Summary
Hier presenteren we een protocol met behulp van een muis positionerings apparaat dat de juiste plaatsing van muizen mogelijk maakt voor de intranasale toediening van een hersen gerichte peptide-siRNA-formulering die effectieve gen-uitschakeling in het centrale zenuwstelsel toelaat.
Abstract
Intranasale (IN) drug delivery aan de hersenen is ontstaan als een veelbelovende methode om te omzeilen de bloed-hersen barrière (BBB) voor de levering van geneesmiddelen in het centrale zenuwstelsel (CNS). Recente studies tonen het gebruik van een peptide, RVG9R, met inbegrip van de minimale receptor-bindende domein van de rabiësvirus glycoproteïne, in het opwekken van de levering van siRNA in neuronen in de hersenen. In dit protocol wordt de peptide-siRNA-formulering intra-tranasaal met een pipet in de dominante hand geleverd, terwijl de verdoemde muis wordt vastgehouden door de Scruff met de niet-dominante hand in een "hoofd-en-voorwaartse positie" om drainage in de longen te voorkomen en maag bij inademing. Deze precieze aangrijping van muizen kan worden geleerd, maar is niet gemakkelijk en vereist praktijk en vaardigheid om te resulteren in effectieve CNS opname. Bovendien is het proces lang getekend, waarbij ongeveer 45 min nodig is voor de toediening van een totaal volume van ~ 20-30 μL oplossing in de druppel volumes van 1-2 μL per inhalatie, met 3-4 min rustperioden tussen elke inhalatie. Het doel van deze studie is om een muis positionerings apparaat te onthullen dat de juiste plaatsing van muizen mogelijk maakt voor een efficiënte toediening van de peptide-siRNA-formulering. Meerdere functies zijn opgenomen in het ontwerp van het apparaat, zoals vier of acht positionerings stoelen met instelbare hoogte en Tilt om verdoofd muizen in de Head Down-and-forward positie te rebelasten, waardoor een eenvoudige visualisatie van de Nares van de muizen en een ingebouwde verwarmingspad om de lichaams temperaturen van de muizen tijdens de procedure te behouden. Belangrijk is dat de mogelijkheid om vier of acht muizen tegelijkertijd met RVG9R-siRNA-complexen te behandelen op deze manier studies mogelijk maakt op een veel snellere tijdschaal, voor het testen van een IN therapeutische siRNA-aanpak. Tot slot, dit apparaat zorgt voor passende en gecontroleerde muis hoofd positionering voor IN de toepassing van RVG9R-siRNA en andere therapeutische moleculen, zoals nanodeeltjes of antilichamen, voor de levering van CNS.
Introduction
De BBB voorkomt dat systemisch toegediende moleculen van > 400-600 da de hersenen binnendringen, wat een belangrijke uitdaging is voor de afgifte van therapeutische biomoleules voor ziekten die het CZS en Brain1beïnvloeden. Directe geneesmiddelafgifte aan de hersenen kan worden bereikt door stereotactische injectie; echter, dit vereist chirurgische expertise en is sterk beperkt in de levering aan gebieden proximale op de injectieplaats, waardoor het ongeschikt voor routine klinisch gebruik2. IN de levering aan de hersenen kan ook resulteren in directe levering van de hersenen door het omzeilen van de BBB, waardoor voor de directe en snelle overdracht van een verscheidenheid van stoffen naar de hersenen3,4. Deze overdracht wordt verondersteld te gebeuren door transport mechanismen via de olfactorische en trigeminus zenuwen die de nasale passage verbinden met de hersenen, de cerebrospinale vloeistof, en de lymfatische systemen5. Omdat de directe neus-naar-hersen route geen perifere organen en weefsels omvat, vermindert het de systemische bijwerkingen aanzienlijk en verbetert het de potentie. IN de administratie is een veelbelovende niet-invasieve alternatief voor zowel lokale en systemische routes voor de levering van de hersenen van therapeutische middelen en kan een krachtige aanpak voor de bestrijding van neurologische aandoeningen, met inbegrip van de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, en hersenkanker, en wordt onderzocht in verschillende klinische proeven6,7,8.
Verschillende experimentele factoren, zoals volume en methode van inoculatie, evenals formulering pH, sterk invloed op de levering van geneesmiddelen aan het CZS via de neus-naar-hersenen traject9. In studies met muizen, het succes van IN de levering van geneesmiddelen sterk afhangt van de juiste hoofd positionering, die essentieel is voor efficiënte hersen afzetting en om te voorkomen dat de afvoer van de drug in de externe omgeving of de luchtwegen. Met name, de meerderheid van de knaagdieren studies gebruik maken van een Head-Back positie (supine) met een 70 °-90 ° Tilt voor de levering van geneesmiddelen aan de olfactorische epitheel, hoewel hoofd positionering op 0 ° kan gunst drainage in de luchtpijp9. BIJ de levering van geneesmiddelen in muizen die wakker zijn resulteert in verminderde hersen depositie in vergelijking met elke toepassing in de liggende positie, vooral als gevolg van wetenschappers onvermogen om muizen te houden in de gewenste positie voor langere tijd. Bovendien, de ondersteboven positie vereist door de skin grip methode gebruikt voor wakker muizen resulteert in drug afzetting voornamelijk in de trigeminuszenuw en de olfactorische gloeilamp, evenals perifere organen, zoals nieren en longen, binnen 30 min postinoculatie10. De meest geschikte lichaamspositie voor de levering van therapeutische middelen via de olfactorische of trigeminus zenuwen bij grotere dieren zoals niet-humane primaten in klinische studies lijkt de kop-en-voorwaartse positie te zijn (d.w.z. de zogenaamde "bidden tot Mekka positie ")11. Echter, deze positie is niet goed bestudeerd in het muismodel, en de rugpositie wordt meer gebruikt in knaagdieren studies.
Eerder, we hebben aangetoond dat de RVG9R, een peptide ontworpen op basis van de minimale receptor bindende domein van de rabiësvirus, toont tropisme aan cellen uitdrukken van nicotine acetylcholine receptor subeenheden zoals neuronen en macrofagen en bemiddelt de intracellulaire afgifte van siRNA door een mechanisme waarbij receptor betrokkenheid en tijdelijke plasma membraan delocalisatie op de site van receptor aggregatie12,13. Belangrijk is dat de systemische intraveneuze toediening van RVG9R-siRNA-complexen de transvasculaire afgifte van siRNA in het CZS14mogelijk maakt. De systemische route verdunt echter de hoeveelheid siRNA die aan het CZS wordt afgeleverd, en uit recente gegevens blijkt dat de toediening van RVG9R: siRNA-complexen aan muizen die zich in de kop-en-voorwaartse positie bevinden, een breed gespreide doel-gen knockdown uitlokken in meerdere regio's van de hersenen15. Belangrijk is dat dit niveau van knockdown werd bereikt met slechts 13,5 μg siRNA toegediend over een vierdosis, 2 dagen regime, terwijl de I.V.-route een ~ 5 maal hogere dosis per injectie vereist om een vergelijkbare knockdown te bereiken. De enige tekortkoming van de aanpak is dat het een moeizame procedure is, waarbij het gebruik van beide handen tijdens de toediening van de oplossing vereist is, terwijl de muizen continu worden vastgegript in het hoofd naar beneden en naar voren en in ontspannen posities tussen elke inhalatie voor een aanzienlijke lange behandelingsperiode (een 30-45 min procedure voor de effectieve opname van een ~ 20-30 μL volume per muis). Het gebruik van de hier gepresenteerde muis positionerings inrichting maakt de juiste plaatsing van muizen met weinig fysieke dwang mogelijk voor de dieren en het personeel dat het protocol uitvoert, evenals voor de behandeling van meerdere cohorten van muizen binnen een redelijke periode, het inschakelen van een diepgaand onderzoek naar het gebruik van Sirna's als therapeutische behandeling voor encefalitis in de westelijke Nijl bij muizen in de late stadia van de ziekte15.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en protocollen die zijn goedgekeurd door het Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Hanyang-Universiteit. In dit protocol werden 6 weken oude Balb/c muizen met een gewicht van 20-25 g gebruikt (n = 3 per groep). De dieren werden ondergebracht in een pathogeen-vrije faciliteit met 12 uur licht/donker cycli op een gecontroleerde temperatuur-en vochtigheidsgraad met gratis toegang tot water en voedsel.
1. montage van het apparaat
- Monteer de afzonderlijke delen van de positionerings inrichting zoals weergegeven in Figuur 1a.
Opmerking: het apparaat wordt geleverd in afzonderlijke onderdelen die eenvoudig kunnen worden geassembleerd en gedemonteerd.
2. material Setup
Opmerking: bij de toediening van vloeibaar gemaakte geneesmiddelen moeten de volgende voorbereidende stappen worden uitgevoerd.
- Bereid de benodigde materialen voor, waaronder de positionerings inrichting, een micro Pipet van 10 μL, micro pipetpunten van 10 μL, een behandelingsoplossing (bijv. RVG9R-siRNA-complex), een timer klok en 70% ethanol (Zie Figuur 2a).
- Sluit de voedings code aan om het verwarmingssysteem van het apparaat ten minste 15-20 minuten vóór het experiment in te schakelen. De optimale temperatuur voor dierproeven wordt automatisch gehandhaafd bij ~ 37 °C.
- Bereid de anesthesie ketamine: xylazine: fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met een verhouding van 1:0,5:8,5 en verdoving elke muis met een enkele intraperitoneale (i.p.) injectie in een eindvolume van 200 μL per 20 g muis.
Opmerking: Houd er rekening mee dat een geoptimaliseerde drug voor het waarborgen van de anesthesie voorwaarde voor een periode van 30-45 min kan worden gebruikt.
3. muis positionering
- Evalueer het niveau van anesthesie met pedaal reflex (stevige teen pinch) om het chirurgische vlak te behouden.
- Plaats het positionerings apparaat op een geschikte afstand en hoogte, zodat u gemakkelijk toegang hebt tot alle vereiste reagentia.
- Zodra de muizen goed verdoven zijn, til je elke muis voorzichtig door de Scruff van hun nek met duim en wijzer vinger en plaats je deze op de aangewezen stoel.
- De juiste positionering van de muis op de stoel is in dit stadium erg belangrijk. Leg de muis terug parallel aan de rugsteun van de stoel en op 90 ° naar de stoelzitting. Til de handen van de muis en laat het dier op natuurlijke wijze in de kop naar beneden en naar voren liggen, zonder te duwen of te drukken, zoals afgebeeld in Figuur 2b. Zorg dat de voorpoten van de muis natuurlijke ondersteuning bieden terwijl het dier zich in deze ontspannen positie bevindt, zonder ongemak voor de muis.
- Zodra de muizen goed gepositioneerd zijn, riem de muizen met de stoelriem en start onmiddellijk de inoculatie.
4. intranasale levering
Opmerking: dit protocol beschrijft de IN levering van RVG9R: siRNA-complexen met behulp van het muis positionerings apparaat. Met behulp van dit protocol kan maximaal 20-30 μL oplossing gemakkelijk aan elke muis worden toegediend in druppels van 2 μL. Dit volume is lager dan die van de neusholte van de muis, dat is 0,032 cm3, dus de procedure leidt niet tot dodelijke neusgat obstructie of verstikking. Dit protocol maakt gelijktijdige inoculatie mogelijk van ten minste vier muizen en maximaal acht muizen per apparaat, wat resulteert in tijd optimalisatie en verminderde variabiliteit.
- Neem de 10 μL micro pipet en stel deze in op 2 μL.
- Laad de micro pipet met 2 μL RVG9R: siRNA-complexe oplossing (bijv. 5,2 μg siCy5, aangevuld met 104 μg RVG9R voor het afleverings experiment, en 13,5 μg siSOD1 die zijn gecomplementeerd met 270 μg RVG9R voor het uitschakelings experiment, in een laatste volume van 25 μL PBS dat 5% glucose.
- Terwijl u de pipet in de dominante hand houdt, past u de positie aan door een elleboog op het tafelblad te plaatsen. Ondersteun de hand die de pipet vasthoudt met de andere hand om ongecontroleerde bewegingen te voorkomen tijdens het toedienen.
- Plaats een ~ 2 μL druppel zeer dicht bij één neusgat zodat de muis de druppel direct kan inademen (Zie Figuur 2b). Als een kleine druppel niet gemakkelijk wordt gevormd, vervangt u de pipetpunt door een nieuwe en herhaalt u de bewerking. Gebruik de stopwatch om het tijdsinterval tussen inoculaties te controleren.
- Dit apparaat maakt het mogelijk om ten minste vier muizen tegelijk te behandelen. Als een andere groep muizen is vereist om de stap 4,4 te herhalen, stelt u een andere balk in met vier stoelen boven of onder de eerste staaf met vier stoelen voor maximaal acht muizen tegelijk op het apparaat.
- Herhaal stap 4,4 met het andere neusgat na 3-4 min van de eerste inoculatie. Dit tijdsinterval is voldoende voor de muis om de inhalatie van de eerste dosis te voltooien en de normale ademhaling te herstellen. Als een druppel van de geïnhaleerde oplossing wordt loskomen als gevolg van het accidenteel uitsnuiten van de naris van de muis, reoculeren een extra 2 μL oplossing.
- Herhaal het hele proces met alternatieve neusgaten totdat de dosis van 20-30 μL is voltooid. Het duurt ~ 30-45 min om de volledige inoculatie procedure te voltooien.
- Leg natte zalf op de ogen van de muizen voordat u de muizen terugstuurt naar hun aangewezen kooien.
Opmerking: laat de muizen niet onbeheerd achter totdat ze voldoende bewustzijn hebben gekregen om borstbeen recumbency te handhaven.
5. gegevensanalyse
- Om de hersen afzetting van fluor-gelabelde RVG9R te bevestigen, anesthetiseer de muizen (zoals beschreven in stap 2,3) en Isoleer de hersenen, evenals andere perifere organen, zoals Long, lever, milt en nieren. Plaats elk orgaan op de Imagestatie en visualiseer fluorescentie met behulp van Imagestatie.
- Om fluorescentie te visualiseren als gevolg van het Cy5-label, bereiden 20 μm dikke cryosecties, samen met Hoechst 33342, en het uitvoeren van Full-Brain scanning met een confocale Microscoop.
- Om gen-uitschakeling te beoordelen, extract RNA uit verschillende hersengebieden, zoals de olfactorische gloeilamp, de cortex, de hippocampus, de thalamus, de hypothalamus, het cerebellum en de hersenstam, met een RNA reinigingskit, omgekeerd getranscribeerd in cDNA met behulp van een cDNA synthese Kit, en voer qPCR met primer paren zoals eerder beschreven15.
Representative Results
Hoofdpositie tijdens IN de administratie is een grote invloed op de efficiëntie van de levering van geneesmiddelen aan de hersenen. Hier beschrijven we de Head Down-and-forward positie met behulp van een muis positionerings apparaat voor de toediening van een Brain-targeting peptide-siRNA formulering voor de levering van het mengsel aan het CNS van de muis. Om de levering via de in route te controleren, gebruikten we de RVG9R peptide, eerder getoond om efficiënt te binden aan neuronale cellen zowel in vitro als in vivo14,16.
We testten voor het eerst neus-naar-hersenen levering van de RVG9R peptide gelabeld met Alexa Fluor 488 (RVG9R-A488) met behulp van de muis positionerings apparaat beschreven hier. Een t 48 h postinoculatie, verschillende organen, met inbegrip van de hersenen, de sinus, longen, de lever, de milt, en de nieren werden uitgesneden voor het meten van weefsel-geassocieerde een488 fluorescentie. Een488 alleen, of een controle PEPTIDE (RVM9R-a488)14 die niet binden nachr, werden gebruikt als negatieve controles. Zoals verwacht, werden noch een488 noch RVM9R-A488 gedetecteerd in een van de organen bij 48 h postinoculatie (Figuur 3a, links). Aan de andere kant werd een sterk fluorescerende A488 -signaal uitsluitend gedetecteerd in de hersenen van de RVG9R-inocculeerde groep. Bovendien, we vergeleken deze positie van de plaatsing van de muis naar de rugligging positie methode die eerder is gebruikt17, evenals de wakker methode, voor werkzaamheid. We hebben een vast bedrag van RVG9R-A488 (100 μg) en geassageerde biodistributie op 48 h postinoculatie geïnocculeerd. De resultaten gaven aan dat de positionering van de muizen hoofd naar beneden-en-vooruit verbeterd de penetrantie en depositie van RVG9R-A488 door het hersenweefsel (Figuur 3a, rechts). In tegenstelling tot de dieren geënt in een liggende positie resulteerde in de levering van RVG9R-A488 aan de hersenen, maar niet zo sterk als gezien met de positionering apparaat methode. Om de levering van siRNA aan de hersenen verder te bevestigen, hebben we Full-Brain Scanning uitgevoerd na een enkelvoudige toediening van RVG9R gecomplexed naar 400 pmol (5,2 μg) Cy5-gelabeld siRNA. In tegenstelling tot PBS of RVM9R resulteerde complexering met RVG9R in een sterke accumulatie van siRNA in belangrijke hersengebieden, waaronder de olfactorische gloeilamp, de cortex, de hippocampus, de thalamus, de hypothalamus, de midbrain en het cerebellum (Figuur 3b ).
Ten slotte hebben we RT-qPCR-analyse gebruikt om de intracellulaire afgifte van functionele siRNA gericht op het superoxide dismutase-1 (SOD1)-gen te controleren. Muizen werden gedurende 3 maal op opeenvolgende dagen geïnocculeerd met RVG9R: siSOD1 (13,2 μg siRNA) en de SOD1 mRNA-uitdrukking werd 24 uur na de laatste inoculatie geanalyseerd. RVG9R: siSOD1 administratie resulteerde in een substantiële reductie van de SOD1 expressie in de olfactorische lamp (63%), de cortex (47%), de Hippocampus (61%), de thalamus (53%), de hypothalamus (55%), de veroorzaakt (39%), en het cerebellum (30%) (Figuur 4). Tot slot maakt het gebruik van een positionerings apparaat een eenvoudige inoculatie van RVG9R-gecomplexeerde siRNA bij muizen mogelijk, wat resulteert in een hersen specifieke levering van siRNA die functionele uitschakeling van het doel gen induceert.
Figuur 1 : Fotografische presentatie van de montage van het apparaat. De positionerings stoelen worden op de juiste hoogte met schroeven op de standaard gemonteerd. Na de montage is het apparaat aangesloten op een voeding voor het verwarmen van de fysiologische temperatuur tijdens de inoculatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Fotografische presentatie van de in-inoculatie procedure met behulp van de positionerings inrichting. A) experimentele apparatuur die nodig is voor de inoculatie. B) de dieren in de hoofdpositie omlaag en naar voren op het apparaat (links) en de afzetting van een druppel van 2 μL bij inoculatie (rechts). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Distributie van fluorescently gelabelde peptide en siRNA na toediening. A) biodistributie van ontranasaal geënt RVG9R peptide bij 48 h na een enkelvoudige inoculatie. De hersenen en andere perifere organen werden geëvalueerd op de aanwezigheid van fluorescentie bij muizen geënt met zoutoplossing (PBS), een488, rvm-a488en rvg-a488 (links). Beeldvorming van de muizen behandeld zoals hierboven vermeld terwijl ze wakker, in rugligging, en in de muis positionering bedenken in de kop naar beneden-en-voorwaartse positie (rechts). B) biodistributie van de RVG9R: siRNA-complex in de hersenen (n = 3 per groep). De verdeling van Cy5-gelabelde siRNA werd gevisualiseerd in volledige hersen cryosecties met een confocale laser Microscoop bij dieren geënt met zoutoplossing (PBS), siRNA-gecomplexeerd met controle peptide (RVM9R-siCy5), of de Brain-targeting peptide RVG9R (RVG9R-siCy5). De schaalbalk vertegenwoordigt 1 mm. afkortingen: o. b = olfactorische gloeilamp; CTX = cortex; Hippo = Hippocampus; hypo = hypothalamus; Tha = thalamus; m. b = midbrain; CER = cerebellum. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : In toepassing van RVG9R: siSOD1 induceert doel gen-uitschakeling in meerdere hersengebieden. qPCR-analyse voor Murine SOD1 mRNA in aangegeven hersengebieden 24 h na de laatste IN inoculatie van zoutoplossing (PBS), RVG9R: siCD4 (siCD4), RVM9R: siSOD1 (RVM9R) en RVG9R: siSOD1 (RVG9R). De relatieve SOD1 uitschakeling in de olfactorische gloeilamp, de cortex, de Hippocampus (Upper), de thalamus, de hypothalamus, het cerebellum (midden) en de veroorzaakt (Lower) wordt getoond. Gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD ten opzichte van GAPDH na normalisatie met de corresponderende gegevens van met zout behandelde muizen (n = 3 per groep). De cartoon die het percentage van SOD1 mRNA in de aangegeven hersenregio weergeeft na de inoculatie wordt getoond (rechtsonder). * *P < 0,01, * ** p < 0,001. Afkortingen: o. b = olfactorische gloeilamp; CTX = cortex; Hippo = Hippocampus; hypo = Hippocampus; Tha = thalamus; m. b = midbrain; CER = cerebellum. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
We hebben een muis positionerings apparaat ontwikkeld voor het optimaal positioneren van muizen voor de neus-tot-hersen afgifte van Therapeutics. Het apparaat is uitgerust met verschillende functionaliteiten, wat zorgt voor een eenvoudige gelijktijdige omgang met dieren. Het is ook uitgerust met verwarmings pads voor het onderhoud van de fysiologische lichaamstemperatuur van de dieren tijdens experimenten. De verdoofd muizen kunnen worden gehandhaafd in de kop-en-voorwaartse positie door middel van speciaal ontworpen stoelen, met een minimaal ongemak voor de dieren. De hoogte van de positionerings stoelen kan op zodanige wijze worden afgesteld dat het het beste is om dierlijke neusgaten te visualiseren tijdens het toedienen van drugs.
IN de hersenen levering heeft verschillende intrinsieke beperkingen, met inbegrip van het kleine oppervlak van neusgaten (waardoor maximaal volume van 20-30 μL per toediening), nasale irritatie, epitheel schade, en beperkte absorptie over het neus epitheel18. De toediening van geneesmiddelen aan muizen die in rugligging worden geplaatst, is gebruikt voor de levering van de hersenen door vloeibare geneesmiddelen in de alternatieve Nares van de dieren te laten vallen via een pipet of polyurethaan slang (24 G x 19 mm) verbonden met microliter spuiten19, 20. Hoewel het gebruik van slangen systemen om geneesmiddelen in de buurt van het olfactorische epitheel vrij te geven een potentieel geschikte aanpak is, veroorzaakt het irritatie of nasale ontstekingen bij herhaalde toediening. Bovendien beperkt de kleine grootte van de neusholte deze aanpak, vooral in muizen die kunnen worden overwonnen door te herhalen, evenals door medicijn formuleringen die aanhouden in het neusslijmvlies. Een andere optie is de IN toediening van Therapeutics om muizen10wakker te maken. Deze aanpak vereist echter bekwame procedures voor de behandeling van dieren tijdens de inoculatie. Bovendien, het veroorzaakt dierlijke stress en daarom is niet ideaal voor ziekte modellen, met name besmettelijke ziekte modellen. Bovendien kan een inconsistente dosering gemakkelijk voortvloeien uit de drainage van het geneesmiddel in de longen of de maag als gevolg van onvolmaakte dieren aangrijpend. De hier gepresenteerde aanpak stelt wetenschappers in staat om deze technische barrières te overwinnen. De Head Down-and-forward positie vermindert de mogelijkheid van drugs lekkage uit de neus naar de longen tijdens het inademen, begunstiging van directe en selectieve siRNA levering aan de hersenen. BIJ aflevering met behulp van de muis positionerings apparaat vereist geen gespecialiseerde techniek voor het hanteren of aangrijpend van de dieren tijdens de inoculatie. Vier dieren tegelijk kunnen worden behandeld voor een periode van ten minste 30-45 min. De procedure kan worden opgeschaald door het opnemen van een extra vier-Chair Bar, waardoor het eenvoudig beheer van maximaal acht muizen in dezelfde experimentele sessie. Daarom, naar aanleiding van deze methode, een enkele exploitant kan het medicijn leveren aan de hersenen van grote groepen dieren gedurende langere tijd induceren.
De anatomische structuur van de neusholte beïnvloedt de neus-naar-hersen levering sterk (zoals beoordeeld door Merkus et al.11 en Ruigrok en de lange21). Het relatieve oppervlak van de neusholte bij muizen is 15 keer groter dan die van de mens en het relatieve oppervlak van het olfactorische epitheel is 6 keer groter. Hoewel er aanzienlijke verschillen zijn in de anatomie van de neusholte bij mensen aan knaagdieren, zijn er ongeveer 45 klinische proeven aan de gang met behulp van de IN-aanpak voor de behandeling van verschillende hersenaandoeningen (www.clinicaltrials.gov). De hier gepresenteerde studie geeft aan dat bij het gebruik bij de levering van Therapeutics, wetenschappers moeten overwegen verschillende factoren, zoals hoofdpositie, slapen, en juiste levering agenten.
We hebben aangetoond dat de efficiënte en specifieke afzetting van fluorescently gelabeld siRNA aan de muis hersenen. Bovendien is de significante afname in SOD1 genexpressie die na IN siRNA Delivery werd waargenomen, bevestigde functionele effecten. We eerder toonde consequent dat de IN het beheer van RVG9R-siRNA complexen gericht op de West Nile Virus (WNV) RNA oefent een sterk therapeutisch effect op WNV encefalitis15. Met name, neus-naar-hersenen siRNA levering vereist een cel-targeting ligand (RVG) en een positief geladen molecuul (9R) aan complexe siRNA. Bij afwezigheid van deze elementen werden moleculen gecleard via het systemische circuit en lymfevaten 48 h nabehandeling (Figuur 3a)15. Daarom hebben we in de hier beschreven experimentele instelling peptide/siRNA-lokalisatie 48 h na inoculatie onderzocht om alleen de niveaus te behouden die specifiek in de hersenen worden bewaard. Deze aanpak kan gemakkelijk worden uitgevoerd voor de levering van andere moleculen, zoals eiwitten, peptiden en nanodeeltjes, of andere therapieën, voor de behandeling van een aantal hersen gerelateerde aandoeningen.
Disclosures
P.K. en S.K.L. zijn medeoprichters van Signet Biotech. P.K. is coinventor van Patent PCT/US07/12152, dat deels claims met betrekking tot RVG9R omvat. I.E., K.C., P.K., en S.K.L. worden vermeld als couitvinders van een ingediend octrooi (PCT/KR2016/014220), waaronder claims met betrekking tot een muis positionerings apparaat.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het Koreaanse Ministerie van volksgezondheid & welzijn (HI17C1046) tot S.K.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comercial assays | |||
| iScript cDNA synthesis kit | BioRad | Cat# 1708891 | |
| RNAiso plus | TaKaRa Bio | Cat# 9108 | |
| SYBR Premix ExTaq | TaKaRa Bio | Cat# RR420A | |
| Dyes | |||
| Alexa fluor 488 | ThermoFisher | Cat# A30052 | |
| Mouse strain | |||
| Balb/c | Orient Bio | N/A | 6-8 week old, 20-30g |
| Oligonucleotides and primers | |||
| Human CD4 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3’ |
| siSOD1 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’ |
| GAPDH primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’ R: 5’-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3’ |
| SOD1 primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’ |
| Peptides | |||
| RVG9R | Peptron | N/A | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR |
| RVM9R | Peptron | N/A | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR |
| Software, algorithms and devices | |||
| FlowJo software 4.3 | FlowJO, LLC | N/A | http://docs.flowjo.com/vx/ |
| Mouse positioning device | Signet Biotech | N/A | |
| Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
| Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
References
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2, 3-14 (2005).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. Journal of Visualized Experiments. (56), e2968 (2011).
- Khan, A. R., Liu, M., Khan, M. W., Zhai, G. Progress in brain targeting drug delivery system by nasal route. Journal of Controlled Release. 268, 364-389 (2017).
- Meredith, M. E., Salameh, T. S., Banks, W. A. Intranasal delivery of proteins and peptides in the treatment of neurodegenerative diseases. The AAPS Journal. 17, 780-787 (2015).
- Pardeshi, C. V., Belgamwar, V. S. Direct nose to brain drug delivery via integrated nerve pathways bypassing the blood-brain barrier: an excellent platform for brain targeting. Expert Opinion on Drug Delivery. 10, 957-972 (2013).
- Agrawal, M., et al. Nose-to-brain drug delivery: An update on clinical challenges and progress towards approval of anti-Alzheimer drugs. Journal of Controlled Release. 281, 139-177 (2018).
- Van Woensel, M., et al. Formulations for intranasal delivery of pharmacological agents to combat brain disease: a new opportunity to tackle GBM. Cancers. 5, 1020-1048 (2013).
- Kulkarni, A. D., et al. Nanotechnology-mediated nose to brain drug delivery for Parkinson's disease: a mini review. Journal of Drug Targeting. 23, 775-788 (2015).
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 1654-1673 (2010).
- Hanson, L. R., Fine, J. M., Svitak, A. L., Faltesek, K. A. Intranasal administration of CNS therapeutics to awake mice. Journal of Visualized Experiments. (74), e4440 (2013).
- Merkus, P., Ebbens, F. A., Muller, B., Fokkens, W. J. Influence of anatomy and head position on intranasal drug deposition. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology and Head & Neck. 263, 827-832 (2006).
- Zeller, S., et al. Attachment of cell-binding ligands to arginine-rich cell-penetrating peptides enables cytosolic translocation of complexed siRNA. Chemistry & Biology. 22, 50-62 (2015).
- Kim, J., et al. Silencing CCR2 in macrophages alleviates adipose tissue inflammation and the associated metabolic syndrome in dietary obese mice. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 5, (2016).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39 (2007).
- Beloor, J., et al. Small interfering RNA-mediated control of virus replication in the CNS is therapeutic and enables natural immunity to West Nile virus. Cell Host & Microbe. 23, 549-556 (2018).
- Ullah, I., et al. Trileucine residues in a ligand-CPP-based siRNA delivery platform improve endosomal escape of siRNA. Journal of Drug Targeting. 25, 320-329 (2017).
- Yu, D., Li, G., Lesniak, M. S., Balyasnikova, I. V. Intranasal delivery of therapeutic stem cells to glioblastoma in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (124), e55845 (2017).
- Mittal, D., et al. Insights into direct nose to brain delivery: current status and future perspective. Drug Delivery. 21, 75-86 (2014).
- Renner, D. B., Frey, W. H., Hanson, L. R. Intranasal delivery of siRNA to the olfactory bulbs of mice via the olfactory nerve pathway. Neuroscience Letters. 513, 193-197 (2012).
- Serralheiro, A., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Intranasal administration of carbamazepine to mice: a direct delivery pathway for brain targeting. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 60, 32-39 (2014).
- Ruigrok, M. J., de Lange, E. C. Emerging insights for translational pharmacokinetic and pharmacokinetic-pharmacodynamic studies: towards prediction of nose-to-brain transport in humans. The AAPS Journal. 17, 493-505 (2015).
