Summary
Her presenterer vi en reproduserbar metode for å utvikle en orthotopic murint modell av hodet og nakken squamous celle carcinoma. Svulster viser klinisk relevante histopathological funksjoner av sykdommen, inkludert nekrose, dårlig differensiering, knutepunktet metastaser og immun infiltrasjon. Svulst-bærende mus utvikle klinisk relevante symptomer inkludert dysfagi, kjeven forskyvning og vekttap.
Abstract
Hodet og nakken squamous celle carcinoma (HNSCC) er en ødeleggende og dødelig sykdom med høy prevalens regelmessighet og behandling feil. For å utvikle bedre strategier, forståelse svulst microenvironmental faktorer som bidrar til behandling motstanden er viktig. Et stort hinder å forstå sykdom mekanismer og forbedre terapi har vært en mangel på murine linjer som ligner den aggressive og metastatisk naturen menneskelige HNSCCs. Videre fleste murine modeller ansette subkutan implantations av svulster som mangler viktige fysiologiske funksjoner i hodet og nakken regionen, inkludert vaskulær kompakt, omfattende lymfatisk blodkar og bosatt mucosal flora. Formålet med denne studien er å utvikle og karakterisere en orthotopic modell av HNSCC. Vi bruker to genetisk distinkte murine cellelinjer og etablerte svulster i bukkal mucosa mus. Vi optimaliserer collagenase-baserte svulst fordøyelsen metoder for optimal utvinning av enkeltceller fra etablerte svulster. Dataene som presenteres her viser at mus utvikle svært Stangeriaceae svulster som metastase til regionale lymfeknuter. Encellede multiparametric masse cytometri analyse viser tilstedeværelse av forskjellige immun befolkningsgrupper med myeloide celler som representerer fleste av alle immunceller. Modellen foreslått i denne studien har programmer i kreft biologi, svulst immunologi og prekliniske utvikling av romanen therapeutics. Likheten med orthotopic modellen til kliniske funksjoner for menneskelig sykdom vil gi et verktøy for forbedret oversettelse og bedre pasientens utfall.
Introduction
HNSCC er den femte vanligste malignancy globalt, med over 600 000 pasienter diagnostisert årlig1. Til tross for aggressiv behandling med kjemoterapi og strålebehandling (RT), total (OS) overlevelse for HNSCC pasienter uten humant papillomavirus (HPV)-infeksjon fortsatt under 50% etter 5 år2. Dette skyldes i stor grad til en svært komplekse svulst microenvironment som svulster kan stamme fra flere forskjellige anatomiske steder i hodet og nakken regionen, inkludert bukkal mucosa, tunge, gulv av munnen, nasal hulheten, munnhulen, svelg, oropharynx og hypopharynx. I tillegg hodet og nakken regionen er svært Stangeriaceae og inneholder nesten halvparten av alle lymfeknuter i kroppen3. Et flertall av studier undersøker hodet og nakken svulst biologi bruker svulst modeller i regionen flanke. Slike modeller kan gi innsikt i svulst-innebygde mekanismer, men mangel på det opprinnelige hodet og nakken microenvironment kan betydelig påvirke translasjonsforskning potensialet i slike funn. En metode som er brukt til å indusere muntlig svulster er gjennom eksponering til kreftfremkallende 9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene (DMBA)4. Men denne metoden er forbundet med en lang prosess, forårsaker svulster i rotter og hamstere, men ikke i mus, og den resulterende svulst ikke har mange av de histologiske differensiert SCCs5,6. Introduksjonen av carcinogen4-nitroquinoline 1-oksid (4-NQO), en vannløselig kinolin derivat, resulterte i musen muntlig svulster når brukt muntlig, men også led av lange eksponeringstider (16 uker) og en begrenset ta innenfor og mellom grupper mus7,8,9. For å utvikle klinisk relevante modeller, benyttet flere grupper genmodifiserte modeller som involverer manipulering av driveren oncogenes eller tumor suppressor gener, inkludert TP53, TGFB, KRAS, HRAS og SMAD410. Disse modellene kan tilby innsikt svulster med kjente driveren gener, men er recapitulate ikke den komplekse heterogeniteten av menneskelig HNSCCs.
I dette arbeidet viser vi muligheten til å utføre en intramucosal vaksinering squamous celle carcinoma celler i mus. Inokulerte cellene utvikle i aggressiv svulst innen 1 uke etter injeksjon. Ligner menneskelige HNSCCs, svulstene metastase til regionale lymfeknuter. Vi karakteriserer histologiske og kliniske funksjoner av sykdommen og gi innsikt i svulst immun microenvironment. Vi foreslår at denne orthotopic modell av HNSCC har programmer i kreft biologi, svulst immunologi og prekliniske studier. Mekanismer for immun evasion, svulst progresjon, behandling motstand og metastaser representerer områder av klinisk betydning som kan løses ved hjelp av foreslåtte modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble utført i samsvar med en godkjent institusjonelle dyr omsorg og bruk committee (IACUC) protokoll fra University of Colorado Denver (protocol # 00250).
1. svulst cellekultur
Merk: B4B8 og LY2 linjer ble brukt til å generere orthotopic HNSCC svulster: B4B8 tumorceller var avledet fra karsinogen-forvandlet mucosal keratinocytter (fra BALB/C mus)11. LY2 tumorceller var avledet fra lymfeknute metastaser et spontant forvandlet BALB/C keratinocyte linje (Pam 212)12,13. Begge linjer fotograferingen av Dr. Nadarajah Vigneswaran (UTHealth, Houston, TX, USA).
- Bruk Dulbecco endret Eagles middels (DMEM) F/12 med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% antimikrobielle reagens for cellen linjevedlikehold. Opprettholde disse linjer i et sterilt inkubator på 37 ° C og 5% CO2. Cellene skal brukes for vaksinering før overstiger 15 passasjer.
- Plate 2 x 106 på 4 x 106 celler i 175 cm2 celle kultur flasker.
Merk: Sikre cellene er mindre enn 90% confluent å unngå indusere en stressrespons. - Når cellene er 70% confluent (~ 48 h), fjerne kolbe settefiskanlegg og vask cellene 3 x med kaldt fosfat-bufret saltvann (PBS).
- Koble cellene fra flasken med 0,25% trypsin, nok til å dekke overflaten av platen.
- Dette gjør dispensere 4 mL av trypsin i en 175 cm2 bolle med 70% confluent celler. Inkuber cellene med trypsin i 3-4 min i celle kultur inkubator på 37 ° C og 5% CO2.
- Visualisere cellene under et mikroskop slik celle avdeling.
- Legge til 12 mL DMEM F/12 mediet som inneholder FBS å nøytralisere trypsin aktivitet.
- Sug opp cellen suspensjon og legg den i en 50 mL konisk rør.
- Riste røret som inneholder cellene ved å snu det 3 x-4 x.
- Alternativt, bland en 10 µL aliquot celle hjuloppheng med 10 µL Trypan blå i et microcentrifuge rør og telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Bestemme cellen levedyktighet ved å trekke antall Trypan-blå-positiv celler fra antall celler og dele med antall celler.
- Sentrifuge celle suspensjon på 300 x g i 5 min på 4 ° C.
- Resuspend cellene i serum- og antibiotika-fri DMEM med riktig volum slik at 1 x 106 celler finnes i 50 µL av media.
Merk: Basert på i vivo cellen linje aggressivitet (bestemmes empirisk), 1 x 106 celler per injeksjonsstedet per musen ble ansett passer for B4B8 og LY2 celler. - Plass ampullen inneholder cellen suspensjon på is.
- Plass pre tinte kjelleren membran matrix på isen.
Merk: Kjelleren membran matrix var tint natten på 4 ° C.
2. celle injeksjon i mus
- Forbered en 1:1 blanding av celler: kjelleren membran matrix (50 µL hver).
- Legge til cellene først. deretter gradvis Pipetter kjelleren membran matrix. Unngå å innføre luftbobler. Kontroller at blandingen er laget umiddelbart før dyr injeksjon. Legge celler til kjelleren membran matrise for lengre tid kan resultere i cellen bosatte seg i matrix blandingen, noe som gjør det vanskelig å riste strengt blandingen. Dette fører til en betydelig variasjon i tumor størrelse mellom mus.
- Bland forsiktig. Kontroller alle foranstaltningene innvolvere matrix utføres på is. Kjelleren membran matrix vil danner ved romtemperatur.
- Forberede sprøyter vaksinering.
- Legg 0,5 mL insulin sprøyter (23 G) med 100 µL av cellen/kjeller membran matrix løsningen.
- Holde sprøyter på is å unngå kjelleren membran matrix polymerisasjon.
- Bedøve mus ved å plassere dem i et kammer med isoflurane og oksygen (2,5%).
- Sikre mus er dypt anesthetized før du utfører injeksjon (ved å sikre manglende respons til tå knipe).
- Sette inn nålen inn i høyre eller venstre bukkal regionen. Dette utføres gjennom tilgjengelig åpen plass på begge sider av munnen.
- Kontroller at musen er tunge ikke er i veien.
Merk: Det er lett å rote tungen, som vil resultere i tungen svulster. Flytte tungen til motsatt side om nødvendig. - Holde sprøyten parallelt bukkal regionen mens inne i munnhulen.
- Når du er klar å injisere, trekke sprøyten tilbake og sakte Legg sprøyten i 10° vinkel.
- Injisere 100 µL av cellen/kjeller membran matrix suspensjon over en periode på 5 s.
- Holde sprøyten i stedet for en ekstra 5 s å sikre alt materiale injiseres.
Merk: For kontroll nontumor-bærende mus, injisere en blanding av serum-frie medier og matrise (som beskrevet ovenfor) uten kreftceller. - Ta ut sprøyten forsiktig.
- Fortsette det over fremgangsmåten med gjenværende musene.
- Tillate 1 uke før svulster begynner å vises grovt (50-200 mm3 for B4B8 og LY2 celler).
3. musen overvåking
- Utføre første måling med calipers på 1 uke etter svulst celle injeksjon. For å beregne svulst volumet ved hjelp av eksterne calipers, bestemme den største langsgående diameteren (lengde) og den største tverrgående diameteren (bredde) og bruke den endrede ellipsoidisk formel14,15.
- Fortsette å utføre vanlige caliper målinger for svulst volum (1 x-2 x per uke med jevne mellomrom).
- Måle dyr vekt å vurdere effekten av tumor vekst på mate.
4. høsting svulster
- Når det eksperimentelle endepunktet avlive dyrene ved hjelp av hensiktsmessige tiltak (f.eks CO2 kvelning, halshogging eller cervical forvridning).
Merk: I denne studien endepunktet ble nådd om musene ble døende (med vekttap av > 15% av deres første vekt, en mangel på grooming, cachexia) og/eller hvis tumor størrelse nådd 1000 mm3. -
Begynne dissekerende dyr ved å lage et langt snitt gjennom midtlinjen i nakken regionen.
- Bruk sløv tang å ta huden og skarp saks å kutte huden.
- Sett inn saks forsiktig under huden som dekker svulsten og opprette luftlommer ved å skyve saksen over og inn i huden.
- Når huden er tilstrekkelig løsrevet fra svulsten, identifisere drenering lymfeknuter (DLNs) og avgiftsdirektoratet dem slippe tumor vev forvirret av tilstedeværelsen av lymfeknuter.
Merk: Store svulster kan nå og/eller dekke DLN. Avhengig av analysen blir utført, er isolering av intakt lymfeknuter viktig å unngå søl av immunceller i svulsten, som vil resultere i forvrenger analyseresultatene. - Skjære gjennom grensene av svulsten før hele volumet er demontert.
5. svulst behandling for nedstrøms programmer
- For nedstrøms histologic eksamen, plassere svulster i 10% formalin ved romtemperatur. For å unngå overfixation, erstatte formalin med 70% etanol. Behandle svulstene for flyt cytometri analyse, som beskrevet nedenfor.
Merk: Vevet kan holdes i formalin 72 h før overfixation kan bli problematisk for visse typer flekker. - Skjær svulst i 1-2 mm-størrelse ved hjelp av et sterilt barberblad eller skarp saks.
- Plasser klippe svulst bitene i en 50 mL konisk rør med collagenase III (4 250 enheter per prøve), DNase jeg (0,1 mg per prøve), og trypsin hemmer (1 mg per prøve).
- Ruge på 37 ° C i 30 min med skjelvende hvert 10 min.
Merk: Eksemplene kan plasseres i en gjenlukkbare pose, sterilisert med 90% etanol, og plassert i en celle kultur inkubator. - Etter 30 min, kan du legge til 20 mL Hanks balansert salt løsning (HBSS) og spinn på 300 x g i 5 min.
Merk: HBSS består av kalium klorid, natriumklorid, natriumbikarbonat, natrium fosfat dibasic, natrium fosfat monobasic og glukose. - Forkast nedbryting og resuspend pellet i 2-3 mL av røde blodlegemer (RBC) lyseringsbuffer. Pipetter grundig.
Merk: RBC lyseringsbuffer består av salmiakk natriumbikarbonat og disodium. - Inkuber i 2 minutter ved romtemperatur.
Merk: Lengre inkubasjon kan være giftig for andre celle populasjoner. - Legge til 20 mL HBSS å nøytralisere effekten av lyseringsbuffer.
- Sentrifuge på 300 x g i 5 min og kast nedbryting.
- Resuspend pellet i 10 mL av HBSS.
- Passerer løsningen gjennom en 70 µm nylon restrainer og sentrifuge på 300 x g for 5 min. forkaste nedbryting.
- Gjenta 5.8-5.10 og passerer cellen suspensjon gjennom en 40 µm nylon restrainer å sikre alle ekstra partikler er fjernet fra suspensjon.
6. celle flekker og datainnsamling
- Resuspend celle pellet i 1 mL av HBSS.
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer eller en automatisert celle teller, som beskrevet i trinn 1.7
-
Bestemme total celle nummer og riktig konsentrasjon til farging.
Merk: ideelt celle konsentrasjonen til flyt cytometri farging er 1-2 millioner celler. For eksempel hvis flekker er utført i en 96-brønns plate og det er 10 millioner celler, resuspend prøven i 1 mL og plate 100 µL for 1 million celler per brønn. -
Legge til Fc blokk (CD16/CD32) i en konsentrasjon av 1: 100 for å hindre nonantigen-spesifikke binding av immunglobuliner på FcγIII og FcγII reseptorene. Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
- Virvel og resuspend celle pellet i 100 µL av flyt cytometri celle flekker buffer (består av saltvann inneholder 5% FBS, 2% EDTA og 1% HEPES).
-
Utføre celleoverflaten flekker etter leverandør gitt instruksjoner (legge til hver antistoff på den aktuelle fortynning). Inkuber for 60 min ved romtemperatur.
- Virvel og resuspend celle pellet i 100 µL av HBSS. Gjenta 2 x å bli kvitt overflødig antistoff.
-
Kjøre prøver på en passende flyt cytometer.
- Hvis analysere intracellulær markører (f.eks foxp3), utføre cellen permeabilization og flekker i henhold til leverandørens instruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vitro vurdering av LY2 og B4B8 celle spredning viste at begge linjer har samme dobling tid (21 h og 23 h, henholdsvis). In vivo, begge cellelinjer dannet en enkelt, synlig og håndgripelig masse 1 uke etter vaksinering (figur 1A). I mus med LY2 svulster, var kjeven fortrengt av 3 uker på grunn av svulst byrden (figur 1A). Kontroll mus som ikke fikk kreftceller utvikle ikke svulster som forventet. LY2 svulster vokste på en høyere rente sammenlignet B4B8 svulster. Gjennomsnittlig svulst volumet på dag 21 i LY2 svulst rentebærende mus var 632 ± 10 mm3 sammenlignet 162 ± 4 mm3 i B4B8 svulster (figur 1B). Mus viser kjeven forskyvning raskt utviklet vekttap på grunn av dysfagi (figur 1 c). Mus viser betydelig vekttap definert som > 15% av deres første vekt og/eller har en svulst volum > 1 cm3 var euthanized innen 1 dag av bemerket observasjon. Median overlevelse i LY2 mus var 22,5 dager, sammenlignet med 52.0 dager i B4B8 svulst rentebærende mus (figur 1 d).
Magnetisk resonans imaging (MRI) av svulst rentebærende mus viste godt avgrensede svulster utvide inn i det indre laget bukkal mucosa (figur 2A). Svulster ikke invadere i tungen eller andre nærliggende organer (spiserøret, bronchus, brisselen) som vist med histologiske vurdering. Signalet heterogenitet på MR bilder var representant for Stangeriaceae hyperintense regioner (betegnet med V) og nekrotisk hypointense regioner (betegnet med N) (figur 2A). En grov patologisk undersøkelse viste forstørret DLNs (figur 2B). Vi vurdert videre svulst volum med beregnede tomografi (CT) å avgjøre påliteligheten av caliper målinger. Svulster var avgrenset med en digital bildebehandling og kommunikasjon i medisin (DICOM) bildet analyse programvare16. Vurdering av LY2 svulst volumet med calipers og CT bildebehandling viste en utmerket sammenheng mellom de to metodene (R2 = 0.8493; Figur 2C). Dette angir at tumorveksten er primært exophytic caliper måling er en pålitelig metode for vurdering av tumor vekst. Histologic undersøkelse viste at alle LY2 svulst rentebærende mus utviklet dårlig differensiert squamous celle carcinoma (figur 2D). Ni av ni LY2 svulst rentebærende musene utviklet metastaser til første og andre echelon lymfeknutene. Knutepunktet metastaser var hovedsakelig subcapsular (med sju av ni mus) og bihulene (med fem av ni mus), med to av ni mus demonstrere intracapsular invasjon. Derimot mus bærer B4B8 svulster utviklet moderat differensiert squamous celle carcinoma (figur 2E) og ikke metastase å regionale eller fjerntliggende områder, inkludert DLNs. nekrose ble vurdert basert på en tidligere satt tre-klasse skala: 0 = ingen synlige nekrose, 1 = snaut, 2 = moderat og 3 = alvorlig17. Alle LY2 svulst rentebærende mus bekreftet histologisk nekrose med fleste (sju av ti) demonstrere moderat til alvorlig nekrose (figur 2F). Ingen bevis for nekrose ble observert i B4B8 svulster.
Vi fokuserer på LY2 svulst modell for videre karakteristikk av svulst-immune microenvironment. Svulster ble høstet i 3 uker etter svulst inoculation og fordøyd bruker collagenase III, etterfulgt av den flekker på celleoverflaten og intracellulær indikatorer for strøm/masse cytometri (figur 3A). Prøvene ble behandlet, bruker en masse cytometer, ved Universitetet i Colorado Denver Flow cytometri delt ressurs. Gating og dataanalyse ble utført med flyt cytometri kommersiell programvare. Dataene innhentet viste tilstedeværelse av mange immun celle populasjoner i varierende grad. Totalt immunceller (CD45+) representert 7,3% av totale svulsten (figur 3B). I absolutte tall vi observert, gjennomsnittlig 26 CD45+ celler (SD = 0,81) per mg av tumor vev (figur 3B). Myeloide celler (CD11b+) representerte 37,8% av alle CD45+ celler (Figur 3 c). Myeloide celler var består hovedsakelig av makrofager (F4 / 80 +, 63.0%), etterfulgt av myelogen-avledet suppressor cellene (MDSCs) (Gr1 +, 8.51%) og nøytrofile (Ly6G +, 5.87%). Totalt T celler består 15,9% av CD45+ celler med CD4+ T celler som utgjør flertallet av alle T-celler (79.4%), som 53,4% var regulatoriske T celler (Tregs) (CD4+FoxP3+) (figur 3D). Naturlig killer (NK) celler består 1.75% av alle CD45+ celler. Disse dataene høydepunkt tilstedeværelsen av ulike immun infiltrerer i LY2 orthotopic HNSCC svulster som trolig spiller en rolle i formidling svulst progresjon og immun evasion.
Figur 1: overvåking mus bærer orthotopic HNSCC svulster. (A) representant bilder av svulst rentebærende mus. Den inokulerte bukkal utvikler en svulst innen 1 uke etter vaksinering. På 3 uker, er forskyvning av kjeven observert. (B) Tumor vekst i B4B8 og LY2 svulst rentebærende mus som bestemmes av caliper målinger. (C) endringer i kroppsvekt mus med B4B8 eller LY2 svulster. (D) overlevelse av B4B8 og LY2 svulst rentebærende mus. Stolpene angir standard feil av gjsnitt (SEM) 7 – 10 mus per gruppe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: bildebehandling og histologic funksjoner i murine HNSCC svulster. (A) representant koronale MR bilde av en LY2 svulst rentebærende mus. Anatomisk nettsteder er merket. Områder av signal hyperintensity representerer Stangeriaceae regioner (betegnet V). Regioner i signal hypointensity representerer nekrotisk (betegne N). (B) representativt bilde brutto av en dissekert svulst inneholder region. Hvite pilene peker til forstørret drenering lymfeknuter (DLNs). (C) korrelasjon av svulst som vurdert av caliper måling versus beregnet tomografi (CT)-basert vurdering. Skråningen og korrelasjonskoeffisient (R2) linje for beste tilpasning vises. (D) representant hematoxylin og eosin (H & E) bilde av LY2 svulst. (E) representant H & E bilde av B4B8 svulst. (F) kvantifisering av nekrose i LY2 svulster, basert på en H & E fire førsteklasses scoring system. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: analyse av planlagte intratumoral immune populasjoner med cytometri ved tid-av-fly (CyTOF). Svulster ble behandlet i en enkeltcelle hjuloppheng med collagenase-baserte enzymatisk fordøyelsen, og deretter farget med celle overflaten og intracellulær markører. (A) Mass cytometri ble utført ved hjelp av CyTOF-plattformen. (B) absolutte og relative kvantitativ vurdering av total immunceller (CD45+). (C) kvantifisering av myelogen-immune subpopulasjoner. (D) kvantifisering av lymfoide immun subpopulasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Grundige analyser og karakterisering av svulst microenvironment representerer en viktig strategi for forståelse mekanismer av tumor utvikling, progresjon og metastaser og utviklingen av effektive behandlingsformer. Hode og nakke kreft er en komplisert sykdom som kan stamme fra flere anatomiske områder i hodet og nakken regionen. Et stort hinder å forstå sykdom mekanismer og forbedre terapi har vært en mangel på murine musen linjer som ligner den aggressive og metastatisk naturen menneskelige HNSCCs. Videre ansette mange murine modeller en subcutaneous implantasjon av svulster som mangler viktige fysiologiske funksjoner i hodet og nakken regionen, inkludert en høy vaskulær tetthet, en omfattende lymfatisk blodkar og bosatt mucosal flora.
I denne studien karakteriserte vi en orthotopic modell av murine HNSCC. Vi valgte bukkal mucosa som stedet for svulst inoculation for en rekke årsaker, blant annet enkel tilgang til regionen uten bilde veiledning, evnen å taksere tumor vekst med calipers, tilstedeværelse av svulsten i slimhinnene flora, den tilstedeværelsen av omkringliggende lymphatics og enkel reproduserbarhet. Selv om injeksjon av celler i bukkal mucosa er grei, plasseringen av nålen og dybden av gjennomtrengning er avgjørende for å hindre punktering gjennom huden og sikre celler ikke er injiseres subcutaneously. Anbefaler vi å sette nålen intra-muntlig mens det perfekt parallell til bukkal regionen og vippe skrått ingen større enn 10 ° når du er klar å injisere.
Cellelinjer vi brukte var murine linjer slik at deres implantasjon i immunkompetente mus av belastningen de er avledet fra. Det finnes over 39 HNSCC human cellelinjer som har blitt studert i litteraturen, men kan ikke brukes i en innfødt microenvironment18. Siste utviklingen tillatt for design av humanized musen modeller som integrerer menneskelig bein margtransplantasjon-avledet chimeras i NIKK scid gamma mus (også kjent som NSG mus), slik at utviklingen av en menneskets immunsystem som kan samhandle med menneskelige svulster i en immunodeficient mus modell19. Men slike modeller er kostbare, krever arbeidskrevende avl metoder, og er recapitulate ikke alle komponentene i svulst microenvironment, inkludert fibroblaster og endotelceller, og lymfekar. Murine musen modeller vi ansatt i denne studien recapitulate kritiske komponenter av menneskelig HNSCCs, inkludert tilstedeværelse av ulike immun infiltrerer. For å sikre maksimal henting av levedyktig enkeltceller fra svulster, er bruk av fordøyelsen enzymer nødvendig. Collagenase-baserte fordøyelsen enzymer kan være harde på celler og optimalisering av konsentrasjonen og type collagenase kan være nødvendig for ulike svulst typer. Vi sammenlignet fem fordøyelsen enzymer før du bestemmer at collagenase III, som ble brukt i denne studien, er den optimale metoden for fordøyelsen av squamous celle svulster.
Svulst modeller brukt i denne studien er spesielt nyttig for å studere mekanismer for HNSCC immune evasion og prekliniske vurdering av ulike terapier. Vi viste tidligere at både B4B8 og LY2 svulster er radioresistant og ildfast til immun checkpoint hemmer anti-PD-L120. Dette er i tråd med fleste menneskelige HNSCCs. Siste kliniske studier viste at mindre enn 15% av HNSCC pasientene er mottakelig for anti-PD-1/PD-L1 terapi21,22,23,24,25. I tillegg er det godt etablert at HNSCCs er radioresistant26,27. Målretting trasé ansvarlig for radioresistance i HNSCC er et viktig skritt for å forbedre behandlingsrespons. Landemerket Bonner et al. studie viste en betydelig fordel i total overlevelse med tillegg av cetuximab til RT sammenlignet RT alene i lokalt avansert HNSCC pasienter28. Nyere data viser at hemming av EphB4-Ephrin-B2 signalering i orthotopic HNSCCs kan forbedre responsen RT eller cetuximab-RT ved å fremme svulst apoptose og hemme svulst spredning29,30. I tillegg kan kombinerer RT med rasjonell immun terapi øke antitumor immunreaksjoner og forbedre både lokale svulst kontroll og kontroll av fjernmetastaser31. Vi har nylig vist at målretting Tregs i kombinasjon med immun checkpoint blokaden og RT resulterer i svulst fjerning og immunologiske minne32. Fremtidige studier ansette orthotopic modeller av HNSCC bedre informere design av kliniske forsøk og forbedre forståelsen av mekanismer av svulst immun evasion og behandling motstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase III | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | |
| DNase I | Worthington Biochemical Corp. | LS006328 | |
| Fc Block (CD16/32) | BD Biosciences | 553141 | Clone 2.4G2 |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no pheno red |
| Helois mass cytometer | Fluidigm | NA | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB-40234B | |
| MRI Scanner | Bruker | NA | 7.4 Tesla |
| RBC lysis buffer | BioLegend | 420301 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington Biochemical Corp. | LS002830 |
References
- Chaturvedi, A. K., et al. Worldwide trends in incidence rates for oral cavity and oropharyngeal cancers. Journal of Clinical Oncology. 31 (36), 4550-4559 (2013).
- Ang, K. K., Sturgis, E. M. Human papillomavirus as a marker of the natural history and response to therapy of head and neck squamous cell carcinoma. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 128-142 (2012).
- Amin, M. B., et al. The Eighth Edition AJCC Cancer Staging Manual: Continuing to build a bridge from a population-based to a more "personalized" approach to cancer staging. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (2), 93-99 (2017).
- Salley, J. J. Experimental carcinogenesis in the cheek pouch of the Syrian hamster. Journal of Dental Research. 33 (2), 253-262 (1954).
- Morris, A. L. Factors influencing experimental carcinogensis in the hamster cheek pouch. Journal of Dental Research. 40, 3-15 (1961).
- MacDonald, D. G. Comparison of epithelial dysplasia in hamster cheek pouch carcinogenesis and human oral mucosa. Journal of Oral Pathology & Medicine. 10 (3), 186-191 (1981).
- Hawkins, B. L., et al. 4NQO carcinogenesis: a mouse model of oral cavity squamous cell carcinoma. Head & Neck. 16 (5), 424-432 (1994).
- Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
- Vered, M., Yarom, N., Dayan, D. 4NQO oral carcinogenesis: animal models, molecular markers and future expectations. Oral Oncology. 41 (4), 337-339 (2005).
- Bornstein, S., et al. Smad4 loss in mice causes spontaneous head and neck cancer with increased genomic instability and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 119 (11), 3408-3419 (2009).
- Thomas, G. R., Chen, Z., Oechsli, M. N., Hendler, F. J., Van Waes, C. Decreased expression of CD80 is a marker for increased tumorigenicity in a new murine model of oral squamous-cell carcinoma. International Journal of Cancer. 82 (3), 377-384 (1999).
- Yuspa, S. H., Hawley-Nelson, P., Koehler, B., Stanley, J. R. A survey of transformation markers in differentiating epidermal cell lines in culture. Cancer Research. 40 (12), 4694-4703 (1980).
- Chen, Z., Smith, C. W., Kiel, D., Van Waes, C. Metastatic variants derived following in vivo tumor progression of an in vitro transformed squamous cell carcinoma line acquire a differential growth advantage requiring tumor-host interaction. Clinical & Experimental Metastasis. 15 (5), 527-537 (1997).
- Euhus, D. M., Hudd, C., LaRegina, M. C., Johnson, F. E.
- Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. NeuroImage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Dutta, S., et al. The relationship between tumour necrosis, tumour proliferation, local and systemic inflammation, microvessel density and survival in patients undergoing potentially curative resection of oesophageal adenocarcinoma. Britisch Journal of Cancer. 106 (4), 702-710 (2012).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research. 12 (4), 571-582 (2014).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Oweida, A., et al. Ionizing radiation sensitizes tumors to PD-L1 immune checkpoint blockade in orthotopic murine head and neck squamous cell carcinoma. OncoImmunology. 6 (10), e1356153 (2017).
- Ferris, R., et al. Further evaluations of nivolumab (nivo) versus investigator’s choice (IC) chemotherapy for recurrent or metastatic (R/M) squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN): CheckMate 141. Journal of Clinical Oncology. 34, (2016).
- Ferris, R. L., et al. Nivolumab for Recurrent Squamous-Cell Carcinoma of the Head and Neck. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1856-1867 (2016).
- Harrington, K. J., et al. Nivolumab versus standard, single-agent therapy of investigator's choice in recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (CheckMate 141): health-related quality-of-life results from a randomised, phase 3 trial. The Lancet Oncology. 18 (8), 1104-1115 (2017).
- Kiyota, N., et al. A randomized, open-label, Phase III clinical trial of nivolumab vs. therapy of investigator's choice in recurrent squamous cell carcinoma of the head and neck: A subanalysis of Asian patients versus the global population in checkmate 141. Oral Oncology. 73, 138-146 (2017).
- Ling, D. C., Bakkenist, C. J., Ferris, R. L., Clump, D. A. Role of Immunotherapy in Head and Neck Cancer. Seminars in Radiation Oncology. 28 (1), 12-16 (2018).
- Perri, F., et al. Radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma: Biological bases and therapeutic implications. Head & Neck. 37 (5), 763-770 (2015).
- Yamamoto, V. N., Thylur, D. S., Bauschard, M., Schmale, I., Sinha, U. K. Overcoming radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 63, 44-51 (2016).
- Bonner, J. A., et al. Radiotherapy plus cetuximab for locoregionally advanced head and neck cancer: 5-year survival data from a phase 3 randomised trial, and relation between cetuximab-induced rash and survival. The Lancet Oncology. 11 (1), 21-28 (2010).
- Bhatia, S., et al. Inhibition of EphB4-Ephrin-B2 Signaling Enhances Response to Cetuximab-Radiation Therapy in Head and Neck Cancers. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4539-4550 (2018).
- Bhatia, S., et al. Enhancing radiosensitization in EphB4 receptor-expressing Head and Neck Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 6, 38792 (2016).
- Tang, C., et al. Combining radiation and immunotherapy: a new systemic therapy for solid tumors? Cancer Immunology Research. 2 (9), 831-838 (2014).
- Oweida, A., et al. Resistance to radiotherapy and PD-L1 blockade is mediated by TIM-3 upregulation and regulatory T-cell infiltration. Clinical Cancer Research. , (2018).
