Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att optimera CRISPR-Cas9 för att uppnå en högre specificitet utan förlust av på målet aktivitet. Vi använder en riktad evolution strategi kallas Sniper-skärmen för att hitta en mutant Cas9 med de önskade egenskaperna. Sniper-Cas9 är kompatibel med trunkerade singel-guide RNAs och leverans i ribonukleoprotein format, välkända strategier för att uppnå högre särdrag.
Abstract
Utvecklingen av klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR)-associerad protein 9 (Cas9) till terapeutiska metoder kräver undvikande av dess potentiellt skadliga effekter för off-target. Flera metoder har utformats för att minska sådana effekter. Här presenterar vi en Escherichia coli-baserade riktad evolution metod kallas Sniper-skärmen för att få en Cas9 variant med optimerad specificitet och behålls på målet aktivitet, kallas Sniper-Cas9. Använda Sniper-skärmen, kan positiva och negativa urval utföras samtidigt. Skärmen kan också upprepas med andra singel-guide RNA (sgRNA) sekvenser att berika för sant positiva träffar. Genom att använda CMV-PltetO1 dubbla arrangören för att uttrycka Cas9 varianter, kan prestanda för sammanslagna biblioteket kontrolleras snabbt i däggdjursceller. Metoder för att öka specificiteten av Sniper-Cas9 beskrivs också. Första har användning av trunkerade sgRNAs tidigare visats att öka Cas9 specificitet. Till skillnad från andra konstruerade Cas9s behåller Sniper-Cas9 en vildtyp (WT) verksamhetsnivå på målet när de kombineras med trunkerade sgRNAs. Andra är leveransen av Sniper-Cas9 i en ribonukleoprotein (RNP)-format i stället för en plasmid-format möjligt utan att påverka verksamheten på målet.
Introduction
I detta papper, vi strävar efter att förbättra Cas9 specificitet genom att kombinera olika strategier. Olika metoder för att undvika de off-target effekterna av CRISPR-Cas9 har utvecklats. Trunkerade sgRNAs kan exempelvis användas för att uppnå högre specificitet1. Dessutom kan metoden för Cas9 leverans ändras från en plasmid-format till RNP format skaffa högre specificitet2. Specifik aminosyra rester av den Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) protein har ändrats enligt den rationella design beskrivs tidigare3,4,5. Alternativt, aminosyra rester har ändrats på ett slumpmässigt sätt och varianter av Cas9 med högsta specificiteten identifierades med hjälp av en jäst6 eller en E. coli7,8 screening system.
Men har många grupper rapporterat att Cas9 varianter konstruerad använder design för att försvaga ospecifik samspelet mellan Cas9 och substrat uppvisar låg på målet aktiviteter7,8,9, 10 , 11 , 12. vi utvecklat en E. coli-baserat riktad evolution system, Sniper-skärmen, skärmen slumpmässigt mutagenized Cas9 varianter. En E. coli screening system har fördelar jämfört med en jäst-systemet på grund av snabbare fördubbling tid och högre omvandling effektivitetsvinsterna av E. coli.
Både negativa och positiva urval, baserat på tre olika plasmider och en gen av intresse (GOI) integreras i E. coli genomet, används i Sniper-skärmen. Cas9 varianter uttrycks enligt det CMV-PltetO1 dual-arrangören en låg-kopia nummer plasmid så att kandidaterna identifieras i E. coli kan testas i däggdjursceller utan behov av subkloning. GOI införs i E. coli genomet använder Tn7 transposon systemet. SgRNA plasmiden, som innehåller en temperaturkänsliga ursprunget för replikering, uttrycker en sgRNA inriktning GOI; emellertid är de sgRNA och GOI sekvenser inte perfekt matchade. En perfekt matchade sgRNA target webbplats finns på en tredje plasmid innehållande ccdB -genen, som kodar en dödliga produkt som förgiftar gyras. I detta system bort celler som uttrycker Cas9 varianter med hög off-target aktiviteter eftersom dubbel-strand raster (DSBs) införs i inkompatibla platsen ligger i genomisk DNA. Celler som uttrycker Cas9 varianter med låg på målet aktiviteter tas däremot, även på grund av dödliga ccdB genuttryck. Uttryck nivån Cas9 varianter kan ändras genom att ändra koncentrationen av anhydrotetracycline (ATC), som justerar urval kraft.
Vi resonerade att lokalisera omaka sgRNA målplatsen i genomisk DNA i stället för på en plasmid skulle öka känsligheten hos systemet. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att det finns endast en genomisk webbplats, medan det skulle vara många plasmider, vardera innehållande en målwebbplats, inom en enda E. coli cell.
Använda detta system kan identifierat vi en Cas9 variant, Sniper-Cas9, som visar WT-nivån på målet aktiviteter och minskad off-target aktiviteter jämfört med WT Cas9. Sniper-Cas9 kan uppnå ännu högre specificitet nyckeltal med trunkerade sgRNAs eller RNP-baserade leverans i stället för plasmid-baserade leverans.
Protocol
1. integrering av en mänsklig GOI i BW25141 E. coli stam
-
Kloning av Indiens myndigheter
- Polymeras-kedjereaktion (PCR) förstärka en 500 bp längd av en mänsklig GOI innehållande olika kandidat mål platser via standard PCR-metoder med primers som innehåller NotI och XhoI restriktionsenzym platser.
Obs: I detta experiment, GOI var den mänskliga EMX1 -genen. - Smälta både PCR-produkten och pgrg3613 vektorn med NotI och XhoI restriktionsenzym.
- Gel rena önskad fragment (500 bp och 12 kb).
- Ligera fragment tillsammans med T4 ligase. För att göra detta, blanda 50 ng av smält pgrg36 och 6 ng av PCR infoga i en reaktionsvolym av 20 μL innehållande 1 x ligase buffert och 0.5 U ligase enzym. Inkubera över natten i rumstemperatur (RT).
- Omvandla ligated plasmiden till DH5-α behöriga celler. Växer den resulterande transformants på Luria buljong (LB) agarplattor som innehåller ampicillin (100 μg/mL) vid 32 ° C och inkubera över natten. Plocka upp en koloni och växa i LB media som innehåller ampicillin över natten. Isolera plasmiden DNA från den E. coli, använder en kommersiellt tillgänglig miniprep Kit. Bekräfta införandet av Indiens myndigheter fragmentet av Sanger sekvensering plasmiden erhållits från mini plasmid förberedelse (mini prep)13.
- Polymeras-kedjereaktion (PCR) förstärka en 500 bp längd av en mänsklig GOI innehållande olika kandidat mål platser via standard PCR-metoder med primers som innehåller NotI och XhoI restriktionsenzym platser.
-
Beredning av den BW25141 -GOI
- Förvandla den erhållna pgrg36 -GOI plasmiden till den BW25141 E. coli -stammen. Det är viktigt att använda en BW25141 stam för att minimera antalet falskt positiva kolonier.
- Växa de transformerade cellerna i LB bufferten vid 32 ° C över natten. GOI infogas i den BW25141 stammen (BW25141 -GOI) genomisk DNA. Ta bort pgrg36 -GOI plasmiden från BW25141 -GOI stammen med standard pgrg36 protokoll13. Kort, späd en koloni (ca 107-vik) och odla den på en LB skylt vid 42 ° C över natten. Strimma kolonierna på LB plattan och odla dem på 42 ° C över natten.
- Bekräfta rätt GOI införandet av kolonin PCR, använda primers föreslog i protokollet pgrg36: 5'-GATGCTGGTGGCGAAGCTGT-3 'och 5'-GATGACGGTTTGTCACATGGA-3'. Primer förstärker genomisk DNA insticksstället och storleken på den resulterande PCR-produkten kommer vara 904 bp plus storleken på skäret (500 bp i detta fall).
- Förbered electrocompetent BW25141 -GOI celler (ett detaljerat protokoll beskrivs i steg 3.2.6–3.2.10).
2. beredning av Cas9 variant biblioteket
-
Bibliotek förberedelse
- Omvandla den Cas9 vektor7 till en kommersiell E. coli mutator stam (Tabell av material) och följ tillverkarens instruktioner för att få en variant bibliotek (Mutator biblioteket).
- Utföra felbenägen PCR på hela WT Cas9 sekvensen i Cas9 vektorn, använda en felbenägen PCR kit (Tabell för material).
Obs: Låg-felprocenten protokollet antogs i Sniper-Cas9 fall att inte störa den ursprungliga funktionen av protein. - Smälta Cas9 vektorn med lämpliga restriktionsenzym. Gel rena PCR-produkten (från steg 2.1.2) och smält ryggraden.
Obs: Storleken på den SpCas9 genen är ca 4,3 kb. XhoI och KpnI valdes att smälta pBLC-SpCas9 vektor som användes i Sniper-Cas9 fall. - Montera stommen fragmentet (från steg 2.1.3) och infoga förstärks med felbenägna PCR (från steg 2.1.3) via isotermiska i vitro rekombination.
Obs: mer än 500 ng av ryggraden som behövs för att erhålla en hög koncentration av bibliotek (felbenägen PCR [EP]). Två olika felbenägen PCR Kit har använts för att förbereda EP bibliotek i Sniper-Cas9 fall (EP bibliotek I och II). - Rena produkter från församlingen (från steg 2.1.4) använda ett kit av DNA-rening som möjliggör låg volym elution (Tabell för material). Eluera med 6 μL nuclease-fritt vatten (NFW) och mätning av koncentrationen av DNA.
- Omvandla mer än 500 ng av Cas9 bibliotek vektor (för varje tre bibliotek) till 50 μl av electrocompetent E. coli celler (Tabell för material). Se protokollet elektroporation i steg 3.2.1-3.2.4. För detta bibliotek förberedelse, Använd 1 mL SOC medium istället för 250 μl per 50 μL av behöriga celler.
- Gör 1: 100, 1:1, 000 och 1:10,000 utspädningar av blandningen som innehåller återvunna celler med SOC medium. Tallrik utspädda cellerna på 100 mm LB agarplattor kompletteras med kloramfenikol (12,5 μg/mL). Tallrik återstående cellerna på en 245 mm2 tallrik. Inkubera vid 37 ° C över natten.
-
Beräkning av bibliotek komplexitet
- Fotografera utspädning plattorna via en geldokumentationssystem eller en vanlig digital kamera. Kör OpenCFU programvara14 och ladda upp fotografier av utspädning plattorna. Ange räknande området inuti en tallrik och ta bort falska kolonier.
- Manuellt multiplicera antalet kolonier med utspädningsfaktorn att få det ursprungliga antalet transformants. Omvandla siffrorna till logaritmisk form (bas 10). Beräkna medelvärdet för att avgöra komplexiteten i biblioteket.
- När önskad komplexitet värdet erhålls, samla alla kolonierna på 245 mm fyrkantiga plattan (från steg 2.1.7) med en spridare och 20 mL LB kompletteras med kloramfenikol. Inte växa samlade kolonierna och rena plasmid biblioteket med en kommersiell midiprep kit.
Obs: Ju högre bibliotek komplexitet, desto bättre. När Sniper-Cas9 identifierades, uppnåddes en mångfald av 3 x 10-6 för varje bibliotek.
3. positiva och negativa screening för utvecklas Cas9
-
Val av mål och plasmid konstruktion
- Välj en target sgRNA spacer sekvens i GOI. Ersätta en eller två rester i den slumpmässiga nukleotid att producera en omaka sekvens.
Obs: Mänskliga EMX1 målwebbplatsen 3 (GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA med GGG PAM) användes i Sniper-Cas9 fall. Följande är de omaka sekvenser som används: GAGTCCGAGCAGAAagAGAA, GAacCCGAGCAGAAGAAGAA, GAGTCCGAGCAGAgGAAGAA och GAGcCCGAGCAGAAGAAGAA. - Infoga sekvensen inkompatibla (se punkt 3.1.1) in sgRNA plasmiden använder standard oligonukleotiden (oligo) kloning förfaranden7.
- Infoga inte matchar sekvensen med en PAM i slutet 3' i p11-lacY-wtx1 (Tabell för material) för att konstruera ccdB plasmiden använder standard oligo kloning förfaranden15.
- Välj en target sgRNA spacer sekvens i GOI. Ersätta en eller två rester i den slumpmässiga nukleotid att producera en omaka sekvens.
-
Beredning av Sniper-screening E. coli behöriga celler
- Tina BW25141 -GOI electrocompetent celler på is.
- Tillsätt 1 ng varje ccdB plasmiden och sgRNA plasmiden med dubbel missmatchningar in 50 μL av upptinade BW25141 -GOI celler. Försiktigt blanda cellerna genom pipettering och flytta dem till en prechilled 0,1 cm elektroporation kyvetten.
- Förvandla den E. coli med två plasmidsna via elektroporation. Tillsätt 250 μL av SOC medium omedelbart efter elektroporation. Pipettera försiktigt lösningen för att blanda cellerna och medium. Överför blandningen till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
Obs: För maximal effektivitet, in spänningen på 1,80 kV och miljön bör vara mellan 4,8 ms och 5.0 ms. - Återställa de transformerade cellerna och inkubera dem vid 32 ° C för 1 h med milda skakningar.
- Tavla 125 μL av återvunna cellerna på en ampicillin (50 μg/mL) / kanamycin (25 μg/mL) LB agar plåt (kultur tillstånd). Plattan som resterande celler på en ampicillin/kanamycin/arabinos (1,5 mg/mL) LB agarplatta (ccdB-uttrycker tillstånd). Inkubera vid 32 ° C över natten.
- Kontrollera om avsaknad av överlevande kolonier på den ccdB-uttrycker tillstånd plattan. Samla kolonier från kultur skick plattan med en spridare och kultur dem i 250 mL super optimal buljong (SOB) medium kompletteras med 50 μg/mL ampicillin och 25 μg/mL kanamycin vid 32 ° C, med milda skakningar.
- När den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) når 0.4, chill kolven på is. Förbereda prechilled avjoniserat vatten och en prechilled 10% glycerol lösning (sterilisera före användning).
- Centrifugera (vid 4000 x g i 5 minuter vid 4 ° C) cellerna och kasta bort supernatanten. Tillsätt 200 mL prechilled avjoniserat vatten. Att resuspendera cellerna med serologiska pipett 10 mL. Upprepa detta steg 3 x.
- Tvätta cellerna med 50 mL prechilled 10 procentig glycerol. Centrifugera dem som tidigare (vid 4000 x g i 5 minuter vid 4 ° C).
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 300 μL 10% glycerol lösning. Gör 50 μL alikvoter och frysa dem i flytande kväve. Lagra cellerna (Sniper-screening celler) vid-80 ° C.
-
Sniper-screening
- Omvandla Sniper-screening cellerna (från steg 3.2.10) med 100 ng av Cas9 variant plasmidsna från varje bibliotek (från steg 2.2.3.See steg 2.1.1 och 2.1.4). Följ elektroporation stegen som beskrivs i steg 3.2.1–3.2.3.
- Överföra 250 μL av celler till en fräsch 1,5 mL mikrocentrifug rör. Lägga till 250 pg av ATC att göra en slutlig koncentration på 10 ng/mL. Återställa både ATC-innehållande och ATC-gratis celler (se steg 3.2.4 för återhämtning steg).
- Tallrik 25 μL av återvunna ATC-gratis celler på en kloramfenikol/kanamycin LB agar tallrik (icke-selektiva tillstånd). Lägg till ATC till återvunna ATC-innehållande celler att göra en slutlig koncentration på 100 ng/mL på en 245 mm LB skylt. Omedelbart tallrik cellerna på en kloramfenikol/kanamycin/arabinos LB agar tallrik (selektiv tillstånd). Inkubera över natten vid 32 ° C.
Obs: Storleken och antalet LB plattan bestäms av storleken på mångfalden av screening täcker. När det gäller en 100 mm petriskål med 20 mL LB, tillsätt 2 μg av ATC. - Fotografera plattorna. Räkna antalet livskraftiga kolonier med OpenCFU programvara14. (Se steg 2.2.1) Kontrollera att antalet kolonier på icke-selektiva plattan är minst 10 x större än mångfalden av biblioteket för att täcka alla varianter.
- Beräkna överlevnad frekvens enligt följande.
Överlevnad frekvens = antalet kolonier på en selektiv tallrik / (antalet kolonier på en icke-selektiva tallrik x 10) - Poolen kolonierna som överlevde på selektiv plattorna från alla tre bibliotek. Inkubera överlevande kolonierna i 250 mL LB medium kompletteras med 12,5 μg/mL kloramfenikol vid 42 ° C över natten. Isolera avskärmat Cas9 biblioteket DNA med hjälp av ett midiprep-kit.
Obs: Det här steget rensar sgRNA Plasmiden. - Upprepa screeningprocessen från steg 3.3.1–3.3.6 tills överlevnad frekvensen når en platå. Användning 10 ng av valda Cas9 plasmiden för omvandling och 10 ng/mL av ATC under återhämtning. Behålla den ATC-koncentrationen på 100 ng/mL för selektiv villkoret.
-
Blanda och andra screening
- Slumpvis valda poolade varianter med följande DNA-blanda protokollet. PCR förstärka Cas9 skäret i Cas9 plasmiden med åtföljande primers, 150 nukleotider från infoga gränserna. Digest 2 μg av amplifierad PCR-produkt med DNAS jag för 1 min vid 37 ° C.
- Rena fragment 70 – 200 bp i längd med 2% agaros gelelektrofores. PCR förstärka renat fragment. Använda produkten som en mall till PCR förstärka Cas9 skäret med lämplig grundfärg flankerande Cas9. Använd den slutliga PCR-produkten för att konstruera ett Cas9 bibliotek som beskrivs i steg 2.1.4.
- Förbereda nya Sniper-screening celler (se avsnitt 3.2) med en annan avvikande sgRNA plasmid (se steg 3.1.1). Gör om granskningsprocessen (avsnitt 3.2 – 3.3) tills survival rate når en platå. Användning 10 ng av valda Cas9 plasmiden för omvandling och 10 ng/mL ATC under återhämtning. Upprätthålla den ATC-koncentrationen vid 10 ng/mL för selektiv villkoret.
-
Urval av utvecklade Cas9 mutant plasmider
- Efter det sista steget-screening slumpmässigt plocka hundra kolonier från selektiv plattan och kultur dem i som innehåller kloramfenikol LB medium vid 42 ° C över natten.
- Isolera de plasmider som använder ett miniprep förfarande och Sanger-sekvens skären med sekvensering primers inom Cas9.
- Välj de översta tre vanligaste varianterna att testa dem i mänskliga cellinjer.
4. leverans av Cas9 som en RNP med trunkerade sgRNA
-
Val av mål-genen som använder Cas-OFFinder
- Plocka mål platser med Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). Välj vilken PAM lämpliga för den specifika typen av Cas9 och målet genomet (människa, mus, Zebrafiskar, etc.). Fyll i fliken fråga sekvenser , välja den Mismatch nummeroch klicka på knappen Skicka .
- Efter några sekunder, den på målet (med ett matchningsfel antal '0') och off-target platser kommer att visas. I allmänhet välja off-target webbplatser med en till tre mismatches.
-
Beredning av mallen sgRNA
- Beställ crRNA och tracrRNA oligos med följande mall sekvenser, nämligen crRNA sekvens: 5'-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAA-3'; tracrRNA sekvens: 5'-AGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3'. Fyll N20 i sekvensen crRNA med sekvensen mål som erhölls i steg 4.1.2. Att designa trunkerade sgRNAs, ta bort baser från 5' slutet att erhålla N19, N18 eller N17 sgRNA sekvenser.
- Förbered PCR blandningen för förstärkning av sekvensen sgRNA-kodning enligt följande: kombinera 10 μL av 5 x buffert, 0,5 μL crRNA oligo (100 pmol/μL), 0,5 μL tracrRNA oligo (100 pmol/μL), 2,5 μl dNTP (10 mM varje), 0,5 μL av DNA-polymeras , och 36 μL av NFW (tabell material).
- Förstärka mallen med följande villkor, nämligen för den inledande denaturering: 1 min på 98 ° C; för denaturering, glödgning och förlängning: 10 s på 98 ° C, 15 s vid 54 ° C, 20 s vid 72 ° C, för 25 cykler; för den slutliga förlängningen: 5 min vid 72 ° C.
- Analysera 2 μL av mallen amplifierade DNA (från steg 4.2.3) på en 2% agarosgel. Rena mallen med en PCR-rening kit.
Obs: Storleken på mallen DNA är 125 bp.
-
Syntes av sgRNA
- Förbereda sgRNA syntes reaktionsblandningen enligt följande: kombinera 8,5 μl av DNA (från steg 4.2.3), 1 μL av UTP (25 mM), 1 μL av CTP (25 mM), 1 μL av GTP (25 mM), 1 μL av ATP (25 mM), 4,2 μL av MgCl2 (100 mM) , 4,5 μL av T7 RNA-polymeras (50 U/μL), 3 μL 10 x T7 RNA-polymeras buffert, 1,2 μl av pyrophosphatase (0.5 U/μL), 0,75 μL av RNase inhibitor (40 U/μL) och 4,2 μL av NFW.
- Inkubera reaktionsblandningen vid 37 ° C över natten (åtminstone för 10 h). Tillsätt 0,5 μL av DNAS (2 U/μL) till reaktionsblandningen och inkubera vid 37 ° C i 15 – 30 min. rena det sgRNA med en RNA rening kit.
- För att minska toxicitet orsakad av ett medfödda immunsvar som utlöses av det 5'-trifosfat på sgRNA16, avlägsna det 5'-trifosfat från guiden RNAs med kalv intestinal alkaliskt fosfatas (CIP) enligt följande: behandla 10 µg av in vitro- transkriberade RNA med 250 U av CIP för 3 h vid 37 ° C i närvaro av 100 U av RNase inhibitor. Rena de CIP-behandlade sgRNA med en RNA rening kit.
5. WT - och Sniper-Cas9 proteinuttryck och rening
-
Proteinuttryck i E. coli
- Omvandla sällskapsdjur plasmider18 kodning hans-taggade WT - och Sniper-Cas9 till BL21 (DE3) E. coli -stam.
- Inokulera 50 mL LB medium innehållande 50 μg/mL kanamycin med en färsk koloni härbärgerat den pET-Cas9 uttryck plasmid och skaka det över natten (200 rpm) vid 37 ° C (preculture).
- Över 10 mL av övernattning kultur till 500 mL färsk LB medium innehållande 50 μg/mL kanamycin. Inkubera kulturen med skakningar (200 rpm) vid 37 ° C i 2 h.
- Övervaka den OD600 tills kulturen når den mitten av log fasen av tillväxt (OD600 ≈ 0,6 – 0,7).
- Inducerar uttrycket av proteinet WT - eller Sniper-Cas9 med isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, med en slutlig koncentration på 0.25 nM). Inkubera kulturen på 18 ° C över natten.
-
Protein rening
- Skörda cellerna genom centrifugering vid 5 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Återsuspendera pelleten i lyseringsbuffert (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 4 mM Ditiotreitol [DTT], 5 mM benzamidinen, 100 mM phenylmethylsulfonyl fluor [PMSF], pH 8) på 20 mL per gram våtvikt.
- Tillsätt PMSF, DTT och lysozym till en slutlig koncentration av 1 mg/mL varje och inkubera blandningen på is i 30 min.
- Sonikera cellerna på is. Pulse upprepade gånger för 10 s på 200 – 300 W med en 10 s kylning perioden mellan varje puls, för en sammanlagd tid av 20 min.
- Centrifugera det lysate vid 6000 x g under 30 minuter vid 4 ° C.
- Ta bort supernatanten till en färsk röret. Tillsätt 1 mL av hans-Bind agaros harts till 5 mL avmarkerad lysate och skaka försiktigt i 1 h vid 4 ° C.
- Ladda lysate/hans-Bind agaros harts blandningen på en kolumn med ett utjämnat botten utlopp.
- Ta bort nedre locket och samla den kolumn genomströmning.
- Tvätta kolonnen 2 x med tvättlösning (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, pH 8); samla den tvätta fraktionen för analys av sodium dodecyl sulfate-polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE).
- Eluera proteinet 10 x med 1 mL eluering buffert (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 8), samla in prover för SDS-PAGE.
- Koncentrera sig proteinet eluerade WT - eller Sniper-Cas9 använder en 100 kDa kolumnfilter. Lagra proverna i en lösning av 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl och 50% glycerol vid-80 ° C.
6. RNP leverans
-
Transfection och förberedelse av celler för RNP leverans
- Upprätthålla HEK293T celler i Dulbecco's modified örnens medium (DMEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% antibiotika vid 37 ° C med 5% CO2.
- Blanda WT - eller Sniper-Cas9 protein (2 μg) med sgRNA (2 μg) och inkubera i 10 min vid RT att göra RNP komplex.
- Trypsinize och räkna cellerna. Förbered 2 x 104 celler per en reaktion. Tvätta cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och centrifugera. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten med elektroporation buffert.
- Electroporate RNP komplex in i cellerna med hjälp av följande inställningar, nämligen 1 300 V, 30 ms, och en puls. Platta celler på en 48-väl tallrik fylld med 500 μL av DMEM kompletteras med FBS och antibiotika (som beskrivs i steg 6.1.1) direkt efter elektroporation. Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2.
- Isolera den genomiskt DNA med ett gDNA förberedelser kit, 48 h efter transfection.
7. transfection av plasmider kodning Sniper-Cas9 och sgRNA
-
Byggandet av en sgRNA plasmid
- Beställa fram och vända oligos med följande mall sekvenser, nämligen framåt: 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'; omvänd: 5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3'. Ersätta N20 med sekvensen mål som erhölls i steg 4.1.2. Förkorta sekvensen mål till en längd av N19, N18 eller N17 att syntetisera trunkerade sgRNA.
- Glödga båda oligos 1 x T4 DNA-ligase buffert.
- Smälta pRG2 Vectorn med BsaI restriktionsenzym.
- Gel rena smält vektorn (3.300 bp) använder en 0,8% agarosgel.
- Ligera av glödgad oligo och renat fragmentet med T4 ligase vid 37 ° C: mix 50 ng av smält pRG2 och 1 ng av glödgad oligo i en reaktionsvolym av 20 μL. Inkubera vid RT i 15 min.
- Förvandla ligering blandningen till DH5 alfa stammen och växa transformants på LB agarplattor som innehåller ampicillin (100 μg/mL) vid 37 ° C. Bekräfta införandet av oligo i vektorn av standard sekvensering.
-
Transfection av plasmider kodning Sniper-Cas9 och sgRNA
- Upprätthålla HEK293T celler DMEM kompletteras med 10% FBS och 1% antibiotika vid 37 ° C med 5% CO2. Dagen innan transfection, trypsinize och räkna cellerna. När du arbetar på en 48-väl skala, tallrik 1 x 105 celler per brunn i 250 μL av komplett odlingsmedium. Cellerna bör vara 50 – 80% konfluenta på dagen för transfection.
- I 48-väl skala, förbereda 250 ng p3s-Cas9 plasmid och 250 ng av sgRNA plasmid för transfection, använder ett lipid-baserade transfection reagens. Blanda plasmidsna 25 μl serum gratis-MEM.
- Späd 1 μL transfection reagens med 25 μl serum gratis-MEM. Inkubera blandningen på RT för 5 min. kombinera de två blandningarna och inkubera den resulterande lösningen på RT för 20 min till formuläret plasmid-lipofectamine komplex.
- Efter 20 min inkubering, tillsätt 50 μL av en lösning innehållande plasmid-transfection reagens komplexen direkt till varje brunn innehållande celler, och blanda försiktigt genom att vagga plattan fram och tillbaka. Inkubera cellerna vid 37 ° C i en CO2 inkubator för 48-72 h post transfection innan testmetoder för transgenens uttryck.
8. beräkning av ditsatta frekvenser på målet och off-target verksamhet
-
Riktade djupsekvensering för analys av på målet och potentiella off-target platser
- Isolera genomiskt DNA från steg 6.1.5 eller 7.2.4 med en gDNA förberedelser kit. Generera djupsekvensering bibliotek av PCR-amplifiering av gDNA med primers som inriktning på målet och off-target.
- Använda index primers för att namnge varje prov. Parat-end sekvensering använder en nästa generations sekvensering maskin som omfattas av poolade bibliotek.
-
Djupsekvensering analys med Cas-Analyzer
- Analysera djupsekvensering data med hjälp av Cas-Analyzer bedömning verktyg17.
- Välja Fastq filerna under flikarna Läs 1 och Läs 2 (Läs 1 = XX_SXX_L001_R1_001.fastq, Läs 2 = XX_SXX_L001_R2_001.fastq).
- Fyll i fliken Grundläggande Information och fliken Analysparametrar . Klicka på knappen Skicka .
Representative Results
Efter Sniper-skärmen utförs, kan andelen överlevnad kolonier beräknas genom att dividera antalet kolonier på LB plattan som innehåller kloramfenikol, kanamycin, arabinos och ATC (CKAA) av antalet kolonier i den LB skylt som innehåller kloramfenikol och kanamycin endast (CK). Denna andel var oftast mycket låg när Sniper-skärmen utfördes med biblioteken på SpCas9. True-positiva träffar kan berikas genom att upprepa skärmen med överlevande poolen. I denna representant Sniper-skärm, till exempel erhölls en 100% överlevnad efter tredje skärmen (figur 1). Transfections med RNPs eller plasmid-kodade Sniper-Cas9 kan göras för olika mål och det resulterande på målet och off-target aktiviteter mäts av riktade amplikon sekvensering (figur 2). Mest mål, Sniper-Cas9 visar samma nivå på målet aktiviteter och högre specificitet nyckeltal jämfört med de WT Truncated sgRNAs kan också användas för att ytterligare förbättra specificitet (figur 3). Deras användning är dock begränsad till endast några mål, eftersom de resulterar i låg på målet aktiviteter jämfört med fullängds sgRNAs, i de flesta fall. Därför sgRNAs med varierande längder (från 17 - till 20-mers) måste testas och både på målet och off-target verksamhet måste mätas för att optimera specificitet.
Figur 1: representant Sniper-skärmar utförs med olika bibliotek av slumpmässiga Cas9 varianter. Mutator bibliotek, EP jag och EP bibliotek II ange bibliotek görs med hjälp av olika kommersiella kit. Första, andra och sista anger antalet gånger som berikning skärmen var utförs7. Denna siffra har ändrats från Lee et al.7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: på målet och off-target WT-Cas9 eller Sniper-Cas9 verksamhet parat med en 20-mer guide sekvens levereras via plasmid eller RNP. Specificitet nyckeltal bestämdes genom att dividera aktiviteten på målet av off-aktiviteten. Felstaplar visar SEM (n = 3)7. Denna siffra har ändrats från Lee et al.7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: på målet och off-target verksamhet Sniper-Cas9 jämfört med WT-Cas9 erhålls med variabla längder inriktning på FANCF01 och AAVS webbplatser sgRNAs. Specificitet nyckeltal bestämdes genom att dividera ditsatta frekvenser på på målet platser med dem på respektive off-target platser. sgRNAs med en matchad guanin på 5' terminus (GX18 eller GX19) och de med en avvikande guanin (gX17, gX18, gX19 eller gX20) indikeras. Specificitet nyckeltal beräknades inte när den normaliserade på mål verksamheten var < 70%7. Denna siffra har ändrats från Lee et al.7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
För dem som vill undvika besvärliga screening åtgärder inhämta Sniper-Cas9, finns proteinet Sniper-Cas9 och kodning Plasmiden. Använda dessa material, optimala längden på den sgRNA, som tillhandahåller högst specificitet förhållande, bör fastställas. Dessutom rekommenderas leverans av Sniper-Cas9 och sgRNA i RNP format eftersom det oftast resulterar i förhållandet högre specificitet än leverans i en plasmid-format. Till skillnad från Sniper-Cas9 är andra konstruerade Cas9-varianter inte kompatibla med trunkerade sgRNAs6,7 eller leverans i RNP form8 (med undantag för HiFi-Cas9).
För Sniper-skärmen är valet av inkompatibla sekvensen det viktigaste steget. Urval av en omaka sgRNA som associeras med låg klyvning aktivitet mot sekvensen GOI bör undvikas. Om så inte är fallet, Cas9 varianter med en WT specificitet kommer inte klyva E. coli genomisk DNA med inkompatibla målwebbplatsen. Denna effekt kommer att resultera i ett stort antal bakgrund kolonier, äventyrar hela screening förfarande.
Eftersom E. coli har en snabb är fördubbling tid och hög förvandling effektivitet jämfört med jäst, Sniper-skärmen fördelaktiga jämfört med jäst-baserad screeningmetoder. Dessutom Sniper-skärm bör vara mer känsliga än andra E. coli-baserat system där webbplatsen inkompatibla utförs på en plasmid: det finns en kopia av genomisk DNA och därmed endast en kopia av webbplatsen stämmer i vårt system, men ett stort antal plasmider inom en enda E. coli cell.
Särdragen hos andra DNA-endonucleases som inducerar DSBs, såsom SaCas9 eller Cpf1s, kan också förbättras genom att använda Sniper-skärm. Tyvärr, Sniper-skärmen kan inte användas till öka specificiteten av bas redaktörer direkt, eftersom bas redaktörer inte framkalla DSBs i genomisk DNA av E. coli. Som bas redaktörer använder nickase eller döda version av Cas9 i kärnan av deras system, kunde särdragen hos bas redaktörer ökas med hjälp av de träffar som erhållits från Sniper-skärmen.
Disclosures
ToolGen har lämnat in en patentansökan (PCT/KR2017/006212) som täcker Sniper-skärmen (status: pågående, uppfinnare: Jungjoon K. Lee). Jungjoon K. Lee, Joonsun Lee, Minhee Jung och Euihwan Jeong är anställda av ToolGen, Inc.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av bidrag från ministeriet för vetenskap och IKT av Korea (2017M3A9B4061406) och den nationella Research Foundation i Korea (NRF) finansieras av den koreanska regeringen (MSIT) (grant nummer 2017M3A9B4061404 och 2018M3A9H3020844) till Jungjoon K. Lee. Plasmiden kodning pGRG36 var en gåva från Nancy Craig (Addgene plasmid #16666) och p11-LacY-wtx1 var en gåva från Huimin Zhao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | NEB | M0290L | |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher Chemical | BP1760-25 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma Aldrich | 37919 or 94664 | |
| Antibiotic Antimycotic solution | Welgene | LS203-01 | Media component |
| BamHI | Enzynomics | R003L | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | R4408 | |
| Diversify PCR Random Mutagenesis | Clontech | 630703 | Error-prone PCR kit |
| DNA-Shuffling Kit | Jena Bioscience | PP-103 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM001-17 | Culture media |
| Endura Electrocompetent Cells (DUO) | Lucigen | 60242-2 | E. coli electrocompetent cells for library preparation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Welgene | S101-01 | Media component |
| Gene Pulser II | Bio-Rad | E. coli electroporation equipment | |
| GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent | 200550 | Error-prone PCR kit |
| genomic DNA prep kit | GenAll | 106-152 | gDNA-prep kit |
| Glycerol | BioShop | GLY001.1 | |
| GP/MP Cuvette, 0.1cm | Bio-Rad | BR165-2089 | E. coli electroporation equipment |
| HEK293T cell | ATCC | CRL-11268 | Human cell line |
| Kanamycin sulfate | Acros Organics | 450810500 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A3256-25G | |
| LaboPass PCR Purification Kit | Cosmogenetech | CMR0112 | |
| LaboPass Plasmid Mini | Cosmogenetech | CMP0112 | Mini-prep kit |
| LB Agar Miller | Formedium | LMM0202 | |
| LB Broth Miller | Formedium | LMM0102 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621L | Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture |
| Neon Transfection System | Thermo | MPK5000 | RNP Electroporation equipment |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo | MPK1096 | RNP Electroporation equipment |
| NucleoBond Xtra Midi EF | Macherey-Nagel | 740420.50 | Midi-prep kit |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | DNA purification kit that enables low-volume elution |
| Opti-MEM | Gibco | LS31985070 | Transfection media |
| p11-lacY-wtx1 | Addgene | #123945 | |
| pgrg36 | Addgene | #16666 | E. coli mutator strain |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
| Pyrophophatase | NEB | M2403L | |
| Ribonucleotide Solution Set | NEB | N0450L | |
| RNase inhibitor | NEB | M0314L | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251L | |
| Turbo Dnase | Ambion | AM2238 | |
| XbaI | Enzynomics | R013L | |
| XL1-Red Competent Cells | Agilent | 200129 |
References
- Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Chen, J. S., et al. Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy. Nature. 550 (7676), 407-410 (2017).
- Kleinstiver, B. P., et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature. 529 (7587), 490-495 (2016).
- Slaymaker, I. M., et al. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
- Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
- Lee, J. K., et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).
- Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
- Anderson, K. R., et al. CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice. Nature Methods. 15, 512-514 (2018).
- Kim, S., Bae, T., Hwang, J., Kim, J. S. Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides. Genome Biology. 18 (1), 218 (2017).
- Kulcsar, P. I., et al. Crossing enhanced and high fidelity SpCas9 nucleases to optimize specificity and cleavage. Genome Biology. 18 (1), 190 (2017).
- Zhang, D., et al. Perfectly matched 20-nucleotide guide RNA sequences enable robust genome editing using high-fidelity SpCas9 nucleases. Genome Biology. 18 (1), 191 (2017).
- McKenzie, G. J., Craig, N. L. Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event. BMC Microbiology. 6, 39 (2006).
- Geissmann, Q. OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects. PLoS One. 8 (2), e54072 (2013).
- Chen, Z., Zhao, H. A highly sensitive selection method for directed evolution of homing endonucleases. Nucleic Acids Research. 33 (18), e154 (2005).
- Kim, S., et al. CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells. Genome Research. 28 (3), 367-373 (2018).
- Park, J., et al. Cas-Analyzer: an online tool for assessing genome editing results using NGS data. Bioinformatics. 33, 286-288 (2017).
- Studier, F. W., et al. Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes. Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).
