Dette manuskript beskriver en eksperimentel protokol til evaluering af de morfologiske egenskaber og funktionel status af bånd synapser i normale mus. Den nuværende model er også velegnet til støj-induceret og aldersrelaterede cochlear synaptopathy-begrænsede modeller. De korrelative resultater af tidligere mus undersøgelser er også drøftet.
Cochlear indre hårceller (IHCs) sender akustiske signaler til spiral ganglion neuroner (SGNs) gennem bånd synapser. Flere eksperimentelle undersøgelser har vist, at hårcelle synapser kan være de oprindelige mål i sensorineuralt høretab (SNHL). Sådanne undersøgelser har foreslået begrebet cochlear “synaptopathy”, som refererer til ændringer i bånd synapse nummer, struktur, eller funktion, der resulterer i unormal synaptisk transmission mellem IHCs og SGNs. Mens cochlear synaptopathy er irreversibel, påvirker det ikke høretærsklen. I støj-induceret eksperimentelle modeller, begrænset skade på IHC synapser i udvalgte frekvensområder er ansat til at identificere de miljømæssige faktorer, der specifikt forårsager synaptopati, samt de fysiologiske konsekvenser af at forstyrre dette indre øre Kredsløb. Her præsenterer vi en protokol til analyse af cochlear synaptisk morfologi og funktion i en bestemt frekvens region i voksne mus. I denne protokol udføres cochlear lokalisering af specifikke frekvensområder ved hjælp af sted-frekvens kort i forbindelse med cochleogram-data, hvorefter de morfologiske egenskaber ved bånd synapser evalueres via synaptisk immun. Den funktionelle status af bånd synapser bestemmes derefter baseret på amplituder af auditive Brain EM Response (ABR) Wave I. Den foreliggende rapport viser, at denne fremgangsmåde kan bruges til at uddybe vores forståelse af patogenesen og mekanismerne i den synaptiske dysfunktion i cochlea, som kan støtte i udviklingen af nye terapeutiske interventioner.
Frekvenser i intervallet ca. 20 \ u201220, 000 Hz kan opfattes som auditive stimuli af mennesker. Menneskelig hørelse er normalt mest følsom i nærheden af 1.000 Hz, hvor det gennemsnitlige lydtrykniveau er 20 μPa hos unge voksne (dvs. 0 decibel lydtryksniveau [dB SPL]). Under visse patologiske forhold er høretab begrænset til bestemte frekvenser. For eksempel, i de tidlige stadier af støj-induceret høretab (NIHL), en “hak” (dvs., hørelse tærskelhøjde) kan observeres i audiogram ved 4 kHz1. Langs pattedyr cochlear-partitionen producerer dens gradueringer af stivhed og masse et eksponentielt frekvens kort med højfrekvent lyddetektering ved foden af cochlea og lavfrekvens detektering ved Apex2. Faktisk er der et cochlear sted-frekvens kort langs basilær membranen, hvilket fører til, hvad der er kendt som tonotopic Organization2,3. Hvert givet sted på basilær membranen har den højeste følsomhed for kun en bestemt lydfrekvens, som normalt betegnes som den karakteristiske frekvens3,4, selv om responser på andre frekvenser også kan observeres.
Til dato, forskellige musemodeller har været ansat til at undersøge normal funktion, patologiske processer, og terapeutisk virkning i auditive system. Præcis viden om fysiologiske parametre i mus cochlea er en forudsætning for sådanne undersøgelser af høretab. Musens cochlea er anatomisk inddelt i apical, midterste og basal sving, som svarer til forskellige frekvensområder. Ved at beskrive Auditive nerve afferenter på cochlear Nucleus for at analysere deres tilsvarende perifere innervations steder i cochlea lykkedes det Müller et al. at etablere cochlear Place-frekvens kortet i den normale mus in vivo5. I intervallet 7,2 – 61.8 kHz, som svarer til positioner mellem 90% og 10% af den fulde længde af basilær membranen, kan musens cochlear-sted-frekvens kort beskrives ved en simpel lineær regressions funktion, hvilket tyder på en relation mellem normaliseret afstand fra cochlear base og logaritmen af den karakteristiske frekvens5. I laboratorie mus kan sted-frekvens kortet bruges til at udforske forholdet mellem høre tærskler inden for bestemte frekvensområder og cochleograms, der viser antallet af manglende hårceller i relative regioner langs basilær membranen6. Vigtigere er det sted-frekvens kort giver et positioneringssystem til undersøgelse af minimal strukturel skade, såsom beskadigelse af båndet synapser af hårceller på specifikke cochlear frekvens steder i mus med perifer auditiv traume7 ,8.
I pattedyrs cochlea består bånd synapserne af et præsynaptisk bånd, en elektron-tæt projektion, der gør en Halo af Release-Ready synaptiske vesikler indeholdende glutamat i IHC, og en postsynaptisk tæthed på nerve terminalen i SGN med glutamat-receptorer9. Under cochlear Sound transduction resulterer udbøjning af hårcelle bundtet i IHC depolarisering, hvilket fører til glutamat frigivelse fra IHCs på de postsynaptiske afferent terminaler, hvorved den auditive vej aktiveres. Aktivering af denne vej fører til omdannelsen af lyd-induceret mekaniske signaler til en sats kode i SGN10. Faktisk IHC Ribbon synapse er højt specialiseret til utrættelige lyd transmission på satser på hundredvis af Hertz med høj tidsmæssig præcision, og er af afgørende betydning for præsynaptiske mekanismer lydkodning. Tidligere undersøgelser har afsløret, at bånd synapser varierer meget i størrelse og antal på forskellige frekvensområder i den voksne mus cochlea11,12, sandsynligvis afspejler strukturel tilpasning til den særlige lyd kodning for overlevelses behov. Eksperimentelle dyreforsøg har for nylig vist, at cochlear synaptopathy bidrager til flere former for hørenedsættelse, herunder høretab, der er forårsaget af støj, aldersrelateret høretab og arvelig høretab13, 14. metoderne til identificering af korrelerede ændringer i det synaptiske antal, struktur og funktion på bestemte frekvensområder er således i stigende grad blevet anvendt i studier af auditiv udvikling og indre øre-sygdom ved hjælp af modeller genereret via Eksperimentel manipulation af genetiske eller miljømæssige variabler15,16,17.
I den aktuelle rapport præsenterer vi en protokol til analyse af det synaptiske tal, strukturen og funktionen i en bestemt frekvens region i basilær-membranen i voksne mus. Lokalisering af cochlear-frekvens udføres ved hjælp af et givet sted-frekvens kort i kombination med et cochleogram. De normale morfologiske egenskaber ved cochlear-bånd synapser evalueres via præsynaptisk og postsynaptisk immun farvning. Den funktionelle status for cochlear-bånd synapser bestemmes ud fra de suprathreshold-amplituder af ABR Wave I. Med mindre ændringer kan denne protokol anvendes til at undersøge fysiologiske eller patologiske tilstande i andre dyremodeller, herunder rotter, marsvin og gerbils.
Da cochlear synaptopathy først blev karakteriseret i voksne mus med en midlertidig tærskel forskydning (TTS) induceret af 8 \ u201216 kHz oktavbånd støj ved 100 dB SPL for 2 h31, har forskerne i stigende grad undersøgt virkningerne af synaptopati i forskellige pattedyr, herunder aber og mennesker32,33. Ud over støjeksponering har flere andre forhold været forbundet med cochlear synaptopati (f. eks. aldring, brug af ototoksiske læge…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Kinas National Natural Science Foundation (81770997, 81771016, 81830030); det fælles finansieringsprojekt i Beijing Natural Science Foundation og Beijing Education Committee (KZ201810025040); Beijing Natural Science Foundation (7174291); og China postdoc Science Foundation (2016M601067).
Ketamine hydrochloride | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China | H35020148 | 100mg/kg |
Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | X-1251 | 10mg/kg |
TDT physiology apparatus | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
SigGen/BioSig software | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
Dumont forceps 3# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0203-3-PO | |
Dumont forceps 5# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0209-5-PO | |
Stereo dissection microscope | Nikon Corp., Tokyo, Japan | SMZ1270 | |
Goat serum | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9021 | |
Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 | Millipore Corp., Billerica, MA, USA | MAB397 | mouse |
Purified Mouse Anti-CtBP2 | BD Biosciences, Billerica, MA, USA | 612044 | mouse |
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21124 | goat |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21131 | goat |
Mounting medium containing DAPI | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9557 | |
Confocal fluorescent microscopy | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SP8 II | |
Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
Professional diagnostic pocket otoscope | Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China | HS-OT10 | |
Needle electrode | Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China | 1029 | 20 mm, 28 G |
Closed-field speaker | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | CF1 |