Summary
Здесь мы представляем протокол с помощью устройства позиционирования мыши, которое позволяет соответствующее размещение мышей для интраназального введения мозга таргетинга пептид-siRNA формулировки, позволяющей эффективное заглушивание гена в центральной нервной системе.
Abstract
Интраназальное (ИН) доставка наркотиков в мозг стала перспективным методом обхода гематоэнцефалического барьера (BBB) для доставки препаратов в центральную нервную систему (ЦНС). Недавние исследования показывают использование пептида, RVG9R, включающего минимальный рецептор-связывающий домен гликопротеина вируса бешенства, в вызывая доставку siRNA в нейроны в мозге. В этом протоколе, пептид-siRNA формулировка поставляется интраназно с пипеткой в доминирующей руке, в то время как анестезирующая мышь сдерживается потертости с недоминирующей стороны в "голова вниз и вперед позиции", чтобы избежать дренажа в легких и желудок при вдыхании. Это точное захват мышей можно узнать, но не легко и требует практики и навыков, чтобы привести к эффективному поглощению ЦНС. Кроме того, процесс является длительным, требующим около 45 мин для введения общего объема в размере 20-30 евро раствора в 1-2 л капельных объемов на вдох, с 3-4 мин периоды отдыха между каждым вдохом. Целью данного исследования является раскрытие устройства позиционирования мыши, которое позволяет соответствующее размещение мышей для эффективного в ней управления пептид-siRNA формулировки. Несколько функций включены в конструкцию устройства, такие как четыре или восемь позиционирующих стульев с регулируемой высотой и наклоном, чтобы сдержать обезображенных мышей в положении вниз и вперед, что позволяет легко визуализировать носы мышей и встроенный грелоприбор для поддержания температуры тела мышей во время процедуры. Важно отметить, что способность лечить четырех или восьми мышей одновременно с комплексами RVG9R-siRNA таким образом позволяет проводить исследования в гораздо более быстром временном масштабе для тестирования подхода IN therapeutic siRNA. В заключение, это устройство позволяет для соответствующего и контролируемого расположения головы мыши для в применении RVG9R-siRNA и других терапевтических молекул, таких как наночастицы или антитела, для доставки ЦНС.
Introduction
BBB предотвращает системно управляемых молекул йgt;400-600 Da от входа в мозг, что создает значительную проблему для доставки терапевтических биомолекул для заболеваний, влияющих на ЦНС и мозг1. Прямая доставка лекарств в мозг может быть достигнута путем стереотаксической инъекции; однако, это требует хирургического опыта и сильно ограничено в доставке в области, проксимальные к месту инъекции, что делает его непригодным для обычного клинического использования2. В доставке в мозг может также привести к прямой доставки мозга, минуя BBB, что позволяет для прямой и быстрой передачи различных веществ в мозг3,4. Эта передача, как полагают, происходят транспортные механизмы через обонятельные и тройничные нервы, которые соединяют носовой проход к мозгу, спинномозговой жидкости, и лимфатической системы5. Поскольку прямой маршрут «нос к мозгу» не включает периферийные органы и ткани, он существенно снижает системные побочные эффекты и улучшает потенцию. В администрации является перспективной неинвазивной альтернативой как местных, так и системных маршрутов для доставки мозга терапевтических агентов и может представлять собой мощный подход к борьбе с неврологическими расстройствами, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, и рак мозга, и в настоящее время изучается в нескольких клинических испытаниях6,7,8.
Некоторые экспериментальные факторы, такие как объем и метод прививки, а также рН формулировки, сильно влияют на доставку препарата в ЦНС через нос к мозгу путь9. В исследованиях с мышами, успех доставки препарата IN сильно зависит от правильного позиционирования головы, что имеет решающее значение для эффективного осаждения мозга и избежать утечки наркотиков во внешнюю среду или дыхательные пути. Примечательно, что большинство исследований грызунов использовать голову назад позиции (супина) с наклоном 70 "-90" для доставки препарата в обонятельный эпителий, даже если голова позиционирования на 0 "может способствовать дренаж в трахеи9. В доставке препаратов у мышей, которые бодрствуют приводит к уменьшению осаждения мозга по сравнению с любым применением в положении на спине, в основном из-за неспособности ученых держать мышей в нужном положении в течение более длительных периодов времени. Кроме того, перевернутое положение, требуемое методом сцепления кожи, используемым для бодрствующих мышей, приводит к осаждению препарата преимущественно в тройничном нерве и обонятельной лампе, а также периферических органах, таких как почки и легкие, в течение 30 минут постинокуляция10. Наиболее подходящим положением тела для доставки терапии через обонятельные или тройничные нервы у крупных животных, таких как нечеловеческие приматы в клинических исследованиях, как представляется, голова вниз и вперед позиции (т.е., так называемые "молитвы в Мекку положение")11. Однако, это положение не было хорошо изучено в модели мыши, и положение на спине более широко используется в исследованиях грызунов.
Ранее мы показали, что RVG9R, пептид, разработанный на основе минимального рецептора связывающей области вируса бешенства, отображает тропизм к клеткам, выражающим никотиновые ацетилхолиновые рецепторы субъединиц, как нейроны и макрофаги и опосредует внутриклеточная доставка siRNA с помощью механизма, включающего вовлеченность рецепторов и временную делокализацию плазменной мембраны в месте агрегации рецепторов12,13. Важно отметить, что системное внутривенное введение комплексов РВГ9Р-сиРНК позволяет транссосудистую доставку сиРНК в ЦНС14. Тем не менее, системный маршрут разбавляет количество siRNA доставлены в ЦНС, и последние данные показывают, что IN администрации RVG9R:siRNA комплексов для мышей, расположенных в голову вниз и вперед позиции вызывает широко распространенный целевой ген нокдаун в несколько областей мозга15. Важно отметить, что этот уровень нокдауна был достигнут всего лишь 13,5 мкг siRNA вводят в течение четырех доз, 2 день режима в то время как IV маршрут требует 5 раз более высокую дозу за инъекцию для достижения сопоставимых нокдаун. Единственным недостатком подхода IN является то, что это трудная процедура, требующая использования обеих рук во время введения раствора, непрерывно сжимая мышей, альтернативно в голову вниз и вперед и в расслабленных позициях между каждое вдыхание в течение значительного длительного периода лечения (процедура 30-45 мин для эффективного поглощения объема 20-30 л на мышь). Использование мыши позиционирования устройство, представленное здесь позволяет надлежащее размещение мышей с небольшим физическим давлением на животных и персонала, выполняющего протокол, а также лечение нескольких когорты мышей в течение разумного периода времени, позволяет углубленное исследование по использованию siRNAs в качестве терапевтического для Западного Нила энцефалита у мышей на поздних стадиях заболевания15.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами и протоколами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и использованию Ханьянского университета. В этом протоколе были использованы 6-недельные мыши Balb/c весом 20-25 г (n - 3 на группу). Эти животные были размещены в возбудителем с 12 ч светлых/темных циклов при контролируемой температуре и влажности с бесплатным доступом к воде и пище.
1. Сборка устройства
- Соберите отдельные части устройства позиционирования, как показано на рисунке 1A.
ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство поставляется в отдельных частях, которые могут быть легко собраны и разобраны.
2. Установка материала
ПРИМЕЧАНИЕ: In администрация сжиженных наркотиков требует следующих предочистных шагов.
- Подготовьте необходимые материалы, в том числе устройство позиционирования, микропипетет мощностью 10 л, микропипетку мощностью 10 л, лечебное решение (например, комплекс RVG9R-siRNA), часы таймер и 70% этанола (см. рисунок 2А).
- Подключите код питания, чтобы включить систему отопления устройства не менее чем за 15-20 минут до начала эксперимента. Оптимальная температура для экспериментов на животных автоматически поддерживается на уровне 37 градусов по Цельсию.
- Подготовьте анестезию кетамина:ксилазин: фосфат-буферированный солен (PBS) в соотношении 1:0.5:8.5 и анестезируйте каждую мышь одной интраперитонеальной (т.п.) инъекцией в конечном объеме 200 мкм на 20 г мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что любой оптимизированный препарат для обеспечения состояния анестезии в течение 30-45 мин может быть использован.
3. Позиционирование мыши
- Оцените уровень анестезии с помощью педали рефлекс (твердый нос щепотку) для поддержания хирургической плоскости.
- Поместите устройство позиционирования на соответствующее расстояние и высоту, чтобы обеспечить удобный доступ ко всем необходимым реагентам.
- После того, как мыши должным образом анестезируется, осторожно поднимите каждую мышь за шиворот с большим и указательным пальцем и поместите его на назначенный стул.
- Правильное позиционирование мыши на стуле очень важно на данном этапе. Положите спину мыши параллельно задней опоры стула, и на 90 "на сиденье стула. Поднимите руки от мыши и пусть животное лежат естественно в голову вниз и вперед позиции, без нажатия или нажатия, как показано на рисунке 2B. Убедитесь, что передние конечности мыши обеспечивают естественную поддержку, в то время как животное находится в этом расслабленном положении, без какого-либо дискомфорта для мыши.
- После того, как мыши правильно расположены, ремень мышей в с поясом стула, и сразу же начать In прививки.
4. Интраназальные поставки
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает IN доставки комплексов RVG9R:siRNA с помощью устройства позиционирования мыши. Используя этот протокол, максимум 20-30 л раствора можно легко вводить каждой мыши в 2 капли. Этот объем ниже, чем у полости носа мыши, которая составляет 0,032 см3,поэтому процедура не приводит к смертельной обструкции ноздрей или удушью. Этот протокол позволяет одновременно прививать по крайней мере четырех мышей и максимум восемь мышей на устройство, что приводит к оптимизации времени и снижению изменчивости.
- Возьмите микропипетку 10 л и отрегулируйте его до 2 кл.
- Загрузите микропипетт с 2 qL rVG9R: siRNA комплексный раствор (например, 5,2 мкг siCy5 комплекс с 104 мкг RVG9R для доставки эксперимента, и 13,5 мкг siSOD1 комплекс с 270 мкг RVG9R для sileS, в окончательном объеме 2LS5 5% глюкозы.
- Держа пипетку в доминирующей руке, отрегулируйте положение, поставив локоть на верхнюю часть скамейки. Поддержка руки, держа пипетку с другой стороны, чтобы избежать неконтролируемых движений во время администрирования.
- Поместите падение на 2 л очень близко к одной ноздре, чтобы мышь может непосредственно вдыхать каплю (отсылайте к рисунку 2B). Если крошечная капля не легко образуется, то замените кончик пипетки на новый и повторите операцию. Используйте стоп-час, чтобы проверить временной интервал между прививками.
- Это устройство позволяет для лечения по крайней мере четырех мышей одновременно. Если другая группа мышей требуется повторить шаг 4.4, установите другой бар с четырьмя стульями выше или ниже первого бара с четырьмя стульями для размещения до восьми мышей одновременно на устройстве.
- Повторите шаг 4.4 с другой ноздрю после 3-4 мин с первой прививки. Этого интервала времени достаточно для мыши, чтобы завершить вдыхание первой дозы и восстановить нормальное дыхание. Если капля вдыхаемого раствора выбита из-за случайного фыркая из мышей, reinoculate дополнительные 2 злификатора раствора.
- Повторите весь процесс с альтернативными ноздрями, пока доза 20-30 Л Л не будет закончена. Для завершения всей процедуры прививки потребуется 30-45 мин.
- Положите влажную мазь на глаза мышей, прежде чем вернуть мышей обратно в назначенные клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте мышей без присмотра, пока они не пришли достаточно сознания для поддержания строгого recumbency.
5. Анализ данных
- Чтобы подтвердить осаждение мозга по маркировке Fluor RVG9R, анестезируйте мышей (как описано в шаге 2.3) и изолировать мозг, а также другие периферийные органы, такие как легкие, печень, селезенка и почки. Поместите каждый орган на ImageStation и визуализировать флуоресценцию с помощью ImageStation.
- Чтобы визуализировать флуоресценцию благодаря этикетке Cy5, приготовьте 20 криосекций толщиной в мкм, окрашенных в Hoechst 33342, и выполняйте полное сканирование мозга с помощью конфокального микроскопа.
- Для оценки замалчивания генов, извлекать РНК из различных областей мозга, таких как обонятельная лампа, кора головного мозга, гиппокампа, таламус, гипоталамус, мозжечок, и ствол мозга, с комплектом очистки РНК, обратной транскрибированной в кДНК с помощью cDNA набор синтеза, и выполнять qPCR с грунтовки пар, как описано ранее15.
Representative Results
Должность руководителя во время введения IN оказывает существенное влияние на эффективность доставки лекарств в мозг. Здесь мы описали голову вниз и вперед положение с помощью мыши позиционирования устройства для IN администрации мозга ориентации пептид-siRNA формулировка для доставки смеси в ЦНС мыши. Для проверки доставки по маршруту IN, мы использовали пептид RVG9R, ранее показанный эффективно связываться с нейрональными клетками как in vitro, так и in vivo14,16.
Мы впервые протестировали нос к мозгу доставки пептида RVG9R помечены Alexa Fluor 488 (RVG9R-A488) с помощью мыши позиционирования устройства, описанного здесь. На 48 ч постинокуляции, различные органы, в том числе мозг, синус, легкие, печень, селезенка, и почки были вырезаны для измерения ткани связанных488 флуоресценции. 488 только, или контрольный пептид (RVM9R-A488)14, который не связывает nAchR, были использованы в качестве отрицательного контроля. Как и ожидалось, ни A488, ни RVM9R-A488 не были обнаружены ни в одном из органов при постинокуляции 48 ч (рисунок3А,слева). С другой стороны, сильный флуоресцентный сигнал A488 был обнаружен исключительно в мозге группы, привитой RVG9R. Кроме того, мы сравнили это положение размещения мыши с методом положения на спине, который был использован ранее17, а также с методом бодрствования, для эффективности. Мы привили фиксированное количество RVG9R-A488 (100 мкг) и прослежали биораспределение на 48 ч постинокуляции. Результаты показали, что позиционирование мышей голову вниз и вперед улучшилось penetrance и осаждения RVG9R-A488 по всей ткани мозга(Рисунок 3A, право). В отличие от этого, животные, привитые в положении на спине, привели к поставке RVG9R-A488 в мозг, но не так сильны, как видно с методом позиционирования устройства. Для дальнейшего подтверждения доставки siRNA в мозг, мы выполнили полное сканирование мозга после одного в администрации RVG9R комплекс до 400 pmol (5,2 мкг) Cy5-маркированных siRNA. В отличие от PBS или RVM9R, комплекс с RVG9R привело к сильному накоплению siRNA в основных областях мозга, в том числе обонятельная лампа, кора, гиппокамп, таламус, гипоталамус, средний мозг, и мозжечок (Рисунок 3B ).
Наконец, мы использовали анализ RT-qPCR для проверки внутриклеточной доставки функциональной siRNA, ориентированной на супероксидный ген дисмутазы-1 (SOD1). Мыши были привиты интраназанически в течение 3 раз в течение нескольких дней подряд с RVG9R:siSOD1 (13,2 мкг siRNA), и выражение SOD1 мРНК был проанализирован 24 ч после последней прививки. RVG9R:siSOD1 администрация привела к значительному сокращению экспрессии SOD1 в обонятельной луковице (63%), коре головного мозга (47%), гиппокампе (61%), таламусе (53%), гипоталамусе (55%), среднем мозге (39%) и мозжечке (30%) (Рисунок 4). В заключение, использование устройства позиционирования позволяет легко IN прививки RVG9R-сложных siRNA у мышей, в результате чего мозг конкретных siRNA доставки вызывая функциональное глушение целевого гена.
Рисунок 1 : Фотопрезентация сборки устройства. Позиционные стулья собираются на стенде на соответствующей высоте с винтами. После сборки устройство подключается к источнику питания для нагрева до физиологической температуры во время прививки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Фотографическая презентация процедуры прививки IN с использованием позиционирующего устройства. (A) Экспериментальное оборудование, необходимое для прививки IN. (B) животные в голове вниз и вперед позиции, сидя на устройстве (слева) и осаждение 2 капли l для прививки (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Распределение флуоресцентно помечены пептид и siRNA после введения IN. (A) Биораспределение интраназатически привитого пептида RVG9R при 48 ч после одной прививки. Мозг и другие периферийные органы были оценены на наличие флуоресценции у мышей, привитых с солевым раствором (PBS), A488, RVM-A488, и RVG-A488 (слева). Изображение мышей, обработанных, как упоминалось выше, пока они бодрствуют, в положении на спине, и в мыши позиционирования разработать в голову вниз и вперед позиции (справа). (B) Биораспределение комплекса RVG9R:siRNA в головном мозге (n 3 в группе). Распределение Cy5-маркированных siRNA было визуализировано в полном криосекциях мозга с конфокальный лазерный микроскоп у животных, привитых с сольником (PBS), siRNA в комплексе с пептидом управления (RVM9R-siCy5), или мозг-пепл ориентации ориентации RVG9R (RVG9R-siCy5). Панель шкалы составляет 1 мм. Аббревиативы: o.b - обонятельная лампа; ctx и кора головного мозга; бегемот и гиппокамп; гипо ипоталамус; tha й таламус; m.b - средний мозг; цер и мозжечок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : В применении RVG9R:siSOD1 индуцирует целевой ген глушитель в нескольких областях мозга. qPCR анализ для murine SOD1 mRNA в указанных областях мозга 24 ч после последней in прививки солевая (PBS), RVG9R:siCD4 (siCD4), RVM9R:siSOD1 (RVM9R), и RVG9R: siSOD1 (RVG9R). Показано относительное глушие SOD1 в обонятельной лукоплее, коре головного мозга, гиппокампе (верхнем), таламусе, гипоталамусе, мозжечке (среднем) и среднем мозге (нижнем). Данные представляют среднее sD по отношению к GAPDH после нормализации с соответствующими данными сольственных мышей (n - 3 на группу). Мультфильм, изображающий процент SOD1 mRNA в указанной области мозга после прививки IN показано (в правом нижнем правом). П. Злт; 0,01,Зп юлт; 0,001. Аббревиаты: o.b - обонятельная лампа; ctx и кора головного мозга; бегемот и гиппокамп; гипо -гиппокамп; tha й таламус; m.b - средний мозг; цер и мозжечок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Мы разработали устройство позиционирования мыши для оптимального позиционирования мышей для переноса терапии от носа к мозгу. Устройство оснащено различными функциональными возможностями, обеспечивая легкое одновременное обращение с животными. Он также оснащен грелкой для поддержания физиологических температур тела животных во время экспериментов. Обезоженных мышей можно поддерживать в голову вниз и вперед позиции с помощью специально разработанных стульев, с минимальным дискомфортом для животных. Высота позиционирования стулья могут быть скорректированы таким образом, как лучше визуализировать ноздри животных при приеме наркотиков.
В доставке мозга имеет несколько внутренних ограничений, в том числе небольшой площади поверхности ноздрей (позволяет максимальные объемы 20-30 л на администрацию), раздражение носа, повреждение эпителия, и ограниченное поглощение через носовой эпителий18. В администрации препаратов для мышей, помещенных в положение на спине был использован для доставки мозга путем сброса жидких препаратов в животных альтернативных nares через пипетку или полиуретановые трубки (24 G х 19 мм), подключенных к микролитровым шприцев19, 20. Хотя использование трубных систем для выпуска лекарств вблизи обонятельного эпителия является потенциально подходящим подходом, это вызывает раздражение или воспаление носа при повторном применении. Кроме того, небольшой размер полости носа ограничивает этот подход, особенно у мышей, которые могут быть преодолены путем повторения, а также лекарственные составы, которые сохраняются в слизистой оболочке носа. Другой вариант является IN администрации терапии бодрствовать мышей10. Однако этот подход требует квалифицированных процедур для обращения с животными во время прививки. Кроме того, он вызывает стресс животных и, следовательно, не идеально подходит для моделей заболеваний, особенно моделей инфекционных заболеваний. Кроме того, непоследовательная дозировка может легко возникнуть в результате дренажа наркотиков в легкие или желудок из-за несовершенства захвата животных. Представленный здесь подход позволяет ученым преодолеть эти технические барьеры. Голова вниз и вперед положение снижает возможность утечки наркотиков из носа в легкие при вдыхании, в пользу прямой и селективной доставки siRNA к мозгу. При доставке с помощью устройства позиционирования мыши не требуется какой-либо специализированной техники для обработки или захвата животных во время прививки. Четыре животных одновременно можно лечить в течение не менее 30-45 мин. Процедура может быть масштабирована путем включения дополнительных четырех стульев бар, что позволяет легко управления до восьми мышей в той же экспериментальной сессии. Таким образом, следуя этому методу, один оператор может вызвать доставку лекарств в мозг больших групп животных в течение длительных периодов времени.
Анатомическая структура носовой полости сильно влияет на родосную носк-мозг (как рассмотрено Merkus et al.11 и Ruigrok и de Lange21). Относительная площадь поверхности полости носа у мышей в 15 раз больше, чем у человека, а относительная площадь поверхности обонятельного эпителия в 6 раз больше. Хотя Существуют значительные различия в анатомии полости носа у людей к грызунам, Есть около 45 клинических испытаний в настоящее время с использованием подхода IN для лечения нескольких расстройств мозга (www.clinicaltrials.gov). Исследование, представленное здесь показывает, что при использовании In доставки терапии, ученые должны учитывать несколько факторов, таких как положение головы, сон, и надлежащие агенты доставки.
Мы показали эффективное и специфическое осаждение флуоресцентно помеченных siRNA к мозгу мыши. Кроме того, значительное снижение экспрессии генов SOD1, наблюдаемое после родов IN siRNA, подтвердило функциональные эффекты. Ранее мы последовательно показали, что IN администрации Комплексов RVG9R-siRNA ориентации вируса Западного Нила (WNV) РНК оказывает сильное терапевтическое воздействие на WNV энцефалит15. Примечательно, что родос к мозгу siRNA доставки требуется ячейки ориентации лиганда (RVG) и положительно заряженных молекул (9R) для сложных siRNA. При отсутствии этих элементов молекулы очищались через системную цепь и лимфатические сосуды 48 ч послеобработки(рисунок 3A)15. Таким образом, в экспериментальной установки, описанной здесь, мы изучили пептид / siRNA локализации 48 ч после прививки к изображению только уровни, сохраненные конкретно в головном мозге. Этот подход может быть легко реализован для доставки других молекул, таких как белки, пептиды и наночастицы, или другие терапевтические, для лечения ряда расстройств, связанных с мозгом.
Disclosures
P.K. и S.K.L. являются соучредителями Signet Biotech. P.K. является коизобретателем патента PCT/US07/12,152, который частично включает в себя претензии, связанные с RVG9R. I.U., K.C., P.K. и S.K.L. перечислены как коизобретатели представленного патента (PCT/KR2016/014220), который включает в себя претензии, связанные с устройством позиционирования мыши.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Министерством здравоохранения и социального обеспечения Кореи (HI17C1046) компании S.K.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comercial assays | |||
| iScript cDNA synthesis kit | BioRad | Cat# 1708891 | |
| RNAiso plus | TaKaRa Bio | Cat# 9108 | |
| SYBR Premix ExTaq | TaKaRa Bio | Cat# RR420A | |
| Dyes | |||
| Alexa fluor 488 | ThermoFisher | Cat# A30052 | |
| Mouse strain | |||
| Balb/c | Orient Bio | N/A | 6-8 week old, 20-30g |
| Oligonucleotides and primers | |||
| Human CD4 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3’ |
| siSOD1 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’ |
| GAPDH primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’ R: 5’-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3’ |
| SOD1 primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’ |
| Peptides | |||
| RVG9R | Peptron | N/A | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR |
| RVM9R | Peptron | N/A | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR |
| Software, algorithms and devices | |||
| FlowJo software 4.3 | FlowJO, LLC | N/A | http://docs.flowjo.com/vx/ |
| Mouse positioning device | Signet Biotech | N/A | |
| Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
| Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
References
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2, 3-14 (2005).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. Journal of Visualized Experiments. (56), e2968 (2011).
- Khan, A. R., Liu, M., Khan, M. W., Zhai, G. Progress in brain targeting drug delivery system by nasal route. Journal of Controlled Release. 268, 364-389 (2017).
- Meredith, M. E., Salameh, T. S., Banks, W. A. Intranasal delivery of proteins and peptides in the treatment of neurodegenerative diseases. The AAPS Journal. 17, 780-787 (2015).
- Pardeshi, C. V., Belgamwar, V. S. Direct nose to brain drug delivery via integrated nerve pathways bypassing the blood-brain barrier: an excellent platform for brain targeting. Expert Opinion on Drug Delivery. 10, 957-972 (2013).
- Agrawal, M., et al. Nose-to-brain drug delivery: An update on clinical challenges and progress towards approval of anti-Alzheimer drugs. Journal of Controlled Release. 281, 139-177 (2018).
- Van Woensel, M., et al. Formulations for intranasal delivery of pharmacological agents to combat brain disease: a new opportunity to tackle GBM. Cancers. 5, 1020-1048 (2013).
- Kulkarni, A. D., et al. Nanotechnology-mediated nose to brain drug delivery for Parkinson's disease: a mini review. Journal of Drug Targeting. 23, 775-788 (2015).
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 1654-1673 (2010).
- Hanson, L. R., Fine, J. M., Svitak, A. L., Faltesek, K. A. Intranasal administration of CNS therapeutics to awake mice. Journal of Visualized Experiments. (74), e4440 (2013).
- Merkus, P., Ebbens, F. A., Muller, B., Fokkens, W. J. Influence of anatomy and head position on intranasal drug deposition. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology and Head & Neck. 263, 827-832 (2006).
- Zeller, S., et al. Attachment of cell-binding ligands to arginine-rich cell-penetrating peptides enables cytosolic translocation of complexed siRNA. Chemistry & Biology. 22, 50-62 (2015).
- Kim, J., et al. Silencing CCR2 in macrophages alleviates adipose tissue inflammation and the associated metabolic syndrome in dietary obese mice. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 5, (2016).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39 (2007).
- Beloor, J., et al. Small interfering RNA-mediated control of virus replication in the CNS is therapeutic and enables natural immunity to West Nile virus. Cell Host & Microbe. 23, 549-556 (2018).
- Ullah, I., et al. Trileucine residues in a ligand-CPP-based siRNA delivery platform improve endosomal escape of siRNA. Journal of Drug Targeting. 25, 320-329 (2017).
- Yu, D., Li, G., Lesniak, M. S., Balyasnikova, I. V. Intranasal delivery of therapeutic stem cells to glioblastoma in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (124), e55845 (2017).
- Mittal, D., et al. Insights into direct nose to brain delivery: current status and future perspective. Drug Delivery. 21, 75-86 (2014).
- Renner, D. B., Frey, W. H., Hanson, L. R. Intranasal delivery of siRNA to the olfactory bulbs of mice via the olfactory nerve pathway. Neuroscience Letters. 513, 193-197 (2012).
- Serralheiro, A., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Intranasal administration of carbamazepine to mice: a direct delivery pathway for brain targeting. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 60, 32-39 (2014).
- Ruigrok, M. J., de Lange, E. C. Emerging insights for translational pharmacokinetic and pharmacokinetic-pharmacodynamic studies: towards prediction of nose-to-brain transport in humans. The AAPS Journal. 17, 493-505 (2015).
