Her presenterer vi en protokoll ved hjelp av en mus posisjonering enhet som muliggjør riktig plassering av mus for intranasal administrasjon av en hjerne-målretting peptid-siRNA formulering muliggjør effektiv gen demping i sentralnervesystemet.
Intranasal (IN) narkotika levering til hjernen har dukket opp som en lovende metode for å omgå blod-hjerne-barriere (BBB) for levering av narkotika i sentralnervesystemet (CNS). Nyere studier viser bruk av et peptid, RVG9R, som omfatter minimal reseptor-bindende domene av rabies virus glykoprotein, i fremlokkende levering av siRNA i neurons i hjernen. I denne protokollen, peptid-siRNA formulering leveres intranasalt med en pipette i den dominerende hånden, mens anesthetized musen er behersket av scruff med nondominant hånd i en “hodet ned-og-frem posisjon” for å unngå drenering i lungene og magen ved innånding. Denne presise grep av mus kan læres, men er ikke lett og krever praksis og dyktighet til å resultere i effektive CNS opptak. Videre er prosessen lang trukket, krever ca 45 min for administrasjon av et samlet volum på ~ 20-30 μL av oppløsning i 1-2 μL dråpe volum per inhalasjon, med 3-4 min hvileperioder mellom hver inhalasjon. Målet med denne studien er å avsløre en mus posisjonering enhet som muliggjør riktig plassering av mus for effektiv i administrasjon av peptid-siRNA formulering. Flere funksjoner er innlemmet i utformingen av enheten, for eksempel fire eller åtte posisjonering stoler med justerbar høyde og vippe for å holde anesthetized mus i hodet ned-og-fremover posisjon, slik at enkel visualisering av musene nares og en innebygd oppvarming pad for å opprettholde musene kropps temperaturer under inngrepet. Viktigere, muligheten til å behandle fire eller åtte mus samtidig med RVG9R-siRNA komplekser på denne måten gjør studier på en mye raskere tidsskala, for testing av en IN terapeutisk siRNA tilnærming. Som konklusjon, denne enheten gir riktig og kontrollert mus hodet posisjonering for IN anvendelse av RVG9R-siRNA og andre terapeutiske molekyler, som nanopartikler eller antistoffer, for CNS levering.
Den BBB hindrer systemisk administrert molekyler av > 400-600 da fra å komme inn i hjernen, utgjør en betydelig utfordring for levering av terapeutiske biomolekyler for sykdommer som påvirker CNS og hjernen1. Direkte legemiddellevering til hjernen kan oppnås ved stereotactic injeksjon; Dette krever imidlertid kirurgisk kompetanse og er svært begrenset i levering til områder proksimale til injeksjonsstedet, noe som gjør det uegnet for rutinemessig klinisk bruk2. I levering til hjernen kan også føre til direkte hjerne levering ved å omgå BBB, slik at for direkte og rask overføring av en rekke stoffer til hjernen3,4. Denne overføringen er antatt å skje ved transport mekanismer via olfactory og Trigeminal nerver som kobler nese passasje til hjernen, spinalvæsken, og lymfesystemet5. Som direkte nese-til-hjerne ruten ikke involverer perifere organer og vev, det vesentlig reduserer systemiske bivirkninger og forbedrer potens. IN administrasjon er et lovende ikke-invasiv alternativ til både lokale og systemiske ruter for hjerne levering av terapeutiske midler og kan representere en kraftig tilnærming for å bekjempe nevrologiske lidelser, inkludert Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, og Brain Cancer, og blir utforsket i flere kliniske studier6,7,8.
Flere eksperimentelle faktorer, slik som volum og metode for inoculation, samt formulering pH, sterkt påvirke stoffet levering til CNS via nese-til-hjerne Pathway9. I studier med mus, er suksessen til IN narkotika levering sterkt avhengig av riktig hode posisjonering, som er avgjørende for effektiv hjerne deponering og for å unngå narkotika drenering i det ytre miljøet eller luftveiene. Spesielt, sysselsetter flertallet av gnagere studier en hode-back stilling (liggende) med en 70 °-90 ° Tilt for narkotika levering til olfactory epitel, selv om hodet posisjonering på 0 ° kan favorisere drenering i luftrøret9. I levering av narkotika i mus som er våken resultater i redusert hjerne deponering i forhold til enhver anvendelse i liggende posisjon, hovedsakelig på grunn av vitenskapsmenn manglende evne til å holde mus i ønsket posisjon for lengre perioder av gangen. Videre, den opp-ned posisjon som kreves av huden grep metoden ansatt for våken mus resulterer i narkotika deponering hovedsakelig i Trigeminal Nerve og olfactory pære, samt perifere organer, som nyrer og lunger, innen 30 min postinoculation10. Den mest hensiktsmessige kroppen posisjon for levering av legemidler gjennom olfactory eller Trigeminal nerver i større dyr som nonhuman primater i kliniske studier synes å være hodet ned-og-fremover posisjon (dvs. den såkalte “ber til Mekka posisjon “)11. Imidlertid har denne posisjonen ikke vært godt studert i muse modellen, og liggende posisjon er mer utbredt i gnager studier.
Tidligere har vi vist at RVG9R, et peptid designet basert på minimal reseptor bindende domene av rabies virus, viser tropism til celler uttrykker nikotins acetylkolin reseptor under enheter som neurons og makrofager og formidler intracellulære levering av siRNA av en mekanisme som involverer reseptor engasjement og midlertidig plasma membran delocalization på stedet av reseptor aggregering12,13. Viktigere, systemisk intravenøs administrering av RVG9R-siRNA komplekser muliggjør transvascular levering av siRNA i CNS14. Men den systemiske ruten utvanner mengden siRNA levert til CNS, og nyere data viser at IN administrasjon av RVG9R: siRNA komplekser til mus plassert i hodet ned-og-fremover posisjon utløser bredt spredt mål genet knockdown i flere regioner av hjernen15. Viktigere var dette nivået av knockdown oppnådd med så lite som 13,5 mikrogram siRNA administrert over en fire-dose, 2 dagers regime mens IV ruten krever en ~ 5 ganger høyere dose per injeksjon for å oppnå sammenlignbare knockdown. Den eneste brist i IN tilnærmingen er at det er en krevende prosedyre, som krever bruk av begge hender under administrasjon av løsningen mens kontinuerlig gripe musene alternativt i hodet ned-og-frem og i avslappet posisjoner mellom hver inhalasjon for en betydelig lang behandlingsperiode (en 30-45 min prosedyre for effektiv opptak av et ~ 20-30 μL volum per mus). Ved hjelp av musen posisjonering enheten som presenteres her gjør at riktig plassering av mus med lite fysisk tvang til dyrene og personell utfører protokollen, samt behandling av flere kohorter av mus innen rimelig tid, muliggjør en grundig studie om bruk av siRNAs som en terapeutisk for West Nile encefalitt i mus ved sene stadier av sykdommen15.
Vi har utviklet en mus posisjonerings enhet for optimalt posisjonering mus for nese-til-hjerne levering av legemiddel selskap. Enheten er utstyrt med ulike funksjoner, noe som sikrer enkel samtidig håndtering av dyr. Det er også utstyrt med Varmeputer for vedlikehold av dyrenes fysiologiske kropps temperaturer under eksperimentering. Den anesthetized mus kan opprettholdes i hodet ned-og-fremover posisjon ved hjelp av spesielt designede stoler, med minimal ubehag for dyrene. Høyden på posisjonering stolene kan justeres på en slik måte som er best å visualisere dyret nesebor mens administrering av narkotika.
I hjernen levering har flere iboende begrensninger, inkludert det lille overflatearealet av nesebor (som tillater maksimalt volum på 20-30 μL per administrasjon), nasal irritasjon, epitel skader, og begrenset absorpsjon over nese epitel18. IN administrering av legemidler til mus plassert i liggende posisjon har blitt brukt til hjerne levering ved å slippe flytende medikamenter inn i dyrenes alternative nares via pipette eller polyuretan slange (24 G x 19 mm) koblet til mikroliter sprøyter19, 20. selv om bruk av rørsystemer for å løslate narkotika i nærheten av olfactory epitel er en potensielt egnet tilnærming, det fører til irritasjon eller nasal betennelse ved repeterende administrasjon. Videre begrenser den lille størrelsen på nesehulen denne tilnærmingen, spesielt hos mus som kan overvinnes ved å gjenta, så vel som av legemiddel formuleringer som vedvarer i neseslimhinnen. Et annet alternativ er IN administrasjon av legemiddel selskap til våken mus10. Denne tilnærmingen krever imidlertid dyktige prosedyrer for håndtering av dyr i løpet av inoculation. I tillegg fører det dyr stress, og derfor er ikke ideelt for sykdom modeller, spesielt smittsomme sykdommer modeller. Videre kan inkonsekvent dosering lett oppstå fra narkotika drenering i lungene eller magen på grunn av ufullkomne dyr gripende. Tilnærmingen som presenteres her tillater forskere å overvinne disse tekniske barrierene. Hodet Down-og-Forward posisjon reduserer muligheten for narkotika lekkasje fra nesen til lungene mens inhalering, favoriserer direkte og selektiv siRNA levering til hjernen. IN levering ved hjelp av musen posisjonering enheten krever ikke noen spesialisert teknikk for håndtering eller gripe dyrene under inoculation. Fire dyr om gangen kan behandles for en periode på minst 30-45 min. Prosedyren kan skaleres opp ved å inkludere en ekstra fire-stolen bar, noe som åpner for enkel styring av opptil åtte mus i samme eksperimentelle økten. Derfor, etter denne metoden, en enkelt operatør kan indusere narkotika levering til hjernen av store grupper av dyr over lengre perioder.
Den anatomiske strukturen i nesehulen påvirker sterkt nese-til-hjerne-leveringen (som gjennomgått av Merkus et al.11 og Ruigrok og de lange21). Den relative overflateareal av nesehulen i mus er 15 ganger større enn for mennesker og den relative overflateareal av olfactory epitel er 6 ganger større. Selv om det er betydelige forskjeller i anatomi av nesehulen hos mennesker til gnagere, er det ca 45 kliniske studier i gang med IN tilnærming til å behandle flere hjerne lidelser (www.clinicaltrials.gov). Studien viser her at når du bruker i levering av legemiddel, bør forskerne vurdere flere faktorer, for eksempel hodet posisjon, sove, og riktig levering agenter.
Vi har vist den effektive og spesifikke deponering av fluorescensmerkete merket siRNA til musen hjernen. Videre observerte den betydelige reduksjonen i SOD1 genuttrykk etter at IN siRNA-leveransen har bekreftet funksjonelle effekter. Vi har tidligere viste konsekvent at IN administrasjon av RVG9R-siRNA komplekser rettet mot West Nile virus (WNV) RNA utøver en sterk terapeutisk effekt på WNV encefalitt15. Spesielt, nese-til-hjerne siRNA levering krevde en celle-målretting ligand (RVG) og et positivt ladet molekyl (9R) til komplekse siRNA. I fravær av disse elementene, ble molekyler ryddet gjennom systemisk krets og lymfesystemet fartøy 48 h posttreatment (figur 3a)15. Derfor, i den eksperimentelle oppsett beskrevet her, har vi undersøkt peptid/siRNA lokalisering 48 h etter inoculation til bildet bare nivåer beholdt spesielt i hjernen. Denne tilnærmingen kan lett implementeres for levering av andre molekyler, slik som proteiner, peptider, og nanopartikler, eller andre legemidler, for behandling av en rekke hjerne-relaterte lidelser.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Korea Ministry of Health & velferd (HI17C1046) til S.K.L.
Comercial assays | |||
iScript cDNA synthesis kit | BioRad | Cat# 1708891 | |
RNAiso plus | TaKaRa Bio | Cat# 9108 | |
SYBR Premix ExTaq | TaKaRa Bio | Cat# RR420A | |
Dyes | |||
Alexa fluor 488 | ThermoFisher | Cat# A30052 | |
Mouse strain | |||
Balb/c | Orient Bio | N/A | 6-8 week old, 20-30g |
Oligonucleotides and primers | |||
Human CD4 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3’ |
siSOD1 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’ |
GAPDH primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’ R: 5’-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3’ |
SOD1 primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’ |
Peptides | |||
RVG9R | Peptron | N/A | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR |
RVM9R | Peptron | N/A | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR |
Software, algorithms and devices | |||
FlowJo software 4.3 | FlowJO, LLC | N/A | http://docs.flowjo.com/vx/ |
Mouse positioning device | Signet Biotech | N/A | |
Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |