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Neuroscience

Avaliação morfológica e funcional de sinapses de fita em regiões de frequência específica da cóclea do rato

doi: 10.3791/59189 Published: May 10, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Este manuscrito descreve um protocolo experimental para avaliar as características morfológicas e o estado funcional das sinapses da fita em camundongos normais. O modelo atual é igualmente apropriado para modelos synaptopathy-restringidos ruído-induzidos e idade-relacionados da coclear. Os resultados correlativos de estudos precedentes do rato são discutidos igualmente.

Abstract

As células ciliadas internas cocleares (IHCs) transmitem sinais acústicos aos neurônios de gânglio espirais (SGNs) através de sinapses de fita. Vários estudos experimentais indicaram que as sinapses das células ciliadas podem ser os alvos iniciais na perda auditiva neurossensorial (SNHL). Tais estudos têm proposto o conceito de "sinaptopatia" coclear, que se refere a alterações no número, estrutura ou função da sinapse da fita que resultam em transmissão sináptica anormal entre IHCs e SGNs. Embora a sinaptopatia coclear seja irreversível, não afeta o limiar auditivo. Em modelos experimentais induzidos por ruído, os danos restritos às sinapses de IHC em regiões de frequência selecionam-se são empregados para identificar os fatores ambientais que causam especificamente o synaptopathy, assim como as conseqüências fisiológicas de perturbar esta orelha interna Circuito. Aqui, apresentamos um protocolo para análise da morfologia sináptica coclear e função em uma região de frequência específica em camundongos adultos. Neste protocolo, a localização coclear de regiões de frequência específica é realizada utilizando-se mapas de frequência de lugar em conjunto com dados de cochleograma, seguindo os quais as características morfológicas das sinapses da fita são avaliadas via sináptica immunostaining. O estado funcional das sinapses da fita é então determinado com base nas amplitudes da onda de resposta auditiva do tronco encefálico (ABR) I. O presente relato demonstra que essa abordagem pode ser utilizada para aprofundar nossa compreensão da patogênese e dos mecanismos de disfunção sináptica na cóclea, o que pode auxiliar no desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas.

Introduction

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As freqüências na escala de aproximadamente 20 \ u201220, 000 hertz podem ser percebidas como estímulos auditivos por seres humanos. A audição humana é normalmente mais sensível perto de 1.000 Hz, onde o nível médio de pressão sonora é de 20 μPa em adultos jovens (ou seja, 0 decibéis de nível de pressão sonora [dB SPL]). Em algumas condições patológicas, a perda auditiva é restrita a frequências específicas. Por exemplo, nos estágios iniciais da perda auditiva induzida por ruído (pair), um "entalhe" (i.e., elevação do limiar auditivo) pode ser observado no audiograma a 4 kHz1. Ao longo da partição coclear de mamíferos, suas gradações de rigidez e massa produzem um mapa de frequência exponencial, com detecção de som de alta frequência na base da cóclea e detecção de baixa frequência no ápice2. De fato, há um mapa de localização-frequência coclear ao longo da membrana basilar, levando ao que é conhecido como organização tonotópica2,3. Cada lugar dado na membrana basilar tem a sensibilidade a mais elevada a somente uma freqüência sadia particular, que seja denominada geralmente a freqüência característica3,4, embora as respostas a outras freqüências possam igualmente ser observadas.

Até o momento, vários modelos de mouse têm sido empregados para investigar a função normal, processos patológicos e eficácia terapêutica no sistema auditivo. O conhecimento preciso dos parâmetros fisiológicos na cóclea do camundongo é um pré-requisito para esses estudos de perda auditiva. A cóclea do camundongo é dividida anatomicamente em curvas apical, média e basal, que correspondem a diferentes regiões de frequência. Ao rotular os aferentes do nervo auditivo no núcleo coclear para analisar seus locais de inervação periférica correspondentes na cóclea, Müller et al. conseguiram estabelecer o mapa de localização-frequência coclear no rato normal in vivo5. No intervalo de 7,2 – 10, 5kHz, o que corresponde a posições entre 90% e a dez% do comprimento total da membrana basilar, o mapa de localização-frequência da cóclea do rato pode ser descrito por uma função de regressão linear simples, sugerindo uma relação entre o distância normalizada da base coclear e o logaritmo da frequência característica5. Em camundongos de laboratório, o mapa de frequência local pode ser usado para explorar a relação entre limiares auditivos dentro de faixas de frequência específicas e cocleogramas mostrando o número de células ciliadas ausentes em regiões relativas ao longo da membrana basilar6. É importante ressaltar que o mapa de frequência local fornece um sistema de posicionamento para a investigação de danos estruturais mínimos, como danos às sinapses de fita de células ciliadas em locais específicos de frequência coclear em camundongos com trauma auditivo periférico7 ,8.

Na cóclea de mamíferos, as sinapses da fita são compostas de uma fita pré-sináptica, uma projeção elétron-densa que amarras um halo de vesículas sinápticas prontas para liberação contendo glutamato dentro do IHC, e uma densidade pós-sináptica no terminal nervoso do Sgn com receptores de glutamato9. Durante a transdução do som coclear, a deflexão do feixe de células ciliadas resulta em despolarização do IHC, o que leva à liberação de glutamato de IHCs para os terminais aferentes pós-sinápticos, ativando assim a via auditiva. A ativação deste caminho conduz à transformação de sinais mecânicos som-induzidos em um código da taxa no SGN10. Na verdade, a sinapse de fita IHC é altamente especializada para transmissão de som incansável em taxas de centenas de hertz com alta precisão temporal, e é de importância crítica para mecanismos pré-sinápticos de codificação de som. Os estudos precedentes revelaram que as sinapses da fita variam extremamente no tamanho e no número em regiões diferentes da freqüência no rato adulto cóclea11,12, refletindo provavelmente a adaptação estrutural à codificação sadia particular para necessidades de sobrevivência. Recentemente, estudos experimentais em animais demonstraram que a sinaptopatia coclear contribui para múltiplas formas de deficiências auditivas, incluindo perda auditiva induzida por ruído, perda auditiva relacionada à idade e perda auditiva hereditária13, 14. assim, métodos para identificação de alterações correlatas no número, estrutura e função sináptica em regiões de frequência específica têm sido cada vez mais empregados em estudos de desenvolvimento auditivo e doença da orelha interna, utilizando modelos gerados via manipulação experimental de variáveis genéticas ou ambientais15,16,17.

No presente relato, apresentamos um protocolo para analisar o número, a estrutura e a função sináptica em uma região de frequência específica da membrana basilar em camundongos adultos. A localização da frequência coclear é realizada utilizando-se um determinado mapa de frequência local em combinação com um cócleograma. As características morfológicas normais das sinapses da fita coclear são avaliadas via imunomarcação pré-sináptica e pós-synaptica. O estado funcional das sinapses da fita coclear é determinado com base nas amplitudes do estímulo da onda I de abr. Com pequenas alterações, este protocolo pode ser usado para examinar as condições fisiológicas ou patológicas em outros modelos animais, incluindo ratos, cobaias e gerbils.

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Protocol

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Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o guia NRC/ILAR para o cuidado e uso de animais de laboratório (8ª edição). O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de medicina de capital, Pequim, China.

1. seleção animal

  1. Para todos os experimentos, use camundongos adultos C57BL/6J machos (8 semanas de idade) como modelo animal.
    Nota: Camundongos C57BL/6J portadores de uma variante de Splice da exposição Cdh23 aceleraram a senescência no sistema auditivo, refletido como uma perda de 40% das sinapses da fita na curva basal da cóclea e uma perda de 10% no turno médio por 6 meses de idade, seguida por uma rápida aumento desta perda em toda a cóclea com18,19anos. Assim, aconselhamos cautela ao usar camundongos C57BL/6J com mais de 6 meses para pesquisa auditiva. Outras cepas de camundongos podem ser usadas dependendo dos objetivos experimentais específicos.
  2. Inspecione os ratos usando um otoscópio diagnóstico profissional do bolso para governar para fora patologias exteriores ou da orelha média antes das avaliações da audição. Os sinais potenciais podem incluir fluido ou pus no conduto auditivo externo, vermelhidão e inchaço no tecido local e perfuração da membrana timpânica.
    Nota: Embora isso raramente seja encontrado, uma vez identificado, camundongos com doenças da orelha externa ou média devem ser excluídos.

2. avaliação auditiva

  1. Anestesie os camundongos usando uma injeção intraperitoneal de uma mistura de cloridrato de cetamina (100 mg/kg) e cloridrato de xilazina (10 mg/kg). Julgar a profundidade da anestesia através de estímulos dolorosos (por exemplo, reflexo do dedo do pé-pitada).
    Nota: Quando o reflexo do dedo do pé-pitada é completamente ausente, o animal alcançou uma profundidade adequada da anestesia para o teste auditivo. Se for necessário mais tempo para gravações bilaterais de ABR, administrar uma dosagem mais baixa (um quinto da dosagem original) de anestésicos para restaurar o plano anestésico original. Tome cuidado para evitar a overdose de anestésico, pois isso pode levar à morte em camundongos.
  2. Mantenha a temperatura do corpo do animal anestesiado a 37,5 ° c usando uma almofada de aquecimento termorregulante. Coloc o animal anestesiado em uma sala eletricamente e acusticamente protegida para evitar a interferência durante todo o teste da audição.
    Nota: Manter a temperatura fisiológica durante todo o procedimento até que o animal esteja totalmente acordado, a fim de prevenir a morte causada pela hipotermia pós-anestésica.
  3. Coloque os eletrodos da agulha subdérmica (20 mm, 28 G) no vértice do crânio (eletrodo de gravação), na região da parotídea ipsilateral abaixo da Pinna da orelha medida (eletrodo de referência), e na região parotídea contralateral (eletrodo de aterramento), com profundidade de 3 mm a pele da cabeça do rato, respectivamente20.
  4. Use um alto-falante de campo fechado para realizar a estimulação acústica através de um tubo de plástico de 2 cm com uma ponta em forma de cone. Encaixe a ponta no canal auditivo externo21.
    Nota: Assegure-se de que a impedância elétrica nos elétrodos da gravação e da referência seja menos de 3 kOhm (geralmente 1 kOhm). Se a impedância for alta, mude o local de inserção do eletrodo, limpe o eletrodo com álcool ou substitua o eletrodo para evitar alterações na amplitude da onda do PEATE.
  5. Para a gravação ABR, gere pips de Tom (3 ms de duração, 1 ms de subida/queda vezes, a uma taxa de 21,1/s, freqüência: 4 – 48 kHz) e apresentá-los em SPLs diminuindo de 90 a 10 dB em 5 \ u201210 dB SPL passos20. Durante esta etapa, as respostas são amplificadas (10.000 vezes), filtradas (0,1 – 3 kHz) e médias (1.024 amostras/nível de estímulo).
    Nota: As ABRs são coletadas para cada nível de estímulo em etapas de 10 dB, com etapas adicionais de 5 dB próximas ao limiar.
  6. Em cada frequência, determine o limiar do PEATE, que se refere ao SPL mínimo, resultando em uma gravação de ABR confiável com uma ou mais ondas distinguíveis que podem ser claramente identificadas pela inspeção visual (Figura 1).
    Nota: Geralmente é necessário repetir o processo para baixo SPLs em torno do limiar para garantir a consistência das formas de onda. O limiar de resposta é o menor nível de estímulo no qual a forma de onda pode ser observada, quando uma diminuição de 5 dB levaria ao desaparecimento da forma de onda.

3. processamento de tecido coclear

  1. Após a gravação do PEATE, eutanizar os camundongos anestesiados via luxação cervical, decapitá-los, expor a bolha do lado ventral, e abrir com tesoura afiada para obter acesso à cóclea.
  2. Usando uma pinça fina, retire os ossos temporais, separe a artéria do estribo, retire o estribo da janela oval e rompa a membrana da janela redonda. Faça um pequeno furo no ápice da cóclea girando suavemente a ponta de uma agulha (13 mm, 27 G).
  3. Fixar os ossos isolados com paraformaldeído a 4% (WT/vol) em soro fisiológico tamponado com fosfato de 0,1 M (PBS, pH 7,4) durante a noite a 4 ° c. Utilizando uma pipeta de ponta fina, lave suavemente fixador através dos espaços perilinfática através da aplicação às janelas ovais ou redondas (como uma entrada) e a abertura no vértice (como uma tomada).
    Nota: Algumas proteínas exigem uma duração curta da fixação para evitar a destruição de seus resumos para Immunolabeling. Nesses casos, incubar ossos em paraformaldeído a 4% à temperatura ambiente (RT) por 2 h, dependendo das instruções do fabricante para a imunohistoquímica. A fixação também pode ser realizada através de perfusão cardíaca para remover o sangue coclear, evitando ruídos de fundo devido à coloração não específica em estágios posteriores, particularmente em modelos de camundongo de sinaptopatia coclear.
  4. Enxágüe os ossos três vezes por 5 min com 0,1 M de PBS frio para remover paraformaldeído residual. Descalcificar os ossos com ácido etilenodiaminotraacético a 10% (EDTA) ou em RT por 4 h ou a 4 ° c por 24 h através de agitação suave em um agitador horizontal a 20 rpm. O EDTA pode ser refrescado a meio caminho.
    Nota: Os tempos de descalcificação estão sujeitos à concentração de EDTA e às preferências dos usuários. O tecido descalcificado deve manter um certo grau de dureza, o que facilita a manipulação de isolando o todo-montagens cocleares em etapas posteriores. Os ossos temporais podem ser descalcificados em EDTA a 10% com rotação, permitindo que os pesquisadores saiam do laboratório após testes de PEATE e experimentos de fixação. O tempo de descalcificação é flexível dentro do intervalo de 20 a 30 h a 4 ° c.
  5. Transfira um osso temporal descalcificado de EDTA para 0,1 M de PBS. Use #3, #5 fórceps de Dumont e a agulha de 27 G para dissecar as regiões cocleares apicais, médias e basais por sua vez e então dissecar a cóclea fora do osso um microscópio estereofónico da dissecção (como descrito previamente22). Faça uma série de pequenos cortes ao longo do ligamento espiral usando uma lâmina de barbear, e retire a membrana tectorial e a membrana de Reissner (Figura 2).
    Nota: Contanto que a cóclea dissecada esteja intacta, este processo pode ser modificado de acordo com o protocolo usual do operador individual.
  6. Dissecar ainda mais o epitélio auditivo remanescente, incluindo o limbus espiral em curvas cocleares individuais (ápice, meio e base com região de gancho) para preparações de montagem inteira.
  7. um objetivo do óleo 40x de um microscópio claro, meça o comprimento da membrana basilar com uma escala de 250 μm coloc na ocular, que pode ser ajustada ao longo do estereocílios dos ihcs.
  8. Calcule o comprimento de cada turno coclear adicionando todos os comprimentos de segmento (250 μm por segmento) e, concomitantemente, obtenha o comprimento total da membrana basilar, somando os comprimentos de cada turno.
  9. Converter o comprimento total da membrana basilar incluindo a região do gancho em uma porcentagem com base na distância do ápice coclear (0% refere-se ao ápice coclear, 100% à base coclear).
  10. Converta esta distância na frequência característica coclear utilizando uma função logarítmica (d (%) = 1-156,5 + 82,5 × log (f), com uma inclinação de 1,25 mm/oitava de frequência, onde d é a distância normalizada do ápice coclear em percentagem, f é a frequência em kHz), conforme descrito anteriormente5,6. Assim a escala de freqüência em uma área correspondente da membrana basilar em cada volta coclear pode ser adquirida.

4. coloração da imunofluorescência

  1. Após a dissecção, coloque cada curva coclear em um tubo de centrífuga separado de 2,5 mL e incubar curvas cocleares em 10% de soro de cabra/PBS/0,1% Triton X-100 por 1 h em RT em um rotador.
  2. Retire a solução de bloqueio/permeabilização acima de cada tubo usando uma ponta de pipeta de 200 μL um microscópio de dissecção e incubar os espécimes com anticorpos primários diluídos em 5% soro de cabra/PBS/0,1% Triton X-100 durante a noite a 4 ° c em um rotator.
    Nota: Para Immunolabeling de fitas sinápticas cocleares, use a proteína de ligação 2 IgG1 do rato do marcador pré-sinaptic do anti-carboxyl-terminal (CtBP2, etiquetando o domínio de B da proteína do andaime de ribeye, 1:400) e o receptor pós-sináptica do anti-glutamate do rato do marcador 2 IgG2a (GluR2, rotulando uma subunidade do receptor AMPA, 1:200)23.
  3. Enxague três vezes por 5 min com PBS a 0,1 M de frio para remover os anticorpos primários residuais e incubar os espécimes com anticorpos secundários diluídos em 5% de soro de cabra/PBS/0,1% Triton X-100 em RT para 2 \ u20123 h na escuridão em um rotador.
    Nota: Prepare misturas secundárias apropriadas do anticorpo usando a cabra anti-rato Alexa fluor 568 (IgG1, 1:500) e o anti-rato da cabra Alexa fluor 488 (IgG2a, 1:500), que são complementares aos anticorpos preliminares usados na etapa 4,2. Para melhorar a eficiência de rotulagem para fitas sinápticas, recomendamos a seleção de anticorpos secundários específicos. Alguns laboratórios estendem a incubação com anticorpos secundários para aumentar o Immunolabeling GluR224.
  4. Enxague três vezes por 5 min com 0,1 M de PBS para remover anticorpos secundários residuais e transfira os espécimes de tubos de centrifugação de 2,5 mL para placas de 35 mm contendo 0,1 M de PBS.
  5. Coloc uma gota do meio de montagem que contem 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) na corrediça e transfira os espécimes de PBS ao meio de montagem. Coloque uma borda de uma lamínula no slide e solte para deixar a lamínula cair suavemente.
    Nota: Para garantir que as células ciliadas estejam viradas para cima e que nenhuma dobra ou torção de espécimes cocleares ocorra durante o procedimento, monte espécimes cocleares um microscópio de dissecção estéreo.
  6. Coloque os slides em uma caixa de slides a 4 ° c durante a noite para deixar slides secos e, em seguida, imagem um microscópio confocal laser.

5. avaliação morfológica das sinapses da fita coclear

  1. Slides de imagem usando um microscópio confocal com três lasers — um diodo UV de 405 nm, um laser de argônio de 488 nm, e um laser de estado sólido (DPSS) de 561 nm diodo-bombeado para excitar DAPI (espectro de excitação 409 – 464 nm), Alexa fluor 488 (espectro de excitação 496 – 549 nm) e Alexa fluor 568 (Espectro de excitação 573 – 631 nm), respetivamente.
  2. Adquira pilhas z confocais a uma distância de 8 μm de cada curva coclear usando uma lente de imersão de óleo de alta resolução de 63x.
    Nota: Uma vez definidos, todos os parâmetros para digitalizar fotomicrografias devem ser salvos e aplicados uniformemente a todos os slides.
  3. Para contagens do punctum sináptica, ajuste as z-pilhas (tamanho da etapa de 0,3 μm) para estender o comprimento inteiro dos ihcs, assegurando desse modo que todo o puncta sináptica possa ser imaged.
  4. Mesclar as imagens contendo puncta em uma pilha z para obter a projeção do eixo z e importar para o software de processamento de imagem.
  5. Divida contagens totais sinápticas em cada z-Stack em regiões de frequência específicas pelo número de IHCs (igual às contagens manuais nucleares de DAPI) para calcular o número de puncta sináptica para cada IHC. Em cada região de frequência específica, a média de todas as puncta sináptica em três imagens de diferentes campos microscópicos contendo 9 – 11 IHCs.
    1. Delinear a região de interesses (ROIs) incluindo as regiões basolateral de cada IHC usando o botão de seleções à mão livre. Use a função Measure para quantificação automática de puncta, e a função de divisor de águas para distinguir entre pontos adjacentes próximos.
    2. Após cada contagem automatizada, realize inspeções visuais com correções manuais para garantir que a contagem de puncta seja confiável.
      Nota: Os experimentadores devem permanecer cegos para saber se o slide é do ápice, do meio ou da curva basal da cóclea.
  6. Avalie visualmente a estrutura e a distribuição sináptica, para isolar manualmente ihcs individuais de seus vizinhos pela ferramenta do lápis ( M) para visualizar melhor a arquitetura citoesquelética e a localização sináptica.
  7. Para inspecionar a justaposição de fitas pré-sinápticas (CtBP2) e pós-sináptica receptor patches (GluR2), extraia o espaço VOXEL ao redor da fita pela ferramenta Letreiro Retangular e isolar fita individual por cultura. Através de clicar em imagem ≫ tamanho da imagem, adquira uma matriz miniatura dessas projeções em miniatura, que podem ser usadas para identificar sinapses pareadas (apareceram como pares justapostos de Puncta CtBP2-positive e GluR2-positive) versus órfãs fitas (com falta de manchas pós-sinápticas do receptor de glutamato) (Figura 3).
    Nota: As sinapses cocleares normais aparecem como Immunolabeling combinado da fita pré-sináptica dentro da pilha de cabelo (CtBP2) e do remendo pós-sináptica do receptor do glutamato no terminal do nervo auditivo (anti-GluR2)25. Alguns laboratórios usam projeções confocais em conjunto com modelagem 3D para quantificar o tamanho do patch sináptico ou volume26,27. Antes da perda significativa de sinapses da fita, as fitas que exibem mudanças no tamanho ou sem remendos do receptor do glutamato emparelhado são prováveis indicativas da deficiência orgânica sináptica27,28.

6. avaliação funcional de sinapses da fita coclear

  1. Colete todas as ondas do PEATE para cada estímulo de frequência apresentado em um SPL de 90 dB para a análise das amplitudes da onda I do estímulo abr.
    Nota: Estudos neurofisiológicos e morfológicos demonstraram que as fibras de baixa taxa espontânea, de alto limiar, são especialmente vulneráveis ao envelhecimento e à exposição ao ruído29,30. Embora a simples perda de sinapses da fita não possa afetar os limiares do PEATE, geralmente resulta em reduções significativas nas amplitudes da onda I do PEATE, pois esses aferentes, incluindo baixa taxa espontânea, fibras de alto limiar e alta taxa espontânea, as fibras de baixo limiar contribuem fortemente para as atividades somadas das fibras nervosas cocleares28,29,31. Uma intensidade de estímulo de 90 dB SPL é selecionada aqui.
  2. Determine a amplitude da onda I de pico a pico usando um programa de análise offline (Figura 4). Cada onda I no teste ABR consiste em uma deflexão positiva inicial (p) e a deflexão negativa (n) subsequente. A amplitude da onda I do PEATE é definida como a diferença de voltagem entre IP (o pico positivo da onda I) e in (o pico negativo da onda I)29.
    Nota: Em condições patológicas, a sinaptopatia coclear pode ser determinada com base nas amplitudes do estímulo da onda I do PEATE, que refletem as respostas somadas do início dos sgns evocados pelo som. No entanto, a sensibilidade coclear que não está comprometida devido à disfunção da OHC é um pré-requisito para esse método.

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Representative Results

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Os testes auditivos de ABR foram realizados para camundongos 10 C57BL/6J (8 semanas de idade) anestesia. Os ABRs foram eliciados usando estímulos de burst de Tom em 4, 8, 16, 32 e 48 kHz. O limiar auditivo de cada animal foi detectado visualmente por distinguir pelo menos uma forma de onda clara no PEATE. Todos os camundongos exibiram limiares de PEATE em resposta a rajadas de Tom, variando entre 25 e 70 dB NPS dependendo da frequência do estímulo. Nossos resultados indicaram que o limiar auditivo foi menor em 16 kHz (Figura 1), correspondendo a aproximadamente 43% de distância do ápice coclear (Figura 2), sugerindo que a sensibilidade acústica é significativamente reduzida em outras Regiões.

As montagens cocleares inteiras foram isoladas de ossos temporais em camundongos adultos microscópio de dissecção estéreo (Figura 2a). Os montes inteiros do epitélio auditivo foram dissecados em três partes, os comprimentos de que foram medidos e convertidos eventualmente na distância do percentual do vértice coclear. O local de frequência na membrana basilar de cada turno coclear foi calculado por meio de função logarítmica, conforme descrito anteriormente5,6 (Figura 2B).

Para avaliar as características morfológicas das sinapses da fita coclear, anticorpos contra CtBP2 e GluR2 foram utilizados para rotular estruturas pré-sinápticas e postsynapticas, respectivamente. Em orelhas normais de camundongos adultos, A imunocoloração revelou pares justapostos de fitas sinápticas e de remendos do receptor do glutamato que studding a superfície da membrana basolateral de IHCs, com 8 – 20 pares por IHC (Figura 3A). Embora a grande maioria de puncta aparecesse como pares justapostos em orelhas normais, as fitas órfãs podiam ser observadas raramente na ampliação elevada (Figura 3B). Contagens de sinapses de fita IHC (pontos imunopositivos para ambos CtBP2 e GluR2) foram mais elevadas na região de 16 kHz, diminuindo significativamente à medida que a distância desse local aumentou (Figura 3C). As contagens sinápticas determinadas com base em projeções confocais fornecem uma estimativa do número máximo de fibras nervosas auditivas que transmitem informações da cóclea ao cérebro29.

O estado funcional das sinapses da fita coclear foi investigado em todos os camundongos adultos com base nas amplitudes da onda I do PEATE, que fornecem informações sobre a integridade funcional das fibras nervosas auditivas29,31. As amplitudes da onda I do PEATE em cada frequência do estímulo apresentado a um nível de pressão sonora de 90 dB foram mensuradas de pico para a seguinte calha, como mostra a Figura 4a. A amplitude da onda I do PEATE foi maior em uma frequência de 16 kHz, correspondendo ao menor limiar auditivo, e os valores de amplitude diminuíram significativamente à medida que a distância desse local aumentou (Figura 4B). Esse resultado é consistente com as alterações observadas nas contagens de sinapse da fita, indicando que as sinapses dentro desta região coclear podem apresentar a função sináptica mais vívida. Além disso, em estudos prévios de rato de neurodegeneração coclear induzida por ruído e idade, amplitudes de estímulo da onda de abr i diminuíram proporcionalmente à perda de fita, indicando que a amplitude da onda i do PEATE está altamente correlacionada com o grau de sinaptopatia coclear29,31.

Figure 1
Figura 1 : Avaliação auditiva. As comparações do limiar de PEATE entre as diferentes frequências de estímulos Tone Burst demonstraram que o limiar auditivo foi menor em 16 kHz em 10 camundongos adultos C57BL/6J. A resposta do PEATE foi significativamente elevada em outras regiões de frequência (ANOVA One-Way com o teste post hoc de comparação múltipla de Dunnett; *: P < 0, 1, n = 20 orelhas). Os dados são expressos em média ± SEM. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Localização de frequência coclear em ratos. (A) uma imagem representativa da cóclea explantados completa, que foi dissecada fora do osso temporal um microscópio estereofónico da dissecção. (B) a cóclea do camundongo é dividida em curvas apical, média e basal, onde a parede lateral coclear é removida. Os círculos vermelhos nos fragmentos da membrana basilar coclear indicam os locais de frequência e suas correspondentes posições normalizadas na cóclea (0% refere-se ao ápice coclear, 100% à base coclear). Barra de escala = 250 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Análise confocal dos sinapses da fita coclear em ratos. (A) imagens representativas de sinapses de fita para as regiões 4, 8, 16, 32 e 48 kHz, imunomanchadas para fitas pré-sinápticas (CtBP2, vermelho) e estruturas pós-sináptica (GluR2, verde). As linhas tracejadas brancas são usadas para esboçar pilhas de cabelo internas para a referência. Barra de escala = 10 μm. (B) miniaturas de alta potência de confocal z-Stacks mostram que essas sinapses de fita apareceram como pares justapostos de CtBP2-positivo (vermelho) e GluR2-positivo (verde) puncta (esquerda e meio), enquanto fitas órfãs (direita) faltando pós-sináptica os remendos do receptor do glutamato eram muito raros. Barra de escala = 0,5 μm. (C) a análise quantitativa do puncta emparelhado da fita com todos os elementos pré-sináptica e pós-sináptica revelou que o número de puncta sináptica por a pilha de cabelo interna era significativamente mais elevado na região de 16 quilohertz do que em outras regiões da freqüência (ANOVA One-Way com o teste post hoc de comparação múltipla de Dunnett; *: P < 0, 1, n = 6 orelhas). Os dados são expressos em média ± SEM. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Análise de Onda de abr I amplitudes em camundongos . (A) forma de onda representativa do abr de um rato C57Bl/6J velho de 8 semanas exposto a um estímulo de Tom puro de 16 kHz em uma intensidade de 90 dB (início do estímulo em 0 ms). Os numerais romanos marcam os picos das ondas do ABR. As linhas pontilhadas marcam a onda I pico e calha, indicando a amplitude. (B) análise quantitativa das amplitudes médias das ondas I em resposta aos estímulos 4, 8, 16, 32 e 48 kHz apresentados a um nível de pressão sonora de 90 dB. As amplitudes da onda I do PEATE foram as mais elevadas na freqüência de 16 quilohertz e significativamente mais baixas em outras freqüências (ANOVA One-Way com teste múltiplo da comparação post hoc de Dunnett; *: P < 0, 1, n = 20 orelhas). Os dados são expressos em média ± SEM. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Desde que o synaptopathy coclear foi caracterizado primeiramente em ratos adultos com um deslocamento provisório do ponto inicial (TTS) induzido pelo ruído da faixa de oitava de 8 \ u201216 kHz em 100 dB SPL para 2 h31, os investigadores investigaram cada vez mais os efeitos do synaptopathy em vários mamíferos, incluindo macacos e seres humanos32,33. Além da exposição ao ruído, várias outras condições têm sido associadas à sinaptopatia coclear (por exemplo, envelhecimento, uso de drogas ototóxicas e mutações genéticas), levando à interrupção de curto prazo da audição de estímulo, seguida de degeneração do nervo auditivo. Na fase inicial do insulto coclear, a sinaptopatia geralmente ocorre em um local de frequência específico, especialmente em modelos experimentais nos quais o dano às sinapses do IHC é restrito a selecionar regiões de frequência24,31. Portanto, nosso protocolo é significativo, pois possibilita a investigação da morfologia e da função sináptica em uma região de frequência específica.

O mapa da localização-freqüência coclear pode ser usado para discriminar a função auditiva normal e anormal, refletindo ainda mais a área normal e anormal na orelha interna. Desde que as técnicas de preparação de superfície foram usadas primeiramente para traçar pilhas de cabelo intactas e faltantes nas voltas cocleares diferentes, o cocleograma transformou-se um método rotineiro para quantificar a perda da pilha de cabelo6. Conseqüentemente, para correlacionar insultos morfológicos na cóclea às mudanças physiological relevantes, é razoável incluir um mapa do lugar-freqüência no cochleogram. Este método permite determinar o número e a estrutura das sinapses com base em suas posições ao longo da membrana basilar coclear em relação aos mapas de localização-frequência cocleares estabelecidos, fornecendo informações suficientes para comparações detalhadas entre os desfechos histológicos e fisiológicos. Entretanto, alguns estudos avaliam a sinaptopatia com base no segmento coclear ou na distância ao longo do ducto coclear, o que não permite comparações diretas entre as cócleas individuais devido a variações intraespécies no comprimento da membrana basilar. Assim, é particularmente importante padronizar o cocleograma através da conversão de comprimentos cócleos individuais de milímetros a um percentual relativo.

Synaptopathy pode ser confirmado através do visualização da imunomarcação para a proteína de CtBP2 (o "Ribeye" do isoforma sináptica) nas regiões basolateral de ihcs. Estes remendos CtBP2-positive podem serir como um marcador estrutural para a quantificação de fitas pré-sináptica, e a presença de menos remendos indica geralmente a perda pré-sináptica. Embora estudos prévios tenham relatado que 98% das fitas pré-sinápticas são emparelhadas com terminais pós-Synaptic na orelha normal30, o número simples de remendos CtBP2-positive não pode ser exato para a análise quantitativa de sinapses completas, como este pode levar a superestimação das contagens de sinapse na orelha ferida por envolver "órfãos" (fitas pré-sinápticas desemparelhadas com terminais pós-Synaptic). Para melhorar a exatidão de estimar o número do sinapse, os anticorpos adicionais de encontro à estrutura pós-sináptica tais como GluA2, GluA2/3, ou PSD-95 são usados. A proteína de densidade pós-sináptica PSD-95, uma proteína de andaime de guanilato quinase (maguk) associada à membrana, pode ser rotulada usando um anticorpo contra PSD-95, que é observada principalmente nos contatos entre células ciliadas e terminações de fibra sgn34, 35. Entretanto, o anticorpo de encontro a GluR2 é mais específico para os receptores ionotrópicos do glutamato do GABA-tipo na membrana pós-sináptica, que pode mais confiantemente identificar sinapses da fita (pares justapostos de puncta Immunofluorescent de CtBP2 e pós-sináptica GluR2)15. Além da análise morfológica, a análise histológica das sinapses completas pode ser usada como um indicador funcional para a sinaptopatia. Em camundongos adultos com sinaptopatia coclear, reduções na amplitude da onda I do PEATE após a apresentação de estímulos de Tom de nível moderado a alto ocorrem em frequências tonotopicamente relacionadas a regiões de perda sináptica26,29. As contagens do Synapse obtidas usando este método são limitadas que toma aproximadamente 10 minutos para escanear um local na membrana basilar. Além disso, para avaliar as variações espaciais no número sináptico e na morfologia com base na localização do IHC, é necessário identificar com precisão o limite do corpo de ICH (por exemplo, através da coloração da miosina VIIa) e realizar determinadas etapas de processamento de imagem26 . Usando tais métodos, estudos prévios confirmaram que a perda sináptica é maior no lado do do IHC do que no lado da coluna em modelos animais de degeneração induzida por ruído26.

Estudos prévios demonstraram que as fibras de baixa taxa espontânea, de alto limiar, são mais suscetíveis ao dano de ruído do que as fibras de alta taxa espontânea, de baixo limiar, em modelos animais de sinaptopatia restrita26,30. Esses estudos fornecem a justificativa para o uso de amplitudes de estímulo da onda I do PEATE (medida usando estímulos de Tom de nível moderado a alto) para avaliar a função sináptica em modelos animais com limiar de abr normal e emissões otoacústicas do produto de distorção ( DPOAEs). Como a onda I do PEATE reflete as respostas neurais somadas das fibras nervosas auditivas, quando a sinaptopatia é avaliada por meio da amplitude da onda I do PEATE, os testes de EOAPD também devem ser realizados para excluir os danos da OHC, que também podem reduzir as amplitudes do PEATE devido ao rompimento de transdução mecanoelétrica. Embora a primeira onda do potencial de ação composto (PAC), que é medido a partir de eletrodos de janela redonda, também representa a atividade somada do nervo coclear, este método é mais invasivo e complexo do que as medidas do PEATE. Se as respostas das EOAPD retornarem ao normal após turnos de limiar temporário em camundongos expostos ao ruído31 ou ainda não se deterioraram no envelhecimento dos camundongos29, a amplitude de estímulo da onda abr eu posso prever fortemente o grau de sinaptopatia coclear , uma vez que os neurônios afetados são silenciados quando suas conexões sinápticas com IHCs são interrompidas. No entanto, se a sensibilidade coclear for reduzida devido a vários fatores (por exemplo, disfunção de OHC), as diminuições da amplitude da onda I do PEATE não podem mais ser atribuídas unicamente à perda sináptica, pois refletirão a combinação de todos os danos cocleares. Portanto, condições experimentais controladas para a preparação do modelo restrito a sinaptopatia são necessárias para garantir que a sensibilidade coclear não seja comprometida por outros fatores. Infelizmente, embora a amplitude da onda I do ABR forneça uma medida objetiva da perda auditiva da fibra de nervo nos animais, é difícil medir nos seres humanos. Além disso, patologias mistas envolvendo sinaptopatia, perda de células ciliadas e presença de outras anormalidades na cóclea podem coocorrer em humanos, limitando o uso de medições de amplitude de onda I do PEATE em configurações clínicas. A latência da onda do PEATE é calculada como o tempo em milissegundos desde o início do estímulo até o pico positivo de cada onda, proporcionando uma visão dos tempos de transmissão ao longo da via auditiva. Não foram observadas alterações significativas na latência da onda I em modelos de ratinho de synaptopatia coclear induzida por ruído ou36. No entanto, algumas evidências sugerem que os efeitos do ruído de mascaramento na latência da onda V do PEATE podem ser usados para diagnosticar a sinaptopatia coclear em seres humanos37.

Vários estudos recentes têm apoiado a noção de que a sinaptopatia coclear é o principal evento inicial associado à perda auditiva oculta, zumbido e hiperacusia. Embora o conceito de synaptopathy coclear em doenças da orelha interna seja estabelecido agora firmemente, seu impacto detalhado na habilidade da audição permanece desconhecido. O protocolo apresentado no presente estudo possibilita a investigação da morfologia e função nas sinapses da fita coclear dentro de uma região de frequência específica. Assim, esse protocolo pode ser utilizado para investigar a sinaptopatia coclear, seus mecanismos subjacentes e a eficácia de potenciais intervenções terapêuticas em vários modelos animais experimentais.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (81770997, 81771016, 81830030); o projeto de financiamento conjunto da Fundação de ciências naturais de Pequim e do Comitê de educação de Pequim (KZ201810025040); Fundação de ciências naturais de Pequim (7174291); e a Fundação de ciência pós-doutorado da China (2016M601067).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine hydrochloride Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China H35020148 100 mg/kg
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA X-1251 10 mg/kg
TDT physiology apparatus Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
SigGen/BioSig software Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
Electric Pad Pet Fun 11072931136
Dumont forceps 3# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0203-3-PO
Dumont forceps 5# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0209-5-PO
Stereo dissection microscope Nikon Corp., Tokyo, Japan SMZ1270
Goat serum ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9021
Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 Millipore Corp., Billerica, MA, USA MAB397 mouse 
Purified Mouse Anti-CtBP2 BD Biosciences, Billerica, MA, USA 612044 mouse 
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21124 goat
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21131 goat
Mounting medium containing DAPI ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9557
Confocal fluorescent microscopy Leica Microsystems, Wetzlar, Germany TCS SP8 II
Image Pro Plus software Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA version 6.0
Professional diagnostic pocket otoscope Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China HS-OT10
Needle electrode Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China 1029 20 mm, 28 G
Closed-field speaker Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA CF1

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References

  1. Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers. Ear and Hearing. 36, (3), 86-92 (2015).
  2. Fettiplace, R. Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea. Comprehensive Physiology. 7, (4), 1197-1227 (2017).
  3. Liberman, M. C. The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency. Journal of the Acoustical Society of America. 72, (5), 1441-1449 (1982).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94, (3), 951-986 (2014).
  5. Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202, (1-2), 63-73 (2005).
  6. Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197, (1-2), 1-10 (2004).
  7. Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6, 25056 (2016).
  8. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. Journal of Neuroscience. 35, (19), 7509-7520 (2015).
  9. Wichmann, C., Moser, T. Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 361, (1), 95-114 (2015).
  10. Matthews, G., Fuchs, P. The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission. Nature Reviews Neuroscience. 11, (12), 812-822 (2010).
  11. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area. Hearing Research. 339, 12-22 (2016).
  12. Yang, L., et al. Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice. Acta Oto-Laryngologica. 138, (1), 25-30 (2018).
  13. Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hearing Research. 349, 138-147 (2017).
  14. Moser, T., Starr, A. Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms. Nature Reviews Neurology. 12, (3), 135-149 (2016).
  15. Yu, W. M., et al. A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing. Elife. 2, 01341 (2013).
  16. Buniello, A., et al. Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing. EMBO Molecular Medicine. 8, (3), 191-207 (2016).
  17. Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure. Scientific Reports. 7, (1), 1054 (2017).
  18. Kane, K. L., et al. Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice. Hearing Research. 283, (1-2), 80-88 (2012).
  19. Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta). International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8, (10), 19058-19064 (2015).
  20. Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. Mouse auditory brainstem response testing. BIO-Protocol. 6, (6), (2016).
  21. Zhou, X., Jen, P. H. -S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091, (1), 16-26 (2006).
  22. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
  23. Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function. Neuron. 28, (3), 857-872 (2000).
  24. Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure. Scientific Reports. 6, 24907 (2016).
  25. Rutherford, M. A. Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy. Synapse. 69, (5), 242-255 (2015).
  26. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16, (2), 205-219 (2015).
  27. Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. Journal of Neuroscience. 33, (47), 18409-18424 (2013).
  28. Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
  29. Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline. Journal of Neuroscience. 33, (34), 13686-13694 (2013).
  30. Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110, (3), 577-586 (2013).
  31. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29, (45), 14077-14085 (2009).
  32. Valero, M. D., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta). Hearing Research. 353, 213-223 (2017).
  33. Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
  34. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14, (3), 321-329 (2013).
  35. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
  36. Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice. Neurophysiology. 49, (5), 316-326 (2017).
  37. Mehraei, G., et al. Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy. Journal of Neuroscience. 36, (13), 3755-3764 (2016).
Avaliação morfológica e funcional de sinapses de fita em regiões de frequência específica da cóclea do rato
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Yu, S. K., Du, Z. D., Song, Q. L., Qu, T. F., Qi, Y., Xiong, W., He, L., Wei, W., Gong, S. S., Liu, K. Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (147), e59189, doi:10.3791/59189 (2019).More

Yu, S. K., Du, Z. D., Song, Q. L., Qu, T. F., Qi, Y., Xiong, W., He, L., Wei, W., Gong, S. S., Liu, K. Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (147), e59189, doi:10.3791/59189 (2019).

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