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Neuroscience

माउस Cochlea के विशिष्ट आवृत्ति क्षेत्रों में रिबन Synapses के Morphological और कार्यात्मक मूल्यांकन

doi: 10.3791/59189 Published: May 10, 2019
* These authors contributed equally

Summary

इस पांडुलिपि सामान्य चूहों में रिबन synapses के रूपात्मक विशेषताओं और कार्यात्मक स्थिति के मूल्यांकन के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. वर्तमान मॉडल शोर प्रेरित और उम्र से संबंधित cochlear synaptopathy-प्रतिबंधित मॉडल के लिए भी उपयुक्त है. पिछले माउस अध्ययन के सहसंबंधी परिणाम भी चर्चा कर रहे हैं.

Abstract

Cochlear भीतरी बाल कोशिकाओं (IHCs) ध्वनिक संकेतों को सर्पिल गुच्छिका न्यूरॉन्स के लिए संचारित (SGNs) रिबन synapses के माध्यम से. कई प्रयोगात्मक अध्ययनों से संकेत दिया है कि बाल सेल synapses sensorineural सुनवाई हानि (SNHL) में प्रारंभिक लक्ष्य हो सकता है. इस तरह के अध्ययनों से कोकलियर "सिन्पैटोपैथी" की अवधारणा का प्रस्ताव किया गया है, जो रिबन synapse संख्या, संरचना, या समारोह में परिवर्तन को संदर्भित करता है जिसके परिणामस्वरूप आईएचसी और एसजीएन के बीच असामान्य synaptic संचरण होता है। जबकि cochlear synaptopathy अपरिवर्तनीय है, यह सुनवाई सीमा को प्रभावित नहीं करता है. शोर प्रेरित प्रयोगात्मक मॉडल में, चयन आवृत्ति क्षेत्रों में IHC synapses को प्रतिबंधित क्षति पर्यावरणकारक है कि विशेष रूप से synaptopathy के कारण की पहचान करने के लिए कार्यरत है, साथ ही इस भीतरी कान परेशान करने के शारीरिक परिणाम सर्किट. यहाँ, हम वयस्क चूहों में एक विशिष्ट आवृत्ति क्षेत्र में cochlear synaptic आकृति विज्ञान और समारोह का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. इस प्रोटोकॉल में, विशिष्ट आवृत्ति क्षेत्रों के cochlear स्थानीयकरण cochleogram डेटा के साथ संयोजन के रूप में जगह आवृत्ति नक्शे का उपयोग किया जाता है, जिसके बाद रिबन synapses के रूपात्मक विशेषताओं synaptic के माध्यम से मूल्यांकन कर रहे हैं इम्यूनोस्टेनिंग. रिबन synapses के कार्यात्मक स्थिति तो श्रवण brainstem प्रतिक्रिया (एबीआर) लहर मैं के आयाम के आधार पर निर्धारित किया जाता है. वर्तमान रिपोर्ट दर्शाता है कि इस दृष्टिकोण रोगजनन और cochlea, जो उपन्यास चिकित्सकीय हस्तक्षेप के विकास में सहायता कर सकते हैं में synaptic रोग के तंत्र की हमारी समझ को गहरा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

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लगभग 20$u20120,000 हर्ट्ज की सीमा में आवृत्ति को मनुष्यों द्वारा श्रवण उत्तेजनाओं के रूप में माना जा सकता है। मानव सुनवाई सामान्य रूप से 1,000 हर्ट्ज के पास सबसे संवेदनशील है, जहां औसत ध्वनि दबाव स्तर युवा वयस्कों में 20 $Pa है (यानी, ध्वनि दबाव स्तर के 0 डेसीबल [डीबी एसपीएल]). कुछ रोगकी स्थितियों में, सुनवाई हानि विशिष्ट आवृत्तियों के लिए प्रतिबंधित है. उदाहरण के लिए, शोर प्रेरित सुनवाई हानि (NIHL) के प्रारंभिक चरणों में, एक "पायदान" (यानी, सुनवाई दहलीज ऊंचाई) audiogram में 4 kHz1पर मनाया जा सकता है. स्तनधारी कोचलर विभाजन के साथ, कठोरता और द्रव्यमान के इसके वर्गीकरण एक घातीय आवृत्ति मानचित्र का उत्पादन करते हैं, जिसमें शीर्ष2पर कोकलेया और कम आवृत्ति का पता लगाने के आधार पर उच्च आवृत्ति ध्वनि का पता लगाने के साथ। वास्तव में, वहाँ बेसिलर झिल्ली के साथ एक cochlear जगह आवृत्ति नक्शा है, जो tonotopic संगठन2,3के रूप में जाना जाता है के लिए अग्रणी. बेसिलर झिल्ली पर प्रत्येक दिए गए स्थान में केवल एक विशेष ध्वनि आवृत्ति के लिए उच्चतम संवेदनशीलता होती है, जिसे आमतौर पर विशेषता आवृत्ति3,4कहा जाता है, हालांकि अन्य आवृत्तियों की प्रतिक्रियाओं को भी देखा जा सकता है।

तारीख करने के लिए, विभिन्न माउस मॉडल श्रवण प्रणाली में सामान्य समारोह, रोग प्रक्रियाओं, और चिकित्सीय प्रभावकारिता की जांच करने के लिए नियोजित किया गया है. माउस cochlea में शारीरिक मापदंडों का सटीक ज्ञान सुनवाई हानि के ऐसे अध्ययन ों के लिए एक शर्त है. माउस cochlea शारीरिक रूप से शीर्ष में विभाजित है, मध्य, और बेसल बदल जाता है, जो विभिन्न आवृत्ति क्षेत्रों के अनुरूप. कोचला में अपने इसी परिधीय आंतरिक अंत:प्रवर्तक स्थलों का विश्लेषण करने के लिए कोकलियर नाभिक में श्रवण तंत्रिका एफ़लेंटकोस का लेबल लगाकर, मेलर एट अल. विवो5में सामान्य माउस में कोकलियर स्थान आवृत्ति मानचित्र स्थापित करने में सफल रहा। के अंतराल में 7.2-61.8 kHz, जो के बीच पदों से मेल खाती है 90% और 10% बेसिलर झिल्ली की पूरी लंबाई के, माउस cochlear जगह आवृत्ति नक्शा एक सरल रैखिक प्रतिगमन समारोह द्वारा वर्णित किया जा सकता है, के बीच एक संबंध का सुझाव कोकलियर आधार से सामान्यीकृत दूरी तथा विशिष्ट आवृत्ति5 के लघुगणक । प्रयोगशाला चूहों में, जगह आवृत्ति नक्शा विशिष्ट आवृत्ति पर्वतमाला और cochleograms के भीतर सुनवाई दहलीज के बीच संबंधों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है बेसिलर झिल्ली के साथ रिश्तेदार क्षेत्रों में लापता बाल कोशिकाओं की संख्या दिखा6. महत्वपूर्ण बात, जगह आवृत्ति नक्शा कम से कम संरचनात्मक क्षति की जांच के लिए एक स्थिति प्रणाली प्रदान करता है, इस तरह के परिधीय श्रवण आघात के साथ चूहों में विशिष्ट cochlear आवृत्ति स्थानों पर बाल कोशिकाओं के रिबन synapses को नुकसान के रूप में7 ,8.

स्तनधारी cochlea में, रिबन synapses एक presynaptic रिबन के शामिल हैं, एक इलेक्ट्रॉन घने प्रक्षेपण कि iHC के भीतर ग्लूटामेट युक्त रिलीज के लिए तैयार synaptic vesicles के एक हेलो tethers, और SGN के तंत्रिका टर्मिनल पर एक postsynaptic घनत्व ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के साथ9| कोचलर ध्वनि रूपांतरण के दौरान, बाल कोशिका बंडल के विक्षेपण का विक्षेपण आईएचसी विध्रुवण में होता है, जो आईएचसी से पोस्टिनैप्टिक अपर्णा टर्मिनलों पर ग्लूटामेट रिलीज की ओर जाता है, जिससे श्रवण पथ को सक्रिय किया जाता है। इस मार्ग के सक्रियण ध्वनि प्रेरित यांत्रिक संकेतों के रूपांतरण की ओर जाता है एसजीएन10में एक दर कोड में. दरअसल, IHC रिबन synapse उच्च अस्थायी परिशुद्धता के साथ हर्ट्ज के सैकड़ों की दरों पर indefatigable ध्वनि संचरण के लिए अत्यधिक विशिष्ट है, और ध्वनि एन्कोडिंग के presynaptic तंत्र के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि रिबन synapses वयस्क माउस cochlea11,12 में विभिन्न आवृत्ति क्षेत्रों में आकार और संख्या में काफी भिन्नता है ,12, संभावना के लिए विशेष ध्वनि कोडिंग के लिए संरचनात्मक अनुकूलन को दर्शाती है अस्तित्व की जरूरत है. हाल ही में, प्रयोगात्मक पशु अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि cochlear synaptopathy सुनवाई हानि के कई रूपों के लिए योगदान देता है, शोर प्रेरित सुनवाई हानि सहित, उम्र से संबंधित सुनवाई हानि, और वंशानुगत सुनवाई हानि13, 14.इस प्रकार, विशिष्ट आवृत्ति क्षेत्रों में synaptic संख्या, संरचना, और समारोह में सहसंबद्ध परिवर्तन की पहचान करने के लिए तरीकों को तेजी से श्रवण विकास और आंतरिक कान रोग के अध्ययन में नियोजित किया गया है, के माध्यम से उत्पन्न मॉडल का उपयोग आनुवंशिक या पर्यावरणीय चरों का प्रायोगिक हेरफेर15,16,17.

वर्तमान रिपोर्ट में, हम वयस्क चूहों में बेसिलर झिल्ली के एक विशिष्ट आवृत्ति क्षेत्र में synaptic संख्या, संरचना, और समारोह का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। Cochlear आवृत्ति स्थानीयकरण एक cochleogram के साथ संयोजन में एक दिया जगह आवृत्ति नक्शे का उपयोग किया जाता है. कोकलियर रिबन synapses के सामान्य रूपात्मक विशेषताओं presynaptic और postsynaptic इम्यूनोस्टेनिंग के माध्यम से मूल्यांकन कर रहे हैं। कोकलियर रिबन synapses के कार्यात्मक स्थिति ABR लहर मैं के suprathreshold आयाम के आधार पर निर्धारित किया जाता है. मामूली परिवर्तन के साथ, इस प्रोटोकॉल चूहों, गिनी सूअरों, और gerbils सहित अन्य पशु मॉडल में शारीरिक या रोग की स्थिति की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

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सभी प्रक्रियाएं प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए एनआरसी/आईएआर गाइड (8वीं संस्करण) के अनुसार की गई थीं। अध्ययन प्रोटोकॉल को राजधानी चिकित्सा विश्वविद्यालय, बीजिंग, चीन की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. पशु चयन

  1. सभी प्रयोगों के लिए, पशु मॉडल के रूप में वयस्क C57BL/6J पुरुष चूहों (8 सप्ताह पुराने) का उपयोग करें.
    नोट: C57BL/6J चूहों Cdh23 प्रदर्शन के एक जोड़ संस्करण ले श्रवण प्रणाली में त्वरित जीर्णता ले, cochlea के बेसल मोड़ पर रिबन synapses के 40% नुकसान और उम्र के 6 महीने के बीच बारी में एक 10% नुकसान के रूप में परिलक्षित, एक तेजी से 18,19वर्ष की आयु के साथ पूरे कोकले में इस हानि में वृद्धि . इस प्रकार, हम सावधानी की सलाह जब C57BL/6J चूहों श्रवण अनुसंधान के लिए 6 महीने से अधिक पुराने का उपयोग करते हैं. चूहों के अन्य उपभेदों विशिष्ट प्रयोगात्मक उद्देश्य के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. सुनवाई आकलन से पहले बाहरी या मध्य कान रोगों से इनकार करने के लिए एक पेशेवर नैदानिक जेब ओटोस्कोप का उपयोग कर चूहों का निरीक्षण करें। संभावित संकेत बाहरी श्रवण नहर में तरल पदार्थ या मवाद शामिल हो सकते हैं, लालिमा और स्थानीय ऊतक में सूजन, और कर्णपटह झिल्ली छिद्रण.
    नोट: हालांकि यह शायद ही कभी सामना करना पड़ा है, एक बार की पहचान की, बाहरी या मध्य कान रोगों के साथ चूहों को बाहर रखा जाना चाहिए.

2. सुनवाई आकलन

  1. केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड (100 मिलीग्राम/किलोग्राम) और जाइलज़ीन हाइड्रोक्लोराइड (10 मिलीग्राम/किलोग्राम) के मिश्रण के इंट्रापेरिटोनल इंजेक्शन का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटाइज करें। दर्दनाक उत्तेजनाओं के माध्यम से संज्ञाहरण की गहराई न्यायाधीश (उदा., टो-पिंच प्रतिवर्त)।
    नोट: जब टो-पिंच पलटा पूरी तरह से अनुपस्थित है, तो जानवर श्रवण परीक्षण के लिए संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई तक पहुंच गया है। अधिक समय द्विपक्षीय ABR रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक है, तो मूल संवेदनाहारी विमान को बहाल करने के लिए संवेदनाहारी के एक कम खुराक (एक पांचवें मूल खुराक) प्रशासन. संवेदनाहारी अधिक मात्रा से बचने के लिए ध्यान रखें, क्योंकि इससे चूहों में मौत हो सकती है।
  2. एक थर्मोनियामक हीटिंग पैड का उपयोग कर 37.5 डिग्री सेल्सियस पर एनेस्थेटाइज्ड जानवर के शरीर के तापमान को बनाए रखें। सुनवाई परीक्षण के दौरान हस्तक्षेप से बचने के लिए एक विद्युत और ध्वनिक परिरक्षित कमरे में एनेस्थेटाइज्ड जानवर रखें।
    नोट: पूरी प्रक्रिया के दौरान शारीरिक तापमान बनाए रखें जब तक जानवर पूरी तरह से जाग रहा है, ताकि संज्ञाहरण हाइपोथर्मिया के कारण मौत को रोकने के लिए।
  3. जगह subdermal सुई इलेक्ट्रोड (20 मिमी, 28 जी) खोपड़ी के शीर्ष पर (रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड), मापा कान के पिन्ना के नीचे ipsilateral कर्णमूल क्षेत्र में (संदर्भ इलेक्ट्रोड), और contralateral कर्णमूल कृष क्षेत्र में (जमीन इलेक्ट्रोड), की गहराई के साथ 3 मिमी माउस सिर की त्वचा के नीचे, क्रमशः20.
  4. एक शंकु के आकार की नोक के साथ एक 2 सेमी प्लास्टिक ट्यूब के माध्यम से ध्वनिक उत्तेजना प्रदर्शन करने के लिए एक बंद क्षेत्र वक्ता का प्रयोग करें। बाहरी कान नहर21में टिप फिट .
    नोट: सुनिश्चित करें कि रिकॉर्डिंग और संदर्भ इलेक्ट्रोड में विद्युत प्रतिबाधा 3 kOhm (आमतौर पर 1 kohm) से कम है। प्रतिबाधा उच्च है, तो इलेक्ट्रोड की प्रविष्टि साइट को बदलने, अल्कोहल के साथ इलेक्ट्रोड को साफ, या ABR लहर आयाम में परिवर्तन से बचने के लिए इलेक्ट्रोड की जगह.
  5. ABR रिकॉर्डिंग के लिए, टोन pips उत्पन्न (3 एमएस अवधि, 1 एमएस वृद्धि / गिरावट बार, 21.1/s की दर से, आवृत्ति: 4-48 kHz) और उन्हें 90 से कम पर प्रस्तुत 10 dB में 5 $u201210 डीबी SPL कदम20. इस चरण के दौरान, अनुक्रियाओं को प्रवर्धित किया जाता है (10,000 बार), फ़िल्टर्ड (0.1-3 kHz), और औसत (1,024 नमूने/
    नोट: एबीआर सीमा के पास अतिरिक्त 5 डीबी चरणों के साथ, 10 डीबी चरणों में प्रत्येक उत्तेजना स्तर के लिए एकत्र किए जाते हैं।
  6. प्रत्येक आवृत्ति पर, ABR थ्रेशोल्ड, जो न्यूनतम SPL एक या एक से अधिक भेद करने योग्य तरंगों है कि स्पष्ट रूप से दृश्य निरीक्षण द्वारा पहचाना जा सकता है के साथ एक विश्वसनीय ABR रिकॉर्डिंग में जिसके परिणामस्वरूप को संदर्भित करता है निर्धारित (चित्र1).
    नोट: यह आमतौर पर waveforms की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए सीमा के आसपास कम SPLs के लिए प्रक्रिया को दोहराने के लिए आवश्यक है. अनुक्रिया थ्रेशोल्ड निम्नतम उद्दीपक स्तर है जिस पर तरंग तरंग को देखा जा सकता है, जब 5 डब की कमी तरंग के गायब होने का कारण बनेगी।

3. Cochlear ऊतक प्रसंस्करण

  1. एबीआर रिकॉर्डिंग के बाद, गर्भाशय ग्रीवा की अव्यवस्था के माध्यम से एनेस्थेटाइज्ड चूहों को इच्छामृत्यु दें, उन्हें तबाह कर दें, अधर पक्ष से बैला को बेनकाब करें, और कोकले या तक पहुंच प्राप्त करने के लिए तेज कैंची से खुले।
  2. एक ठीक संदंश का उपयोग करना, अस्थायी हड्डियों को हटा दें, स्टेप्स धमनी को तोड़ दें, अंडाकार खिड़की से स्टेप्स को हटा दें, और गोल खिड़की झिल्ली को तोड़ दें। सुई की नोक को धीरे से घुमाकर कोचला के शीर्ष पर एक छोटा छिद्र बनाइए (13 मिमी, 27 ग्राम)।
  3. 0.1 एम फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस, पीएच 7.4) में 4% (wt/vol) पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ अलग-अलग हड्डियों को ठीक करें 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर। एक ठीक फट पाइपेट का उपयोग करना, अंडाकार या गोल खिड़कियों के लिए आवेदन के माध्यम से perilymphatic रिक्त स्थान के माध्यम से धीरे से स्थिर फ्लश (एक प्रवेश के रूप में) और शीर्ष पर खोलने (एक दुकान के रूप में).
    नोट: कुछ प्रोटीन को इम्यूनोलेबलिंग के लिए अपने प्रतीक के विनाश से बचने के लिए निर्धारण की एक छोटी अवधि की आवश्यकता होती है। ऐसे मामलों में, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए निर्माता के निर्देशों के आधार पर, 2 एच के लिए कमरे के तापमान (आरटी) में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में हड्डियों को इनक्यूबेट करें। फिक्सेशन भी कार्डियक perfusion के माध्यम से किया जा सकता है cochlear रक्त को दूर करने के लिए, बाद के चरणों में गैर विशिष्ट दाग के कारण पृष्ठभूमि शोर से बचने, विशेष रूप से cochlear क्रोपैलोपैथी के माउस मॉडल में.
  4. 0.1 M ठंड PBS के साथ 5 मिनट के लिए हड्डियों को तीन बार कुल्ला अवशिष्ट paraformaldehyde को दूर करने के लिए. हड्डियों को 10% एथिलीनडायमिनेटेरैटेएटिक एसिड (EDTA) के साथ 4 एच के लिए या 24 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 आरपीएम पर एक क्षैतिज शेकर में कोमल मिलाते हुए के माध्यम से। EDTA बीच में ताजा किया जा सकता है.
    नोट: Decalification बार EDTA और उपयोगकर्ताओं की वरीयताओं की एकाग्रता के अधीन हैं. Decalcified ऊतक क्रूरता की एक निश्चित डिग्री बनाए रखना चाहिए, जो बाद में कदम पर अलग cochlear पूरे-माउंट के हेरफेर की सुविधा. अस्थायी हड्डियों रोटेशन के साथ 10% EDTA में decalcified किया जा सकता है, शोधकर्ताओं ABR परीक्षण और निर्धारण प्रयोगों के बाद प्रयोगशाला छोड़ने के लिए अनुमति देता है. decalcification समय 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 से 30 एच की सीमा के भीतर लचीला है।
  5. EDTA से 0.1 M PBS के लिए एक decalcified अस्थायी हड्डी स्थानांतरण. #3, #5 Dumont forceps और 27 जी सुई का उपयोग करने के लिए बारी में शीर्ष, मध्यम और बेसल cochlear क्षेत्रों विच्छेदन और फिर एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत हड्डी से बाहर cochlea विच्छेदन (जैसा कि पहले वर्णित22). रेज़र ब्लेड का उपयोग करके सर्पिल स्नायु के साथ छोटे-छोटे कटों की एक श्रृंखला बनाएं, और टेक्टोरियल झिल्ली और रीसनर की झिल्ली (चित्र2) को हटा दें।
    नोट: जब तक विच्छेदन cochlea बरकरार है, इस प्रक्रिया को व्यक्तिगत ऑपरेटर के सामान्य प्रोटोकॉल के अनुसार संशोधित किया जा सकता है।
  6. इसके अलावा पूरे-माउंट तैयारियों के लिए व्यक्तिगत कोकलियर में सर्पिल लिम्बस सहित शेष श्रवण उपकला को विभाजित करें (अपेक्स, मध्य, और हुक क्षेत्र के साथ आधार)।
  7. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के एक 40x तेल उद्देश्य के तहत, एक 250 डिग्री पैमाने के साथ बेसिलर झिल्ली की लंबाई को मापने नेत्रिका में रखा है, जो IHCs के स्टीरियोसिलिया के साथ समायोजित किया जा सकता है.
  8. सभी खंड लंबाई (250 डिग्री मीटर प्रति खंड) जोड़कर प्रत्येक कोक्लियर बारी की लंबाई की गणना करें, और प्रत्येक बारी की लंबाई को संक्षेप में मिलाकर बेसिलर झिल्ली की कुल लंबाई प्राप्त करें।
  9. हुक क्षेत्र सहित बेसिलर झिल्ली की कुल लंबाई को कोकलियर शीर्ष से दूरी के आधार पर एक प्रतिशत में कनवर्ट करें (0% कोकलियर शीर्ष को संदर्भित करता है, 100% कोकलियर आधार पर)।
  10. इस दूरी को लघुगणक फलन (d(%) का उपयोग करके कोकलियर विशेषता आवृत्ति में कनवर्ट करें - 156.5 + 82.5 $ लॉग (f), आवृत्ति की 1.25 मिमी/octave की ढलान के साथ, जहां d प्रतिशत में कोचलर शीर्ष से सामान्यीकृत दूरी है, f है kHz में आवृत्ति), जैसा कि पहले वर्णित5,6. इस प्रकार प्रत्येक कोकलियर मोड़ पर बेसिलर झिल्ली के संबंधित क्षेत्र में आवृत्ति रेंज प्राप्त की जा सकती है।

4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग

  1. विच्छेदन के बाद, एक अलग 2.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्रत्येक cochlear बारी जगह और इनक्यूबेट cochlear में बदल जाता है 10% बकरी सीरम /
  2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत एक 200 डिग्री एल पिपेट टिप का उपयोग कर प्रत्येक ट्यूब से उपरोक्त ब्लॉकिंग/permeabilization समाधान निकालें और 5% बकरी सीरम में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें /
    नोट: cochlear synaptic रिबन के इम्यूनोलेबलिंग के लिए, presynaptic मार्कर माउस विरोधी carboxyl-टर्मिनल बाध्यकारी प्रोटीन 2 IgG1 (CtBP2, RIBEYE मचान प्रोटीन के बी डोमेन लेबलिंग, 1:400) और पदों का उपयोग करें एंटी-ग्लूटामेट रिसेप्टर 2 IgG2a (GluR2, AMPA रिसेप्टर की एक उपइकाई लेबलिंग, 1:200)23|
  3. अवशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए 0.1 एम ठंड पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए तीन बार कुल्ला और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ नमूनों को इनक्यूबेट 5% बकरी सीरम में पतला /
    नोट: बकरी विरोधी माउस एलेक्सा फ्लोर 568 (IgG1, 1:500) और बकरी विरोधी माउस Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500), जो प्राथमिक एंटीबॉडी चरण 4.2 में इस्तेमाल करने के लिए पूरक हैं का उपयोग कर उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें. synaptic रिबन के लिए लेबलिंग दक्षता में सुधार करने के लिए, हम विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी का चयन करने की सलाह देते हैं। कुछ प्रयोगशालाएं ऊष्मायन का विस्तार करती हैं जिनमें ग्लूआर2 इम्यूनोलेबलिंग24को बढ़ाने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी होते हैं .
  4. अवशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी को हटाने और नमूनों को 2.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों से 35 मिमी प्लेटों में स्थानांतरित करने के लिए 0.1 एम पीबीएस के साथ 0.1 एम पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए तीन बार कुल्ला।
  5. स्लाइड पर 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) युक्त बढ़ते माध्यम की एक बूंद रखें और बढ़ते माध्यम के लिए पीबीएस से नमूनों को स्थानांतरित करें। स्लाइड पर एक कवरस्लिप के एक किनारे रखें और कवरस्लिप को धीरे से गिरने देने के लिए छोड़ें।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि बाल कोशिकाओं को ऊपर की ओर चेहरा और कि कोई तह या cochlear नमूनों की घुमा प्रक्रिया के दौरान होता है, एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत cochlear नमूनों माउंट.
  6. स्लाइड बॉक्स में स्लाइड बॉक्स को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें ताकि स्लाइडको शुष्क हो सके और फिर लेजर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के नीचे छवि हो।

5. कोकलियर रिबन सिंपसेस का रूपात्मक मूल्यांकन

  1. छवि स्लाइड तीन लेज़रों के साथ एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर-एक 405 एनएम यूवी डायोड, एक 488 एनएम argon लेजर, और एक 561 एनएम डायोड पंप ठोस राज्य (डीपीएस) लेजर DAPI उत्तेजित करने के लिए (एक्सक्लूसिव स्पेक्ट्रम 409-464 एनएम), एलेक्सा फ्लोर 488 (एक्सक्लूसिव स्पेक्ट्रम 496-549 एनएम) और एलेक्स Fluor 568 (विसर्जन स्पेक्ट्रम 573-631 एनएम), क्रमशः.
  2. एक 63x उच्च संकल्प तेल विसर्जन लेंस का उपयोग कर प्रत्येक cochlear बारी से 8 डिग्री की दूरी पर confocal z-स्टैक प्राप्त करें।
    नोट: एक बार परिभाषित होने पर, फोटोमाइक्रोग्राफ को डिजिटाइज़ करने के लिए सभी पैरामीटर सहेजे जाने चाहिए और सभी स्लाइड्स पर समान रूप से लागू किए जाने चाहिए।
  3. synaptic punctum मायने रखता है के लिए, सेट z-स्टैक (0.3 $m कदम आकार) IHCs की पूरी लंबाई अवधि के लिए, जिससे यह सुनिश्चित करना है कि सभी synaptic puncta छवि की जा सकती है.
  4. z-अक्ष प्रक्षेपण प्राप्त करने के लिए एक z-स्टैक में puncta युक्त छवियों मर्ज, और छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के लिए आयात करें।
  5. प्रत्येक IHC के लिए synaptic puncta की संख्या की गणना करने के लिए IHCs (DAPI परमाणु मैनुअल मायने रखता है के बराबर) की संख्या से विशिष्ट आवृत्ति क्षेत्रों में प्रत्येक z-स्टैक में synaptic कुल मायने रखता है विभाजित करें। प्रत्येक विशिष्ट आवृत्ति क्षेत्र में, 9-11 IHCs युक्त विभिन्न सूक्ष्म क्षेत्रों के तीन छवियों में औसत सभी synaptic puncta.
    1. मुक्तहस्त चयन बटन का उपयोग करते हुए प्रत्येक आईएचसी के बासोपार्श्व क्षेत्रों सहित हितों (आरओआई) के क्षेत्र को रेखांकित करें। पाण्डे के स्वत: परिमाणीकरण के लिए माप समारोह का उपयोग करें, और वाटरशेड समारोह निकट आसन्न स्थानों के बीच अंतर करने के लिए।
    2. प्रत्येक स्वचालित गिनती के बाद, विश्वसनीय puncta गिनती सुनिश्चित करने के लिए मैनुअल सुधार के साथ दृश्य निरीक्षण प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: प्रयोगकर्ताओं को इस बात पर ध्यान नहीं देना चाहिए कि स्लाइड कोकलिया के शीर्ष, मध्य या बेसल मोड़ से है या नहीं।
  6. नेत्रहीन synaptic संरचना और वितरण का आकलन, मैन्युअल रूप से पेंसिल उपकरण द्वारा अपने पड़ोसियों से अलग IHCs को अलग करने के लिए (एम) बेहतर cytoskeletal वास्तुकला और synaptic स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए.
  7. presynaptic रिबन (CtBP2) और postsynaptic रिसेप्टर पैच (GluR2) के संयोजन का निरीक्षण करने के लिए, आयताकार मार्की उपकरण द्वारा रिबन के आसपास voxel अंतरिक्ष निकालने और फसलद्वारा अलग अलग रिबन को अलग. क्लिक करके छवि gt; छवि काआकार, इन लघु अनुमानों, जो तो युग्मित synapses की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक थंबनेल सरणी प्राप्त (CtBP2-सकारात्मक और GluR2-सकारात्मक puncta के निकट के रूप में दिखाई दिया) बनाम अनाथ रिबन (लैकिंग पोस्ट्सिनैप्टिक ग्लूटामेट रिसेप्टर पैच) (चित्र 3)।
    नोट: सामान्य cochlear synapses बाल सेल के भीतर presynaptic रिबन के संयुक्त इम्यूनोलेबलिंग के रूप में दिखाई देते हैं (विरोधी CtBP2) और श्रवण तंत्रिका टर्मिनल पर पोस्टिनैप्टिक ग्लूटामेट रिसेप्टर पैच (विरोधी GluR2)25. कुछ प्रयोगशालाएं 3डी मॉडलिंग के साथ confocal अनुमानों का उपयोग synaptic पैच आकार या मात्रा26,27मात्रा के लिए . रिबन synapses के महत्वपूर्ण नुकसान से पहले, रिबन आकार में या युग्मित ग्लूटामेट रिसेप्टर पैच के बिना परिवर्तन का प्रदर्शन synaptic रोग के संकेत कर रहे हैं27,28.

6. कोचलर रिबन Synapses के कार्यात्मक मूल्यांकन

  1. 90 डीबी के एक SPL पर प्रस्तुत प्रत्येक आवृत्ति उत्तेजना के लिए सभी ABR तरंगों को ले लीजिए superthreshold ABR लहर मैं आयाम के विश्लेषण के लिए.
    नोट: तंत्रिका-भौतिकऔर रूपात्मक अध्ययनों से पता चला है कि कम सहज दर, उच्च थ्रेसहोल्ड फाइबर विशेष रूप से उम्र बढ़ने और शोर जोखिम29,30की चपेट में हैं. हालांकि रिबन synapses के सरल नुकसान ABR दहलीज को प्रभावित नहीं कर सकते, यह आमतौर पर ABR लहर मैं आयाम में महत्वपूर्ण कटौती में परिणाम, क्योंकि कम सहज दर सहित इन afferents, उच्च थ्रेसहोल्ड फाइबर और उच्च सहज दर, निम्न थ्रेसहोल्ड रेशों से कोकलियर तंत्रिका तंतु28,29,31की संक्षिप्त क्रियाकलापों में भारी योगदान होता है . 90 डीबी एसपीएल की एक अधिक्षक तीव्रता यहाँ चयनित है।
  2. पीक-टू-पीक तरंग का निर्धारण करें I ऑफ़लाइन विश्लेषण प्रोग्राम का उपयोग करके आयाम (चित्र 4) . एबीआर परीक्षण में प्रत्येक तरंग I में प्रारंभिक धनात्मक (च) विक्षेप तथा बाद में ऋणात्मक (द) विक्षेप होते हैं। ABR लहर मैं आयाम आईपी के बीच वोल्टेज में अंतर के रूप में परिभाषित किया गया है (तरंग I के सकारात्मक शिखर) और में (तरंग I के नकारात्मक शिखर)29.
    नोट: रोग की स्थिति में, cochlear synaptopathy ABR लहर मैं, जो ध्वनि द्वारा पैदा SGNs के संक्षेप शुरुआत प्रतिक्रियाओं को प्रतिबिंबित की अधिक्ष्विक आयाम के आधार पर निर्धारित किया जा सकता है. हालांकि, COchlear संवेदनशीलता है कि OHC रोग के कारण समझौता नहीं किया है इस विधि के लिए एक शर्त है.

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Representative Results

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एबीआर सुनवाई परीक्षण संज्ञाहरण के तहत 10 C57BL/6J चूहों (8 उम्र के सप्ताह) के लिए प्रदर्शन किया गया. एबीआर को टोन फट उत्तेजनाओं का उपयोग करते हुए 4, 8, 16, 32, और 48 kHz पर प्राप्त किया गया था। प्रत्येक जानवर की सुनवाई सीमा नेत्रहीन ABR में कम से कम एक स्पष्ट तरंग भेद द्वारा पता लगाया गया था. सभी चूहों टोन फटने के जवाब में ABR दहलीज का प्रदर्शन किया, के बीच लेकर 25 और 70 डीबी SPL उत्तेजना की आवृत्ति के आधार पर. हमारे परिणामों ने संकेत दिया कि श्रवण सीमा 16 kHz पर सबसे कम थी (चित्र 1), cochlear शीर्ष से लगभग 43% दूरी के अनुरूप (चित्र 2), सुझाव है कि ध्वनिक संवेदनशीलता अन्य cochlear में काफी कम है क्षेत्रों.

एक स्टीरियो विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के तहत वयस्क चूहों में शंखीय हड्डियों से अलग किए गए कोचर पूरे-माउंट्स को अलग किया गया था (चित्र 2)। श्रवण उपकला के पूरे-माउंट को तीन टुकड़ों में विभाजित किया गया था, जिसकी लंबाई को मापा गया था और अंततः कोकलियर शीर्ष से प्रतिशत दूरी में परिवर्तित कर दिया गया था। प्रत्येक कोकलियर मोड़ की बेसिलर झिल्ली पर आवृत्ति स्थान की गणना लघुगणक फलन का उपयोग करके की गई थी, जैसा कि पहले वर्णित5,6 (चित्र 2) था।

कोकलियर रिबन synapses के रूपात्मक विशेषताओं का मूल्यांकन करने के लिए, CtBP2 और GluR2 के खिलाफ एंटीबॉडी क्रमशः presynaptic और postsynaptic संरचनाओं लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया. वयस्क चूहों के सामान्य कानों में, इम्यूनोस्टेनिंग ने सिनैप्टिक रिबन और ग्लूटामेट रिसेप्टर पैच के जोड़ों का पता लगाया जो आईएचसी की बासोपार्श्व झिल्ली की सतह को स्टड करते हैं, जिसमें आईएचसी प्रति 8-20 जोड़े होते हैं (चित्र 3)। यद्यपि पाण्डे का विशाल बहुमत सामान्य कानों में युग्मों के रूप में प्रकट हुआ था, अनाथ रिबन को उच्च आवर्धन में शायद ही कभी देखा जा सकता था (चित्र 3)। IHC रिबन synapses की गणना (दोनों CtBP2 और GluR2 के लिए प्रतिरक्षा स्पॉट) 16 kHz क्षेत्र में सबसे अधिक थे, काफी इस स्थान से दूरी में वृद्धि के रूप में कम (चित्र 3). संग्रथित गणना एंफोकल अनुमानों के आधार पर निर्धारित की जाती है जो श्रवण तंत्रिका रेशों की अधिकतम संख्या का अनुमान देती है जो कोचला से मस्तिष्क29तक सूचना संचारित करती है .

एबीआर तरंग मैं आयाम के आधार पर सभी वयस्क चूहों में कोकलियर रिबन synapses की कार्यात्मक स्थिति की जांच की गई, जो श्रवण तंत्रिका फाइबर29,31के कार्यात्मक अखंडता के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं. एबीआर तरंग I 90 डीबी के ध्वनि दाब स्तर पर प्रस्तुत उद्दीपकों की प्रत्येक आवृत्ति पर आयाम को शिखर से निम्न गर्त में मापा गया, जैसा कि चित्र 4क में दर्शाया गयाहै। ABR लहर मैं आयाम 16 kHz की एक आवृत्ति पर सबसे अधिक था, सबसे कम सुनवाई सीमा के लिए इसी, और आयाम मूल्यों काफी इस स्थान से दूरी में वृद्धि के रूप में कमी आई (चित्र 4बी). यह परिणाम रिबन synapse मायने रखता है में मनाया परिवर्तन के साथ संगत है, यह दर्शाता है कि इस cochlear क्षेत्र के भीतर synapses सबसे ज्वलंत synaptic समारोह प्रदर्शित कर सकते हैं. इसके अलावा, शोर प्रेरित और उम्र से संबंधित cochlear neurodegeneration के पिछले माउस अध्ययन में, ABR लहर के suprathreshold आयाम मैं रिबन हानि के अनुपात में कमी आई, यह दर्शाता है कि ABR लहर मैं आयाम अत्यधिक की डिग्री के साथ सहसंबद्ध है कोकलियर सिन्पैथी29,31.

Figure 1
चित्र 1 : सुनवाई आकलन. ABR सीमा टोन फट उत्तेजनाओं के विभिन्न आवृत्तियों के बीच तुलना का प्रदर्शन किया है कि सुनवाई सीमा 10 वयस्क C57BL/6J चूहों में 16 kHz पर सबसे कम था. ABR प्रतिक्रिया काफी अन्य आवृत्ति क्षेत्रों में ऊंचा किया गया था (एक तरह से Dunnett के कई तुलना के बाद हॉक परीक्षण के साथ ANOVA; *: पी एंड एलटी; 0.01, n ] 20 कान). डेटा को माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है - SEM. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : Cochlear आवृत्ति स्थानीयकरण चूहों में. (ए) पूर्ण निष्पीड़ित कोकलेया की एक प्रतिनिधि छवि, जिसे स्टीरियो विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के नीचे अस्थायी हड्डी से अलग कर दिया गया है। (बी) माउस कोकलेको को शीर्ष, मध्य और बेसल मोड़ों में विभाजित किया जाता है, जहाँ कोकलियर पार्श्व दीवार को हटा दिया जाता है। cochlear बेसिलर झिल्ली के टुकड़े पर लाल हलकों आवृत्ति स्थानों और cochlea में उनके इसी सामान्यीकृत पदों से संकेत मिलता है (0% cochlear शीर्ष करने के लिए संदर्भित करता है, 100% cochlear आधार करने के लिए). स्केल बार $ 250 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : Confocal विश्लेषण के कोक्लियर रिबन सिनैप्स चूहों में. (ए) 4, 8, 16, 32, और 48 kHz क्षेत्रों के लिए रिबन synapses के प्रतिनिधि छवियों, presynaptic रिबन के लिए प्रतिरक्षा (CtBP2, लाल) और postsynaptic संरचनाओं (GluR2, हरे). सफेद डैश्ड लाइनों संदर्भ के लिए भीतरी बाल कोशिकाओं की रूपरेखा के लिए उपयोग किया जाता है। स्केल बार ] 10 डिग्री मी. (B) confocal z-stacks से उच्च शक्ति थंबनेल से पता चलता है कि इन रिबन synapses CtBP2-सकारात्मक (लाल) और GluR2-सकारात्मक (हरा) puncta (बाएं और मध्य) के निकट संयुक्त जोड़े के रूप में दिखाई दिया, जबकि अनाथ रिबन (दाएं) पदों की कमी ग्लूटामेट रिसेप्टर पैच बहुत दुर्लभ थे. स्केल बार ] 0.5 डिग्री मी. (ग) सभी presynaptic और postsynaptic तत्वों के साथ युग्मित रिबन puncta के मात्रात्मक विश्लेषण से पता चला है कि आंतरिक बाल सेल प्रति synaptic puncta की संख्या अन्य आवृत्ति क्षेत्रों की तुलना में 16 kHz क्षेत्र में काफी अधिक था (एक तरह से ANOVA Dunnett के कई तुलना के बाद हॉक परीक्षण के साथ; *: पी एंड एलटी; 0.01, n $6 कान). डेटा को माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है - SEM. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : का विश्लेषण ABR लहर मैं आयाम चूहों में . () प्रतिनिधि ABR तरंग एक 8 सप्ताह पुराने C57BL/6J माउस से 90 डीबी की तीव्रता पर एक 16 kHz शुद्ध स्वर उत्तेजना के संपर्क में (उत्तेजना 0 एमएस पर शुरू). रोमन अंकों ABR तरंगों की चोटियों के निशान. डॉटेड रेखाएँ आयाम का संकेत देते हुए, लहर मैं चोटी और गर्त को चिह्नित करती हैं। (ख) औसत तरंग का मात्रात्मक विश्लेषण I 90 डीबी के ध्वनि दाब स्तर पर प्रस्तुत 4, 8, 16, 32 तथा 48 kHz उद्दीपकों के प्रत्युत्तर में आयाम करता है। ABR लहर मैं आयाम 16 kHz की आवृत्ति में उच्चतम थे और अन्य आवृत्तियों पर काफी कम (एक तरह से है Dunnett कई तुलना के साथ ANOVA aNOVA के बाद हॉक परीक्षण; *: पी एंड एलटी; 0.01, n ] 20 कान). डेटा को माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है - SEM. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

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चूंकि cochlear synaptopathy पहले एक अस्थायी दहलीज बदलाव के साथ वयस्क चूहों में विशेषता थी (टीटीएस) द्वारा प्रेरित 8 u201216 kHz सप्तक बैंड शोर पर 100 डीबी SPL के लिए 2 ज31, शोधकर्ताओं ने तेजी से विभिन्न में synaptopathy के प्रभाव की जांच की है स्तनधारियों, बंदरों और मनुष्यों सहित32,33. शोर जोखिम के अलावा, कई अन्य स्थितियों cochlear synaptopathy के साथ संबद्ध किया गया है (उदा., उम्र बढ़ने, ototoxic दवाओं का उपयोग, और आनुवंशिक उत्परिवर्तन), suprathreshold ऑडिशन के अल्पकालिक विघटन के लिए अग्रणी, अपरिवर्तनीय द्वारा पीछा किया श्रवण तंत्रिका का अध: पतन. कोचलेर अपमान के प्रारंभिक चरण में, synaptopathy अक्सर एक विशिष्ट आवृत्ति स्थान पर होता है, विशेष रूप से प्रयोगात्मक मॉडल में जिसमें IHC synapses को नुकसान आवृत्ति क्षेत्रों का चयन करने के लिए प्रतिबंधित है24,31. इसलिए, हमारे प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण है कि यह synaptic आकारिकी और एक विशिष्ट आवृत्ति क्षेत्र में समारोह की जांच में सक्षम बनाता है.

कोकलियर स्थान आवृत्ति मानचित्र का उपयोग सामान्य और असामान्य श्रवण फलन में भेदभाव करने के लिए किया जा सकता है, जो आंतरिक कान में सामान्य और असामान्य क्षेत्र को दर्शाती है। सतह तैयार करने की तकनीक पहले अलग cochlear बदल जाता है में बरकरार और लापता बाल कोशिकाओं साजिश के लिए इस्तेमाल किया गया था के बाद से, cochleogram बाल सेल हानि6मात्रा के लिए एक नियमित विधि बन गया है. इसलिए, प्रासंगिक शारीरिक परिवर्तन के लिए cochlea में morphological अपमान सहसंबंधित करने के लिए, यह cochleogram पर एक जगह आवृत्ति नक्शा शामिल करने के लिए उचित है. इस विधि से एक स्थापित cochlear जगह आवृत्ति नक्शे के संबंध में cochlear बेसिलर झिल्ली के साथ उनकी स्थिति के आधार पर synapses की संख्या और संरचना निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है, जिससे विस्तृत तुलना के लिए पर्याप्त जानकारी प्रदान हिस्टोलॉजिकल और शारीरिक परिणामों के बीच. हालांकि, कुछ अध्ययनों से कोकलियर नलिका के साथ कोकलियर खंड या दूरी पर आधारित सिनैपैथी का आकलन होता है, जो बेसिलर झिल्ली की लंबाई में अंतर-जाति परिवर्तनों के कारण व्यक्तिगत कोकले के बीच प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति नहीं देता है। इस प्रकार, यह विशेष रूप से एक रिश्तेदार प्रतिशत करने के लिए मिलीमीटर से व्यक्तिगत cochlear लंबाई परिवर्तित करके cochleogram मानकीकृत करने के लिए महत्वपूर्ण है.

Synaptopathy IHCs के बेसोलैदरल क्षेत्रों में CtBP2 प्रोटीन के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के दृश्य के माध्यम से पुष्टि की जा सकती है (सिनैप्टिक आइसोफॉर्म "रिबी")। ये CtBP2-सकारात्मक पैच presynaptic रिबन के परिमाणीकरण के लिए एक संरचनात्मक मार्कर के रूप में सेवा कर सकते हैं, और कम पैच की उपस्थिति आमतौर पर presynaptic नुकसान इंगित करता है. हालांकि पिछले अध्ययनों से पता चला है कि presynaptic रिबन के 98% सामान्य कान30में पोस्ट-synaptic टर्मिनलों के साथ बनती हैं, CtBP2-सकारात्मक पैच की साधारण संख्या पूर्ण synapses के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सही नहीं हो सकता है, इस के रूप में "orphans" (presynaptic रिबन postsynaptic टर्मिनलों के साथ unpaired) को शामिल करके घायल कान में synapse गिनती के overestimation के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. synapse संख्या का आकलन करने की सटीकता में सुधार करने के लिए, इस तरह के GluA2, GluA2/3, या PSD-95 के रूप में पदों के खिलाफ अतिरिक्त एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है। postsynaptic घनत्व प्रोटीन PSD-95, एक झिल्ली संबद्ध guanylate kinase (MAGUK) मचान प्रोटीन, PSD-95 के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग कर लेबल किया जा सकता है, जो ज्यादातर बाल कोशिकाओं और SGN फाइबर अंत के बीच संपर्क में मनाया जाता है34, 35. हालांकि, GluR2 के खिलाफ एंटीबॉडी पोस्टीनैप्टिक झिल्ली में AMPA-प्रकार ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के लिए अधिक विशिष्ट है, जो और अधिक मज़बूती से रिबन synapses की पहचान कर सकते हैं (presynaptic CtBP2 के इम्यूनोफ्लोरेसेंट puncta के जोड़े और पोस्टीनैप्टिक ग्लूR2)15| रूपात्मक विश्लेषण के अलावा, पूर्ण synapses के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण synaptopathy के लिए एक कार्यात्मक सूचक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. कोचलर सिनापैथी वाले वयस्क चूहों में, एबीआर तरंग मैं आयाम में कमी मध्यम से उच्च स्तरीय टोन उत्तेजनाओं की प्रस्तुति के बाद आवृत्तियों पर होती है जो synaptic हानिकेक्षेत्रों से संबंधित tonotopically 26,29. Synapse इस विधि का उपयोग कर प्राप्त मायने रखता है कि यह लगभग 10 मिनट लगते हैं बेसिलर झिल्ली पर एक साइट को स्कैन करने में सीमित हैं. इसके अलावा, IHC स्थान के आधार पर synaptic संख्या और आकृति विज्ञान में स्थानिक विविधताओं का मूल्यांकन करने के लिए, यह सही आईसीएच शरीर की सीमा की पहचान करने के लिए आवश्यक है (उदा., मायोसिन VIIa धुंधला के माध्यम से) और विशेष छवि प्रसंस्करण कदम प्रदर्शन करने के लिए26 . इस तरह के तरीकों का उपयोग करना, पिछले अध्ययनों की पुष्टि की है कि synaptic हानि शोर प्रेरित अध: पतन26के पशु मॉडल में स्तंभ पक्ष की तुलना में IHC के modiolar पक्ष पर अधिक से अधिक है.

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि कम सहज दर, उच्च थ्रेसहोल्ड फाइबर उच्च सहज दर की तुलना में शोर क्षति के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, प्रतिबंधित synaptopathy के पशु मॉडल में कम थ्रेसहोल्ड फाइबर26,30. इन अध्ययनों से सामान्य ABR दहलीज और विरूपण उत्पाद otoacoustic उत्सर्जन के साथ पशु मॉडल में synaptic समारोह का आकलन करने के लिए ABR लहर मैं (मध्यम से उच्च स्तर टोन उत्तेजनाओं का उपयोग कर मापा) के suprathreshold आयाम का उपयोग करने के लिए तर्क प्रदान करते हैं ( डीपीओएई) क्योंकि ABR की लहर मैं श्रवण तंत्रिका फाइबर के summed तंत्रिका प्रतिक्रियाओं को दर्शाता है, जब synaptopathy ABR लहर मैं आयाम के माध्यम से मूल्यांकन किया जाता है, DPOAE परीक्षण भी OHC क्षति को बाहर करने के लिए किया जाना चाहिए, जो भी ABR आयाम को कम कर सकते हैं के विघटन के कारण mechanoelectric transduction. हालांकि यौगिक कार्रवाई क्षमता की पहली लहर (कैप), जो दौर खिड़की इलेक्ट्रोड से मापा जाता है, भी cochlear तंत्रिका की संक्षिप्त गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है, इस विधि ABR माप से अधिक आक्रामक और जटिल है. यदि डीपीओएई प्रतिक्रियाएं शोर उजागर चूहों31 में अस्थायी सीमा बदलाव के बाद सामान्य करने के लिए वापस या वे अभी तक उम्र बढ़ने चूहों में खराब नहीं किया है29, ABR लहर के अधिप्राधिदय आयाम मैं दृढ़ता से cochlear synaptopathy की डिग्री की भविष्यवाणी कर सकते हैं , के बाद से प्रभावित न्यूरॉन्स चुप हैं जब IHCs के लिए उनके synaptic कनेक्शन बाधित कर रहे हैं. हालांकि, अगर cochlear संवेदनशीलता विभिन्न कारकों के कारण कम हो जाता है (जैसे, OHC रोग), ABR लहर मैं आयाम में कमी अब केवल synaptic नुकसान के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है क्योंकि वे सभी cochlear क्षति के संयोजन को प्रतिबिंबित करेगा. इसलिए, synaptopathy-प्रतिबंधित मॉडल तैयार करने के लिए नियंत्रित प्रयोगात्मक शर्तों को सुनिश्चित करने के लिए कि cochlear संवेदनशीलता अन्य कारकों द्वारा समझौता नहीं है की आवश्यकता है. दुर्भाग्य से, हालांकि ABR लहर मैं आयाम पशुओं में श्रवण तंत्रिका फाइबर हानि का एक उद्देश्य उपाय प्रदान करता है, यह मनुष्यों में मापने के लिए मुश्किल है. इसके अलावा, synaptopathy शामिल मिश्रित रोगों, बाल कोशिकाओं के नुकसान, और cochlea में अन्य असामान्यताओं की उपस्थिति सह मनुष्यों में हो सकता है, ABR लहर मैं आयाम माप के उपयोग को सीमित नैदानिक सेटिंग्स में. ABR लहर विलंबता प्रत्येक लहर के सकारात्मक शिखर करने के लिए उत्तेजना की शुरुआत से मिलीसेकंड में समय के रूप में गणना की है, श्रवण मार्ग के साथ संचरण समय में अंतर्दृष्टि प्रदान. रव-प्रेरित या आयु से संबंधित कोकलर सिनापैथी36के माउस मॉडल में लहर I विलंबता में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा गया है। हालांकि, कुछ सबूत से पता चलता है कि ABR लहर V विलंबता पर मास्किंग शोर के प्रभाव के लिए मानव में cochlear synaptopathy निदान किया जा सकताहै 37.

हाल के कई अध्ययनों ने इस धारणा का समर्थन किया है कि कोकलियर सिनापैथी छिपा सुनवाई हानि, टिनिटस, और हाइपरऐकस के साथ जुड़े प्राथमिक प्रारंभिक घटना है। हालांकि आंतरिक कान रोगों में cochlear synaptopathy की अवधारणा अब मजबूती से स्थापित किया गया है, सुनवाई की क्षमता पर इसका विस्तृत प्रभाव अज्ञात रहता है. वर्तमान अध्ययन में प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक विशिष्ट आवृत्ति क्षेत्र के भीतर cochlear रिबन synapses में आकृति विज्ञान और समारोह की जांच सक्षम बनाता है. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल cochlear synaptopathy की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इसके अंतर्निहित तंत्र, और विभिन्न प्रयोगात्मक पशु मॉडल में संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेप की प्रभावकारिता.

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Disclosures

लेखकों के हित का कोई संघर्ष नहीं है खुलासा करने के लिए.

Acknowledgments

यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81770997, 81771016, 81830030) द्वारा समर्थित किया गया था; बीजिंग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन और बीजिंग शिक्षा समिति के संयुक्त वित्त पोषण परियोजना (K$201810025040); बीजिंग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (7174291); और चीन Postdoctoral विज्ञान फाउंडेशन (2016M601067).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine hydrochloride Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China H35020148 100 mg/kg
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA X-1251 10 mg/kg
TDT physiology apparatus Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
SigGen/BioSig software Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
Electric Pad Pet Fun 11072931136
Dumont forceps 3# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0203-3-PO
Dumont forceps 5# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0209-5-PO
Stereo dissection microscope Nikon Corp., Tokyo, Japan SMZ1270
Goat serum ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9021
Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 Millipore Corp., Billerica, MA, USA MAB397 mouse 
Purified Mouse Anti-CtBP2 BD Biosciences, Billerica, MA, USA 612044 mouse 
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21124 goat
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21131 goat
Mounting medium containing DAPI ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9557
Confocal fluorescent microscopy Leica Microsystems, Wetzlar, Germany TCS SP8 II
Image Pro Plus software Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA version 6.0
Professional diagnostic pocket otoscope Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China HS-OT10
Needle electrode Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China 1029 20 mm, 28 G
Closed-field speaker Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA CF1

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References

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माउस Cochlea के विशिष्ट आवृत्ति क्षेत्रों में रिबन Synapses के Morphological और कार्यात्मक मूल्यांकन
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Yu, S. K., Du, Z. D., Song, Q. L., Qu, T. F., Qi, Y., Xiong, W., He, L., Wei, W., Gong, S. S., Liu, K. Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (147), e59189, doi:10.3791/59189 (2019).More

Yu, S. K., Du, Z. D., Song, Q. L., Qu, T. F., Qi, Y., Xiong, W., He, L., Wei, W., Gong, S. S., Liu, K. Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (147), e59189, doi:10.3791/59189 (2019).

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