gelişimi sadece terapötik sonuçlar üzerinde büyük bir etkiye sahip olmaz, hem in vivo hem de in vitro olarak da gereklidir.

Dahası, poliklinikte granüllerin küratif etkileri, farmakolojik mekanizmalar çok karmaşık olduğu için bir zorluk yaratır, in vitro veya ex vivo etütler kullanarak onaylamak ve tam olarak tanımlamak zordur. Bunu çözmek için, ilaç içeren serumun hazırlanması ilk olarak 1980 ' lerde Tashino tarafından önerilmiştir8. O andan itibaren, sayısız araştırmacılar bitkisel tıp ilaç içeren serum uygulanan, granül dahil9,10,11. Şu anda, in vitro araştırmalar için ilaç içeren serum seçimi, fizyolojik koşulları yakından taklit eden bir strateji olarak kabul edilir.

Gushukang (GSK) granüller, TCM teorisi ışığında klinik uygulamaya dayanan Postmenopozal Osteoporoz (POP) tedavisinde geliştirilmiştir. GSK granül, Ovariektomili (OVX) farelerde kemik kaybını önlemekte, osteoklastik kemik reorpsiyonunu inhibe eder ve osteorotik kemik oluşumu4' ü uyarır. Sonuç olarak, li ve al.12 , GSK granüllerinin kemik oluşumunu uyarmak için kalsiyum reseptörün faaliyetlerini geliştirerek OVX farelerinde kemik koruyucu etkilere sahip olduğunu tespit etmiştir. Kemik koruyucu etkilerinin yanı sıra GSK granüllerinin farmakolojik etkilerini onaylamak için, yazarlar burada çalışma çözümleri ve ilaç (GSK Granül)-içeren serum hazırlanması için ayrıntılı bir prosedür sağlar. Dahası, bu makalede, GSK granül bir OVX kaynaklı osteoporoz fare modeli ve GSK granül içeren serum in vitro osteoclastogenesis/osteoblastogenesis için uygulama açıklanır.

GSK granül çeşitli otlar oluşur13,14 ve tamamen tuzlu olarak kolayca çözünebilir. Bu nedenle, saline araç olarak hizmet vermektedir. Sham tarafından çalışan fareler (Sham) ve OVX fareleri, granül uygulanan fareler gibi aynı miktarda tuz uygulanmıştır. Fare için GSK granül eşdeğer dozlarda Meeh-Rubner denklem15dayalı hesaplanır. Bu denklem sadece güvenli dozlarda elde etmek avantajına sahip değil, aynı zamanda farmakolojik etkileri garanti15. GSK granül üç dozlarda aşağıdaki gibi oluşturuldu: (1) GSKL: OVX + düşük doz GSK granül, 2 g/kg/gün. (2) GSKM: OVX + orta doz GSK granül, 4 g/kg/gün. (3) GSKH: OVX + yüksek doz GSK granül, 8 g/kg/gün. Gskl 'de fareler, gskm ve gskh grupları intragastrik GSK granül uygulandı. Vitamin D3 (125 Uluslararası ünite/tablet) ile kalsiyum karbonat (600 mg/tablet), örneğin, Olgun ve pazarlanan bir ürün (örneğin, Caltrate [CAL]) osteoporoz tedavisinde ve önlenmesi için, olumlu bir kontrol olarak kullanıldı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneysel prosedürler, Shanghai Üniversitesi TCM (SZY201604005) Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi onayı ile yapılmıştır.

1. GSK çalışma çözümünün hazırlanması ve yönetilmesi

  1. Fare için GSK granül eşdeğer dozlarda hesaplayın.
    1. Meeh-Rubner denklemine dayalı vücut yüzeyini hesaplayın15: vücut yüzeyi = k x (vücut ağırlığı2/3)/1000, k değerleri, insan için 10,6 ve fare için 9,1. İnsan vücudu ağırlığı 70 kg, sonra insan vücudu yüzeyi (m2) = 10,6 x (702/3)/1000 = 1,8 m2olarak varsayılarak. Fare vücut ağırlığı 20 g (0,02 kg; örn., 1 ay eski, kadın, C57/BL6), sonra fare gövdesi yüzeyi (m2) = 9,1 x (0,022/3)/1000 = 0,0067 m2olarak varsayılarak.
    2. Hesaplanan gövde yüzeyine göre, insan ve fare için vücut dönüşüm oranını hesaplayın. İnsan: 70 kg/1.8 m2 = 39. Fare: 0,02 kg/0.0067 m2 = 3. GSK granül = 20 g/70 kg x 39/3 = 3,72 g/kg ≈ 4 g/kg.
    3. Fare başına 20 g vücut ağırlığı dayalı, fare için eşdeğer doz hesaplamak: 4 g/kg x 0,02 kg = 0,08 g.
    4. Grup başına 20 fareye dayanan üç eşdeğer doz GSK granül hesaplayın ve 3 ay (90 gün) süren bir müdahale: (1) GSKL (OVX + düşük doz GSK granül [2 g/kg/gün]): 0,04 g fare/gün x 20 fareler x 90 gün = 72 g. (2) GSKM (OVX + orta doz GSK granül [4 g/kg/ gün]): 0,08 g fare/gün x 20 fare x 90 gün = 144 g. (3) GSKH (OVX + yüksek doz GSK granül [8 g/kg/gün]): 0,12 g fare/gün x 20 fare x 90 gün = 216 g.
      Not: kaybı dengelemek için uygulamada GSK granüllerin ek% 20 ' sini hazırlayın.
  2. Vücut ağırlığına göre fare başına GSK granül hacmini hesaplayın15: örn., hacim (V) = 0,24 ml/fare/gün.
    Not: fare için intragastrik yönetim hacmi 0,12 mL/10 g 'dir.
  3. 10 gün değerinde üç doz GSK granül tartın. 8 g, 16 g ve 24 g GSK granül ağırlığında ve sırasıyla GSKL, GSKM ve GSKH olarak hizmet vermektedir.
  4. Vitamin D3 (CAL) ile kalsiyum karbonat eşdeğer dozu hesaplayın adım 1.1.1 ve 1.1.2 gibi Meeh-Rubner denklemi15 dayalı fare IÇIN: Cal dozaj = 2 tablet/70 kg x 39/3 = 0,372 tablet/kg ≈ 0,4 tablet/kg.
  5. Fare başına 20 g 'lık bir vücut ağırlığına göre (örn. 1 ay eski, kadın, C57/BL6), fare için CAL eşdeğer dozajı hesaplayın: 0,4 tablet/kg x 0,02 kg = 0,008 tablet. Sonra grup başına 20 fare ve 3 ay (90 gün): 0,008 tablet x 20 x 90 = 14,4 tabletler için kalıcı bir müdahale dayalı CAL eşdeğer dozu hesaplayın. 10 günlük CAL (1,6 tabletler) ağırlığında.
  6. Dağılma
    1. 50 mL tüp içine GSK granül 8 g yerleştirin. 48 mL tuz ekleyin ve tamamen çözülür tüp sallayın.
      Not: tam çözünme için standart sediment yokluğunda. Bir gavaj iğne çalışma çözümünü çizebilir ve daha sonra sorunsuz uzaklaştırabilir Eğer tam çözünme daha da teyit edilebilir.
    2. Adım 1.5.1, 16 g ve 24 g GSK granül ile tekrarlayın.
    3. 1,6 tabletler (10 gün ' değerinde) CAL 'yi bir 50 mL tüpüne yerleştirin. 48 mL tuz ekleyin ve tamamen çözülür tüp sallayın.
      Not: çalışma çözümleri-4 °C ' de depolanabilir ve her 10 günde bir hazırlanır.
  7. Intragastrik yönetim
    1. Fareyi ileri doğru bakacak şekilde farenizi (1 ay eski, dişi, C57/BL6) arkasına tutun ve bu pozisyonda sıkıca kalmasını sağlayın. Yönetim öncesinde 2 − 3 dakika boyunca fareyi sakin tutun.
      Not: araştırmacının farenin önünde açıkça görebildiğinden emin olun. Özellikle yeni araştırmacılar için fare ısırıklarını önlemek için eldiven giyin.
    2. Gavaj iğne (Boyut: #12, 40 mm) GSK granül çalışma çözeltisi yerleştirin ve çalışma çözeltisi 0,24 mL çizin.
    3. Gavaj iğne mide ulaştığında kadar ağzına bir tarafı ile fare içine gavaj iğne koyun.
      Not: gavaj iğne mide ulaştı onaylamak için: (1) gavaj iğne direnç hissi karşılaştığında. Bu arada, fare gavaj iğne özofagus fiziksel daralma geçtikten önce yutma eylem gösterir. (2) yaklaşık 0,5 mL çalışma çözeltisi fare içine enjekte ve 1 dakika bekleyin. Fareden gelen bir çözüm yoksa, bu gavaj iğnesi mide ulaştı anlamına gelir.
    4. GSK granül çalışma çözeltisi enjekte (0,24 ml/Mouse) mide içine ve sonra gavaj iğne dışarı çizmek. Fareyi kafesine geri dönün.
    5. Adım 1.6.4 CAL çözümü ile yineleyin ve 0,24 mL CAL çözüm fare başına enjekte.
      Not: CAL çözüm hacmi adım 1,2 olarak hesaplanır.

2. Micro-CT tarama

  1. T ıbia hasat ve hazırlama
    1. 300 mL/100 g 80 mg/kg ketamin ile intraperitoneally anestezize fare 90 günün müdahale takip gün. Fare tamamen anestezize olup olmadığını onaylamak için ayak parmakları bir iğne tutam kullanın. Hiçbir yanıt başarılı anestezi gösterir. Sonra servikal dislocation ile fareyi öldürmek.
    2. Tacks ile köpük üzerinde kollar ve bacaklar ile fareyi düzeltin.
    3. Kesme cilt (Boyut: 8,5 cm) ve cımbız (boyutu: 10 cm) distal ucuna proksimal ve sonra hasat tibias ile cildi kesip.
    4. Hemen% 70 Etil alkol içine kaval koymak ve 3 kez yıkayın.
  2. Sünger köpük ile farenin sol Tibia Wrap ve bir örnek tüp içine koymak (35 mm çapı, 140 mm uzunluğunda).
    Not: numunenin uzun ekseni, örnek tüpün yanında olmalıdır. Tibia puanların proksimal ucunu yukarı doğru emin olun.
  3. Micro-CT 80 tarama makinesini çalıştırma
    1. Micro-CT 80 tarama makinesini oda sıcaklığında başlatın.
    2. Örnek tüpü Micro-CT 80 olarak ayarlayın ve aşağıdaki tarama parametreleriyle çapraz kesit taramasını başlatın: piksel boyutu 15,6 μm, tüp voltajı 55 kV, tüp akımı 72 μA, entegrasyon süresi 200 ms, uzamsal çözünürlük 15,6 μm, piksel çözünürlüğü 15,6 μm ve görüntü matrisi 2048 x 2048.
      Not: ön tarama ile kortikal kemikten iptal edilen kemik ayırt edilir. Tibia tarama alanı distal ucuna tibial Plato altında 5 mm gelen iptal kemik alanı olarak tanımlanır.
  4. Kemik parametresinin ölçülmesini
    1. Kesit taramasını tamamladıktan sonra sol tizarın görüntülerini alın.
    2. Yoğunluk eşiğini 245 − 1000 olarak ayarlayın. Aşağıdaki kemik parametrelerini ölçmek için mikro-CT değerlendirme programı V 6.6 kullanın: kemik mineral yoğunlukları (BMD), toplam hacim üzerinde kemik hacmi (BV/TV), trabeküler kemik numarası (TB. N), trabeküler kemik kalınlığı (Tb.Th), hem de kemik trabeküler kemik ayrımı ( TB. SP).

3. in vitro deneyler için kan serumu hazırlanması

  1. Hesaplama
    1. 0,2 kg (1 ay eski, kadın, Sprague-Dawley) bir sıçan vücut ağırlığı dayanarak, GSK granül dozajı hesaplayın: insan dozu/gün x vücut ağırlığı insan x K/vücut ağırlığı fare = 20 g/70 kg/gün x 70 kg x K (K = 0,018)/0,2 kg = 2 g/kg/gün.
      Not: K, insan ve fare15 arasındaki farmakolojik dönüşüm katsayısı (k = 0,018).
    2. 3.1.1 adımı yineleyin ve aşağıdaki dozlarda hesaplayın.
      1. GSKL dozajı hesaplayın: 10 g/70 kg/gün x 70 kg x K/0.2 kg = 1 g/kg/gün.
      2. GSKM dozajı hesaplayın: 20 g/70 kg/gün x 70 kg x K/0.2 kg = 2 g/kg/gün.
      3. GSKL dozajı hesaplayın: 40 g/70 kg/gün x 70 kg x K/0.2 kg = 4 g/kg/gün.
      4. CAL dozajı hesaplayın: 2 tablet/70 kg/gün x 70 kg x K/0.2 kg = 0,2 tablet/kg/gün.
    3. GSK granül ve CAL toplam dozajı hesaplayın.
      1. GSKL için toplam dozajı hesaplayın: 1 g/kg/gün x 0,2 kg x 6 fareler x 3 gün = 3,6 g.
      2. GSKM için toplam dozajı hesaplayın: 2 g/kg/gün x 0,2 kg x 6 fareler x 3 gün = 7,2 g.
      3. GSKH için toplam dozajı hesaplayın: 4 g/kg/gün x 0,2 kg x 6 fareler x 3 gün = 14,4 g.
      4. Hesaplamak CAL doz = 0,2 tablet/kg/gün x 0,2 kg x 6 Rats x 3 gün = 0,72 tablet.
        Not: 100 mL kültür ortamını (% 20 GSK granül içeren serum) hazırlamak için toplam 10 mL GSK granül içeren serum gereklidir. Her sıçan (6 sıçan/grup) Santrifüjden sonra 1,5 − 2 mL GSK granül içeren serum sağlaması bekleniyor.
    4. Vücut ağırlığına göre sıçan başına uygulanan GSK granül hacmini hesaplayın15: örn., hacim (V) = 2 ml/Rat/gün.
      Not: sıçan için intragastrik yönetim hacmi 0,1 mL/10 g 'dir.
  2. Üç doz GSK granül 3 gün değerinde ağırlığında. 3,6 g, 7,2 g ve 14,4 g GSK granül tartım ve sırasıyla GSKL, GSKM ve GSKH olarak hizmet vermektedir. CAL grubu için 0,72 tablet tartın.
  3. Bir 50 mL tüp içine GSK granül 7,2 g yerleştirin. 36 mL tuz ekleyin ve tamamen çözülür tüp sallayın. 3,6 g ve 14,4 g GSK granül ile tekrarlayın.
  4. 2 mL GSK çalışma çözeltisi ile intragastrik yönetim için Bölüm 1,6 tekrarlayın.
    Not: serum hazırlamak için aynı hacimde (sıçan başına 2 mL) aynı hacmi yönetin ve in vitro asder için boş bir kontrol grubu olarak görev yapar.
  5. GSK içeren serumun hazırlanması
    1. İntraperitoneally ile fareler anestezize 300 mL/100 g 80 mg/kg ketamin 1 h GSK granül son uygulamadan sonra. Sıçan tamamen anestezize olup olmadığını onaylamak için ayak parmakları bir iğne tutam kullanın. Hiçbir yanıt başarılı anestezi gösterir.
    2. Cildi ve peritonumu yaktıktan sonra düz çalışma makas kullanarak sıçan toraks alt karın maruz.
      Not: cerrahi enstrüman, yüksek sıcaklıklarda ve yüksek basınçlarda kullanımından önce sterilize edilmelidir. Cerrahi alan kan toplama sırasında% 70 etanol ile sterilize edilmelidir.
    3. Damar açık bir şekilde ortaya çıkarmak için doku kağıt ile abdominal aort bağ dokusu çıkarın.
    4. 10 ml, 22 G şırınga kullanarak abdominal aort kan çizin. Sonra iğne çıkarın ve 15 mL steril tüp kan transfer. Genellikle, 6 − 8 mL kan bir sıçan elde edilebilir.
      Not: her sıçan kan çizerken yaşamaya devam edilmelidir. Bir gösterge, karın aort sıçan hayatta olduğunda titreşimler. Sıçan kan çektikten sonra öldü.
    5. Tüpün içinde kan pıhtılaşmış olana kadar tüpü 30 − 60 dakika boyunca oda sıcaklığında dik tutun. Daha sonra 20 dakika boyunca 500 − 600 x g 'lik tüpü Santrifüjden (serum) bir gruptan (6 sıçan) 1 50 ml steril tüpe transfer ederek karıştırın.
    6. 56 °C ' lik su banyosundan 30 dakika boyunca serumu inaktive ederek serum bir 0,22-μm-gözenek boyutunda hidrofilik polithersülfon şırınga filtresi kullanarak serumu filtreleyin. Uzun süreli kullanım için-80 °C ' de saklayın (1 yıldan az).
      Not: süzülmüş serum in vitro osteoclastogenesis ve osteoblastogenesis için kullanılabilir.
  6. Uygulama
    1. In vitro osteoclastogenesis
      1. L-glutamin, ribonucleosides ve deokribonucleosides içeren asgari kartal Orta (α-MEM) ile 1:4 oranında GSK içeren serum (GSKL, GSKM, GSKH) üç dozajlar seyreltilmeli.
        Not: in vitro osteoclastogenesis ve osteoblastogenesis için GSK içeren serumun son konsantrasyonunun% 20 olduğundan emin olun.
      2. Osteoclastogenesis için 4 − 6 hafta eski C57BL/6 fareden kemik iliği makrofajları (BMMs) ve makrophaj koloni uyarıcı faktörü (M-CSF, 10 ng/mL) ve reseptör aktivatörü ile BMMs 'yi teşvik etmek için adım 3.6.1.1 dan seyreltilmiş GSK içeren serum (200 μL/Well) ekleyin Nükleer faktör-κB ligand için (RANKL, 100 ng/mL) daha önce açıklanan2.
    2. In vitro osteoblastogenesis
      1. 3.6.1.1 adım yineleyin.
      2. Daha önce16açıklanan osteoblast oluşturmak için 4 − 6 hafta eski C57BL/6 farelerden kemik mesenkimal kök hücrelere (bmscs) SEYRELTILMIŞ GSK içeren serum (2 ml/Well) ekleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Micro-CT tarama sonuçları, OVX farelerinin tuzlu kontrol farelerine göre önemli kemik kaybına neden olduğunu göstermiştir (Şekil 1a). GSK granüllerinin müdahalesi (90 gün) özellikle GSKM grubunda (Şekil 1B) BMD 'yi büyük ölçüde artırmıştır. BMD, BV/TV, TB. N ve Tb.Th gibi kemik yapısı parametreleri niceleyilmiş. GSK granül tedavileri BMD, BV/TV, TB. N ve Tb.Th artmış ama TB. SP (Şekil 1C) azaldı.

Tartrate dirençli asit fosfataz (TRAP) boyama, OVX farelerinde kontrol farelerine kıyasla osteocsürer sayısında bir artış gösterdi (Şekil 2a). GSK granül tedavileri OVX grubuna kıyasla TRAP-pozitif osteocsürer azalır. Bu bulgular, TRAP-pozitif alanın trabeküler kemik yüzeyine (OCs/BS%) oranını hesaplayarak teyit edildi ve osteoklast sayı kemik alanına oranı (OCs/mm2). Bu nicel sonuçlar, OVX grubuna kıyasla GSK gruplarındaki osteocsürer sayısında önemli bir azalma göstermiştir (Şekil 2B, C).

GSK granül içeren serum kemik iliği makrofajları (BMMs) için 4 − 6 hafta eski C57BL/6 fareden osteoklast oluşturmak için uygulanan ve osteoksürer sayısı TRAP boyama tarafından analiz edildi. Sonuçlar, GSK granül içeren serumun, kontrol grubuna göre GSK gruplarındaki TRAP-pozitif osteocsürer sayısını azalttı (Şekil 3A, B).

Alkalin fosfataz (ALP) boyama, C57BL/6 farelerden MSCs ile osteoblastogenesis üzerinde GSK granül-ilaçlanmış serum stimüle edilen uyarıcı etkileri gösterdi. ALP boyama, GSK granül ilaçlanmış serumun üç grubunun da kontrol grubuna kıyasla ALP 'in (Şekil 4A, B) aktivitesini artırdığında gösterdi.

Figure 1
Şekil 1: GSK granül OVX kaynaklı fareler kemik kaybını önler. (A) fareler, 3 ay boyunca GSK granül ile tedavi edildi ve MIKRO-CT analizi yapmak için sol tikop hasat edildi. Sol tiresiyonun trabeküler kemiğinin temsili üç boyutlu (3D) yeniden yapılanma görüntüleri gösterildi. Ölçek çubuğu = 0,5 mm. (B) kemik mineral yoğunluğu (BMD) ölçüldü ve niceleyilmiş. (C) trabeküler kemik numarası (TB. N), toplam hacim üzerinde kemik hacmı (BV/TV), trabeküler kemik kalınlığı (TB.TH) ve trabeküler kemik ayrımı (TB. SP) gibi sol tiresiyonun kemik parametreleri, tüm gruplarda trabeküler kemik yapısı ile ilgili gösterilecektir. GSKL, GSKM ve GSKH grupları kontrol ile karşılaştırıldı (con; Sham + Saline) ve OVX grubu (n = 6, *p < 0,05, Versus Control; *p < 0,05, Versus OVX). CAL: Vitamin D3 ile kalsiyum karbonat. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: GSK granül OVX fareler osteocsürer sayısını bastırır. (A) GSK tedavi edilen fareler hasat edildikten sonra lomber vertebra 3 (L3) üzerinde tuzak boyama yapıldı. Kontrol (Sham + Saline), OVX (OVX + Saline) gelen tuzak sonuçları, CAL (OVX + Caltrate), GSKL (OVX + düşük doz GSK, 2 g/kg/gün), GSKM (OVX + orta doz GSK, 4 g/kg/gün) ve GSKH (OVX + yüksek doz GSK, 8 g/kg/gün) ölçüldü ve incelendi. Ölçek çubuğu = 100 μm (üst görüntüler) veya 50 μm (alt görüntüler). (B) kemik yüzeyinde osteoclast kaplı yüzeyin ölçülmesini. (C) osteoclast sayı. Değerler ortalama ± standart hata olarak ifade edildi (SEM). *P < 0,05, OVX VERSUS kontrol (con); *P < 0,05, Cal veya GSKL/gskm/GSKH GRUPLARı OVX grubuna karşı. Tüm her şeyi en az 3 fareyle tekrarladık. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: GSK granül ilaçlı-serum kemik iliği makrofajları (BMMs) osteoclastogenesis azalır. (A) C57BL/6 fareden (4 − 6 hafta) gelen Bmms hasat edildi ve m-CSF (10 ng/ml) ve rankl (100 ng/ml) (kontrol), m-CSF ve rankl artı GSK veya Cal ilaçlı serumlar ile Kültürlenmiş. Osteoclastogenesis, 4 − 6 günü TRAP boyama ile değerlendirildi. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) osteocsürer sayısı niceleyilmiş. *P < 0,05, GSKL/gskm/GSKH karşı kontrol grupları. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: GSK granül-ilaçlanmış serum osteoblastogenesis teşvik. (A) C57BL/6 fareden (4 − 6 haftalık) kemik mezenkimal kök hücreler (MSCS) izole edilmiş ve GSK veya Cal ilaçlı serum ile tedavi edilmiştir. ALP boya osteoblastogenesis değerlendirmek için 7 gün yapıldı. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Osteoblastların sayısı niceleyilmiş. *P < 0,05, Cal veya GSKL/gskm/GSKH karşı kontrol grupları. Tüm asder en az 3 fare veya 3 kez tekrarlandı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TCM ajanları granüller formülasyonlar veya reçete için ortak seçeneklerden biri haline gelmiştir. GSK granüller klinik deneyimler veya TCM teorisi dayalı çeşitli bitkisel ilaçlar oluşur, ve daha az yan etkileri ile daha iyi küratif efektler uygulamak4. Su kaynatma ile karşılaştırıldığında, granül bu avantajları vardır: iyi tat, teslimat kolaylığı, uzun süreli depolama, standart protokol ve tutarlı iyileştirici etkileri, yanı sıra daha yüksek verimlilik. Şu anda, granüller TCM en sık kullanılan eczane oluşumları biridir. Ancak, farmakolojik etkilerinin temel mekanizmaları hala nadiren incelenmiştir. Temel farmakolojik mekanizmaları incelemek için granül hazırlanması açısından kritik adımları belirlemek gereklidir.

Geçtiğimiz yıllarda, bitkisel ilaçtan bir veya daha fazla temsilcilik etkili bileşenler genellikle yapısal netlik nedeniyle moleküler özleri ve farmakolojik sonuçlar gerçekleştirmek için kullanılmıştır. TCM otlar5,6,7etkili bileşenleri ile iyileştirici etkileri anlamak için birçok soruşturma yapılmıştır. Ancak, karmaşık çevre nedeniyle bir hastada ne olacağını taklit etmek hala zordur, birlikte çalışan birçok etkili bileşenleri ile. Bu sorunu çözmek için, granül ile yapılan araştırmalar farmakolojik süreçleri keşfedebilir ve etkili bileşenlerle ilgili araştırmalara kıyasla Moleküler çalışmalar gerçekleştirmekte tek bir seçimdir.

Granüller için çalışma çözümlerinin hazırlanması dört temel adım içerir. İlk adım çözünme. Granüller genellikle daha fazla soruşturmadan önce çözülür tamamlamak için karıştırma sonra tuz karıştırılır. Granüllerin miktarı ve özelliği, çözünme işlemi sırasında granüllerin süresini ve kararlılığını etkiler. Çözünme süresi ve istikrar varyasyonu otlar üzerinde bağlıdır, onların fiziksel nedeniyle, kimyasal, ve farmakolojik özellikleri17. Uygun sallayarak ve yüksek sıcaklık genellikle teşvik ve granül tam çözünme sağlamak. Bir sonraki adım konsantrasyon. Hayvanlar için gavaj yönetiminin uygun hacmi dikkatle kabul edilir ve çalışma çözeltisi hacmine göre belirlenir. Yüksek konsantrasyonlarda oral gavages, 10 mL/kg veya daha fazla gibi, birkaç emilim ile ilgili sorunlara yol açabilir. Duodenum içine granül çalışma çözeltisi hızlı manevra bir ortak sorundur. Diğer sorunlar, aspirasyon pnömoni gibi, özofagus içine granül çalışma çözeltisi pasif reflü nedeniyle, ayrıca gözlenen18. Filtrasyon, hangi gavaj iğne hacmi azaltmak için yardımcı olur ve bitkisel granül ile tıkanmış olmaktan önler, yanı sıra granül sindirim AIDS üçüncü adımdır. Dördüncü adım saklama alanı. Düşük sıcaklıkta (-20 °C) granül çalışma çözeltilerin depolanması daha iyi sonuçlar sağlar.

Hayvan biyoeşdeğer doz hesaplamak için yaklaşım TCM uygulamada granül etkilerini belirlemek için önemlidir. Vücut ağırlığı (mg/kg) ve türler yaygın olarak değerlendirilir. Vücut yüzeyi alanı (mg/m2) hesaplama gerçekleştirmek için sıklıkla kullanılır19 çünkü Metabolik oran bireysel hayvanın boyutuna bağlı. Her iki vücut yüzey alanı ve vücut ağırlığı dikkate almak için ortak anlamda, ve bu nedenle, Meeh-Rubner denklem kullanıldı, farmakolojik çalışmalarda in vivo araştırmalar yaygındır19,20.

Tavşan, kobay, fareler ve fareler gibi ilaç içeren serum hazırlama için çeşitli hayvan çeşitleri seçilir. In vivo araştırmalar için aynı tür tercih edilir. Fareler, sadece fareler daha fazla serum sağlamak değil, aynı zamanda diğer hayvanlardan daha evrim açısından fareler daha yakın olduğu için seçilmiştir. Doz eşdeğeri in vivo (sıçan: eşdeğer doz 7-kat) ve hastalar için klinik kullanım da önerilir. Serum tarafından sağlanan hayvanların on kat eşdeğer dozu, tedavi edilen hücreler veya organlar potansiyel toksik reaksiyonlara yol açabileceği için in vivo araştırmalar için yaygın olarak uygulanmaz21. Enjeksiyon, cilt yönetimi ve inhalasyon gibi yöntemler, in vivo yönetimler uyarınca yaygın olarak kullanılan yönetim prosedürlerdir. Bu çalışmada gavaj iğneler tarafından oral uygulama seçildi. Granül yönetim frekansı günde bir kez iki kez değişir ve müdahale süresi 3 − 14 gündür. Kan son koleksiyonu genellikle içinde gerçekleştirilir 2 son yönetim sonra h22,23, kan granül konsantrasyonu nispeten istikrarlı ve bir önceki çalışmaya göre tepe düzeyinde24.

Kullanmadan önce in vitro asdında ilaç içeren serum hala tartışmalıdır. Bazı araştırmacılar, enzim, hormon, antikorlar dahil olmak üzere, serum çok sayıda aktif bileşenlerin varlığı nedeniyle sonuçları etkileyen beklenmeyen reaksiyonlar veya yan etkileri, neden olabilir tutun ve25tamamlar. Ancak, bazı araştırmacılar aktif bileşenlerin de devre dışı bırakma işlemi26tarafından kaldırılabilecek zıt görüş tutun. Orta bir yere ulaşmak için, bu çalışmada serum 56 °C ' de 30 dakika boyunca su banyosundan önce inaktive edildi. Dahası, su içinde tedavi edilen hayvanlardan oluşan serum, olası yan etkileri ele almak için kullanılan, boş bir serum grubu dahil edildi. Bu nedenle, ilaç içeren serum farmakolojik mekanizmaları veya terapötik sonuçları araştırmak için potansiyel bir yöntem olarak hizmet verebilir.

Benzer yöntemlerle karşılaştırıldığında, burada protokol aşağıdaki avantajları vardır: (1) anlayış. Hem in vitro hem de vivo yöntemleri aynı anda kullanılır ve farmakolojik etkilere karşı birbirleriyle karşılıklı destek verebilir. (2) uygunluk. Sadece fareler ve fareler dahil edilir çünkü yakından ilişkilidir. (3) tekrarlanabilirlik. Hem fareler hem de fareler düşük maliyetle kolayca satın alınır ve Yöntemler kolayca tekrarlanabilirler. (4) düşük maliyetli. OVX kaynaklı osteoporotik fare modeli yaygın olarak kullanılan ve güvenilir,27,28 ve kolayca yapılabilir veya satın alınabilir. Bu nedenle, buradaki protokoller, granül gibi bitkisel ilacın farmakolojik etkilerini incelemek için diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında daha uygundur.

Ancak, GSK granüller ile protokoller için çeşitli sınırlamalar vardır. İlk olarak, üç dozajlar uygulandı, granüller in vivo araştırmalar için önemli dozda bağımlı eğilim göstermesine rağmen. Nedeni hayvan çalışmaları için dozajlar hassas değildir ve müdahale süresi daha fazla test gerektiren yeterince uzun değildir olabilir. Ardından, in vitro paralel araştırmalar için daha uzun bir müdahale gereklidir. İlaç içeren serum, inaktive olsa da, uzun süreli müdahale sonrasında yan etkilere neden olabilir. Üçüncü olarak, çalışan çözümün sadece bir hacmi, gelecekteki çalışmalarda değiştirilebilir hayvan yönetimi için kullanılır. Son olarak, ilaç içeren serum ve yönetim rutinleri hazırlanması için seçilen hayvan türleri değiştirilebilir ve daha fazla çalışmada test edilecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışmada Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 ve 81330085), yenilikçi takım, bilim ve Teknoloji Bakanlığı (2015RA4002 WYJ), programı için program hibe tarafından desteklenmektedir Yenilikçi takım, Çin Eğitim Bakanlığı (WYJ için IRT1270), Şangay TCM tıbbi merkezi kronik hastalık (2017ZZ01010 WYJ için), üç yıl eylem geleneksel Çin tıp planının gelişimini hızlandırmak için (ZY (2018-2020)-CCCX-3003 WYJ için), ve Ulusal anahtar araştırma geliştirme projeleri (2018YFC1704302).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM Hyclone
laboratories		 SH30265.018 For cell culture
β-Glycerophosphate Sigma G5422 Osteoblastogenesis
Caltrate (CAL) Wyeth L96625 Animal interventation
C57BL/6 mice SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Ainimal preparation
Dexamethsome Sigma D4902
Dimethyl sulfoxide Sigma D2438 Cell frozen
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Sangon Biotech 60-00-4 Samples treatmnet
Fetal bovine serum Gibco FL-24562 For cell culture
Gushukang granules kangcheng companyin china Z20003255 Herbal prescription
Light microscope Olympus BX50 Olympus BX50 Images for osteoclastogenesis
L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate Sigma A8960-5G Osteoblastogenesis
Microscope Leica DMI300B Osteocast and osteoblast imagine
M-CSF Peprotech AF-300-25-10 Osteoclastogenesis
Μicro-CT Scanco
Medical AG		 μCT80 radiograph microtomograph Bone Structural analsysis
RANKL Peprotech 11682-HNCHF Osteoclastogenesis
Sprague Dawley SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Blood serum collection
Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT TRAP staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).
  2. Zhao, D., et al. The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice. Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).
  3. Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments. Journal of Visualized Experiments. (123), e55654 (2017).
  4. Wang, Q., et al. The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).
  5. Bian, Q., et al. Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro. Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).
  6. Zhao, D., et al. Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).
  7. Tang, D. Z., et al. Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of β-Catenin-BMP Signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).
  8. Tashino, S. "Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).
  9. Fu, L., et al. Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439 (2016).
  10. Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).
  11. Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).
  12. Li, X. L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice. Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).
  13. Cui, S. Q., et al. Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis. Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).
  14. Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study. Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).
  15. Zhang, Y. P. Pharmacology Experiment. , 2nd edition, People’s medical publishing house. Beijing, China. (1996).
  16. Zhao, D. F., et al. Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).
  17. Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
  18. Zhang, D. Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
  19. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human). Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  20. Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).
  21. Jiang, Y. R., et al. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells. Chinese Journal of Integrative Medicine. 18 (1), 30-33 (2012).
  22. Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
  23. Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
  24. Li, Y. K. Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
  25. Zhang, L., et al. A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
  26. Pacifici, R. Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis. Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).
  27. Ammann, P., et al. Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency. Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).
  28. Kimble, R. B., et al. Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period. Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).

Tags

Tıp sayı 147 geleneksel Çin tıbbı gushukang granül ilaç içeren serum serum farmakolojisi osteoclastogenesis Ovariektomili fareler osteoblastogenesis In vivo in vitro
In vivo ve In vitro deneyler için Gushukang (GSK) granül hazırlanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y., Wang, Q., Liu, S., Wang,… More

Zhao, Y., Wang, Q., Liu, S., Wang, Y., Shu, B., Zhao, D. Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments. J. Vis. Exp. (147), e59171, doi:10.3791/59171 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter