Summary
Modelos de mamíferos in vivo de defectos óseos de tamaño crítico son esenciales para los investigadores estudiando mecanismos de curación y tratamientos ortopédicos. Aquí, presentamos un protocolo para la creación de defectos reproducibles, segmentarias, femorales en ratas estabilizadas con fijación externa.
Abstract
Investigación Ortopédica depende en gran medida de modelos animales para estudiar mecanismos de hueso curativo en vivo , así como investigar las nuevas técnicas de tratamiento. Tamaño crítico defectos segmentarios están cuestionando a tratar clínicamente, y esfuerzos de investigación podrían beneficiarse de un modelo animal pequeño confiable, ambulatorio de un defecto femoral segmentario. En este estudio, presentamos un protocolo quirúrgico optimizado para la creación coherente y reproducible de un defecto crítico diafisaria de 5 mm en un fémur de rata estabilizada con un fixator externo. La ostectomía diafisaria se realizó mediante una plantilla personalizada para colocar 4 bicortically alambres de Kirschner, que fueron estabilizados con un dispositivo de fijador externo adaptado. Una sierra oscilante de hueso fue usado para crear el defecto. Una esponja de colágeno solamente o una esponja de colágeno empapado de rhBMP-2 fue implantada en el defecto, y la curación del hueso fue monitoreada durante 12 semanas con las radiografías. Después de 12 semanas, las ratas fueron sacrificadas, y el análisis histológico se realizó en el control suprimido y tratados fémur. Defectos óseos que contienen esponja de colágeno solamente dio lugar a no sindicalizados, mientras que rhBMP-2 tratamiento produjo la formación de una remodelación de hueso perióstico nuevo y cruel. Fijación recuperada bien después de la implantación y externa de animales tuvo éxito en la estabilización de los defectos femorales durante 12 semanas. Este modelo quirúrgico optimizado podría aplicarse fácilmente para estudiar hueso curativo y probar nuevos biomateriales ortopédicos y terapias regenerativas en vivo.
Introduction
Cirugía ortopédica traumatológica se centra en el tratamiento de una amplia gama de fracturas complejas. Crítica ósea segmentaria diafisaria defectos han demostrado ser difíciles de tratar clínicamente debido a la disminución de la capacidad regenerativa del músculo circundante y periostio, así como la falta de locales angiogénesis1. Técnicas de tratamiento modernos incluyen fijación quirúrgica con injerto óseo, retardada de injerto óseo (Masquelet), transporte óseo, fusión o amputación2,3,4. En la mayoría de los pacientes que tienen función ambulatoria conservada después de su trauma, con extremidades distales funciona bien, salvar la extremidad es claramente un mejor tratamiento opción5. Estos tratamientos de salvamento a menudo requieren efectuadas intervenciones sobre un curso de tratamiento. Algunos autores han sugerido que la fijación externa es superior en comparación con la superficie de fijación interna para estas aplicaciones debido a los daños de la disminución del tejido durante la implantación, disminuida implantada y mayor ajustabilidad postoperatoria de el fijador6. Sin embargo, un ensayo controlado aleatorio prospectivo está actualmente en marcha ayudar a aclarar esta controversia de internos versus fijación externa en las fracturas abiertas graves de la tibia7. Lamentablemente, con cada tratamiento seleccionado, importantes tasas de complicación y falta persistan8,9. Con cualquier método de tratamiento, con respecto a la pérdida ósea segmentaria, el cirujano debe lidiar con segmentarios diafisarias defectos que presentan desafíos importantes. Correcciones de defectos segmentarios deben maximizar la estabilización ósea y mejorar simultáneamente el proceso osteogénico10,11.
Debido a la importancia clínica, sin embargo, el volumen más bajo, de defectos segmentarios diafisarias tamaño crítico, un modelo eficaz y reproducible del animal es necesario para permitir que equipos de investigación avanzar en técnicas de tratamiento y, en definitiva, mejorar los resultados clínicos. Los investigadores deben estudiar en vivo fisiológico mecanismos curativos en un modelo animal mamífero. Aunque tales modelos de fijación externa ya existen12,13,14,15, esperamos proporcionar un método más fiable para no-cooperativas de ahorro y en los animales no tratados, disminución de costos a través de la opción de materiales asequibles fixator y contorno un protocolo quirúrgico simple de fácil aplicación para futuros estudios. El objetivo principal de este protocolo es establecer un modelo confiable y reproducible de un defecto crítico diafisario en ratas. El procedimiento se evaluó mediante la evaluación de la estabilización y el hueso curativo en fémur de rata durante 12 semanas. Los objetivos secundarios incluidos: hacer un modelo asequible como un costo efectivo como sea posible, simplificar el abordaje quirúrgico y estabilización y garantizar la ética de cuidado de los animales. Los autores y el equipo de investigación realizaron experimentos preliminares con una gama de diferentes biomateriales y posibles terapias regenerativas para mejorar la cicatrización en este defecto segmentario.
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Protocol
Las ratas utilizadas en este estudio recibieron el cuidado diario de acuerdo con las pautas de AVMA para la eutanasia de animales: 2013 edición16. El cuidado de Animal institucional y Comité de uso en la Universidad de Wisconsin-Madison evaluaron y aprobaron este protocolo experimental antes de que comenzara el proyecto.
1. los animales
- Utilice las exogámica ratas macho Sprague-Dawley con aproximadamente 350 g de peso.
2. preparación de hueso Morphogenetic Protein-2 (rhBMP-2) empapado esponja andamios
Nota: Preparación del andamio debe ocurrir justo antes de la implantación en el fémur (véase paso 6.14).
- Siga las instrucciones del fabricante para el uso de un kit de injerto de hueso de rhBMP-2 establecido que contiene una esponja de colágeno liofilizado rhBMP-2 y agua estéril para reconstitución17. Mantenimiento de la esterilidad, reconstituir la rhBMP-2 con el agua estéril a una concentración de 1.5 mg/mL.
- Utilizando unas tijeras estériles y una regla estéril, recortar la esponja de colágeno empapadas de rhBMP-2 para remodelar a un 5 x 3 mm x defecto mm 3.
- Utilizando una jeringa, distribuya la solución rhBMP-2 en la esponja de colágeno por lo que se absorbe.
3. preparación del dispositivo de fijación externa personalizada
Nota: Ver figura 1A para la lista más completa de dimensiones.
- Corte aluminio stock de hoja (tipo 6061, 0,088" grueso) a dos piezas (1,4" x 6") utilizando una sierra de calar u otra herramienta apropiada.
- Montar una pieza en la fresadora y, con un 1/8" 90°-punto carburo taladro Molino, corte cuatro surcos de 'V' (0.035" profundo) a lo largo. Dejar la pieza libre de cortes.
- Cortar las placas individuales de 0.3" ancho de las dos piezas (figura 1B). Mida y perfore agujeros para rosca 4-40. Toque la placa con ranuras de 'V' con el hilo de rosca 4-40. Perfore la placa sin ranuras para un taladro de cuerpo tornillo #4.
- Arena de ambas piezas para redondear esquinas y reducir el peso (figura 1).
- Atornillar piezas junto con 4-40, 18-8 acero inoxidable botón tornillos de cabeza hueca (0,25") para que los surcos queden al ras contra la placa normal (figura 1)
4. procedimiento anestesia y analgesia
- Inducir la anestesia mediante la colocación de la rata en cámara de inducción, entrega de 4 L O2/min con 4% de isoflurano.
Atención: Personal de investigación debe evitar la inhalación de gas anestésico y mantener campana adecuada y ventilación en el laboratorio. - Quite la rata de la cámara después de la rata pierde righting reflex, coloque un cono de la nariz y ponga en la dosis de mantenimiento de la anestesia a través de la nariz (O2 caudal a 2-3 L/min y 0.8% isoflurano).
- Colocar la rata en la almohada o bajo la luz de calentamiento para prevenir la hipotermia.
- Prueba el reflejo palpebral o pellizque el dedo para confirmar la adecuada profundidad de la anestesia.
- Aplicar lubricación a los ojos para evitar la desecación de la córnea.
- Entregar una inyección subcutánea de la buprenorfina de liberación prolongada (1 mg/kg) en el tronco/dorso de la rata, lejos el sitio quirúrgico, para proporcionar analgesia durante 3 días después de la cirugía.
5. asepsia preparación y antibióticos preventivos
- Afeitar el área alrededor de hindleg usandode la 13 costilla, el pie, la línea media dorsal y la línea media ventral como márgenes.
- Zona de matorral afeitado utilizando gasa estéril de 2 x 2 con 10% de povidona-yodo seguida por 70% EtOH (4 veces cada uno, alternando).
- Administrar una inyección intramuscular de cefazolina (20 mg/kg) en el cuadriceps operativa.
- Administrar enrofloxacina (0.25 mg/ml) en agua de bebida durante 7 días postoperatoriamente para protección continua de antibióticos.
- Coloque las ratas en alimentos medicados (p. ej., Uniprim) para la duración del estudio para prevenir las infecciones de las vías de pin.
- Aplique ungüento antibiótico doble a la interfaz de la piel-pin una vez diariamente por 3 días postoperatoriamente.
Nota: Evite cualquier pin de fijación externa o apretar aflojar que puede contribuir al desarrollo de una infección.
6. quirúrgico
Nota: Hacer un concertado esfuerzo para mantener un campo estéril y espacio de trabajo y seguir una técnica aséptica a lo largo de la totalidad del caso.
- Extender la pierna depilada a través de paño fenestrado, claro pegajoso y Banco quirúrgica cubierta en toallas estériles para crear un campo estéril.
- Palpe el fémur y use una hoja #15 para crear una incisión anterolateral a través de la piel que va desde la rótula hasta el trocánter mayor en el fémur proximal.
- Con cuidado haga una incisión en la fascia de la pierna lateral a lo largo del septo intermuscular para separar el músculo vasto lateral del cuadriceps anterior de los tendones de la corva posteriorly hasta que quede expuesto el fémur lateral. Preservar la inserción del tendón glúteo abductor en el trocánter mayor.
- Realizar una disección cuidadosa, de circunferencial de tejido blando atraumático y exponer el fémur en su diáfisis media a partir de la superficie lateral. Para ello, utilice una hoja #15 para cortar suavemente el músculo del hueso subyacente, manteniendo la cuchilla paralelo contra el contorno de la superficie del hueso. Utilice un elevador perióstico para levantar el músculo del hueso expuesto se diseca y continuar alrededor del eje femoral hasta 7-10 mm de diáfisis central ha desaparecido de los tejidos blandos en los lados para prepararse para la ostectomía.
Nota: Evitar lesiones para el paquete neurovascular femoral medial. - Inserte cuatro alambres de Kirschner (k) de 1,0 mm: 2 proximal y distal en el fémur perpendicular del fémur lateral, 2 dirigido recto lateral a medial. Asegurarse de que todos los pernos encajen ambas cortezas (bicortical) para una estabilidad adecuada (figura 2A).
- Comience con el perno distal más primero, a nivel del epicóndilo lateral. Plantilla de lugar ras de fémur distal lateral e inserte una punta roscada 1,0 k-wire.
- Manteniendo la posición de la plantilla en el hueso, identificar donde el pin más próximo entrará en el hueso en los agujeros de la plantilla base. Una vez determinada la posición, cuidadosamente haga una incisión paralela a las fibras del tendón del glúteo según sea necesario para crear un pequeño espacio en el tejido para el próximo pin paso minimizando daño yatrogénico al tendón. Perfore un 1,0 mm sin rosca k-alambre en esta brecha, asegurando otra vez que el pin compromete ambas corticales (figura 2B).
- Mantener la posición de la plantilla en contacto con el hueso y perfore dos 1.0 mm roscada k-alambres, uno a cada lado del sitio de defecto futuro. Asegurar el pasador ambas cortezas (figura 2).
- Colocar el fijador externo nivel 1 cm por encima de piel y atornillar firmemente, bloqueo de la barra en su lugar. Clip de las longitudes de perno exceso (Figura 2D).
- Preparar para la ostectomía (creación de defecto) mediante la colocación de un retractor pequeño, curvado alrededor del fémur anterior y posterior para proteger el tejido suave circundante, el músculo y el paquete neurovascular. Utilizando un oscilante sagital ~ 5 mm hoja de sierra, con mucha precaución crear un defecto segmentario de 5 mm a través de la diáfisis media. Aplique una luz, incluso la presión con la sierra para evitar fractura innecesaria (Figura 2E).
- Aplicar pequeñas cantidades de riego (temperatura 0,9% solución salina estéril normal (NS)) según sea necesario durante la creación de defecto para evitar la necrosis térmica del hueso.
- Lave la herida con 10 mL de NS después de crear el defecto.
- Administrar 0,1 mL de un bupivacaína 0.25% con epinefrina (1: 200, 000) a la herida como un analgésico y vasoconstrictor.
- Inserte el andamio (5 x 3 x 3 mm) de la esponja de colágeno o rhBMP-2 había empapado esponja (del paso 2) en el defecto. Cada andamio debe dimensionarse adecuadamente para abarcar la longitud y el volumen del defecto, ayudando a que la esponja permanece en posición.
Nota: en este punto, complejos de mRNA pueden ser preparados e inyectados como se indica en pasos 7.1-7.3 abajo en caso de proyección de imagen de bioluminiscencia. - Cierre del plano muscular utilizando el patrón interrumpido simple con sutura absorbible 4-0. Cerrar la capa de la piel mediante un corriente patrón subcuticular con sutura absorbible 4-0 y cola para cerrar brechas en las clavijas que sobresalen de la piel.
- Quite la rata del cono de nariz, quedan en la almohada y monitorear continuamente hasta que la rata es capaz de mantener siempre una postura erguida. En este punto, colocar en una jaula limpia para recuperarse.
7. preparación de mRNA complejado y proyección de imagen de bioluminiscencia
Nota: Transfección con complejos de mRNA debe realizarse durante la cirugía 1 día antes de la proyección de imagen de la luminescencia. Utilizar técnicas estériles al manipular el mRNA.
- Mezclar 10 μl de la codificación del mRNA para Gaussia luciferasa (stock concentración de 1 μg/μl) con 30 μL del agente transfecting lipídico.
- Permiten los complejos de mRNA de lípidos para formar por incubación durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente. El agente transfecting lipídico condensará las moléculas de mRNA, les estabilización y mejora de la eficiencia de transfección.
Nota: Si los complejos no se utilizan inmediatamente, guárdelos en hielo para un máximo de 1 h. - Con una pipeta μl 20 equipado con puntas de filtradas, inyectar la mitad del volumen de complejos de mRNA a los extremos distales y proximal del defecto, respectivamente.
- Al día siguiente, 3 minutos antes de la proyección de imagen, anestesiar la rata utilizando isoflurano inhalado según se describió anteriormente en el paso 4.1.
- Colocar la rata en un en vivo imágenes cámara equipada con un cono de nariz entrega mantenimiento isoflurano (0.8% de isoflurano, tarifa de entrega de2 O de 2-3 L/min).
- Inyectar coelenterazine resuspendió en solución salina a dosis de 4 mg/kg de peso corporal en la proximidad del defecto.
- Adquirir imágenes de bioluminiscencia con el en vivo imágenes de sistema (IVIS) según las instrucciones18 el fabricante.
8. proyección de imagen de protocolo
- Después de calibrar la máquina radiográfica simple, un sistema de rayos x19, anestesiar utilizando isoflurano inhalado como se describió anteriormente (ver paso 4.1) de rata y la rata en un cono de nariz con isoflurano inhalado (isoflurano de 0,8%, O2 tasa de entrega de 2-3 L/min) de una radiografía de fémur anteroposterior (AP).
- Mientras que la rata es de recumbency esternal, avance de la cirugía trasera adelante, flexión en la cadera y sofocar la articulación. Flexión de la articulación de la Babilla a aproximadamente 90°. La cinta el lado plantar de la pata hacia abajo, cerca de la pared del cuerpo. Posición de la tibia hacia delante del fémur para eliminar la posibilidad de superposición de los huesos. Para proporcionar ligera abducción de la cadera, coloque una esponja translúcida (aproximadamente 15 mm de espesor) en la región de la ingle. Obtener una imagen (cráneo caudal) antero-posterior del fémur.
- Repita este vistas radiográficas de fémur AP inmediatamente después de la cirugía, 4 semanas y 12 semanas. Utilice cinta adhesiva y gasa para posicionar adecuadamente la extremidad del animal por la calidad y la proyección de imagen consistente.
- Retire el cono de nariz de la rata y monitorear continuamente hasta que la rata es capaz de mantener siempre una postura erguida. A continuación, vuelva a colocar la jaula.
9. procedimiento histológica
- Eutanasia ratas en una cámara con inhalado CO2 según la AVMA estándares éticos16.
- Después de eutanasia, afeitarse la trasera, quitar la piel de la parte dispositiva de la extremidad y desarticular el fémur en la cadera. Retire con cuidado todo el tejido suave del fémur operativo (incluyendo todos los músculos, tendones y ligamentos). Dejar solamente una capa delgada de músculo que rodea el sitio de defecto para proteger la región curación de daños involuntarios durante la disección.
- Colocar el fémur en 10% neutro tamponado con formalina a temperatura ambiente durante 3-4 días para permitir la fijación. Mantener un formol 15:1 cociente del volumen del tejido. Cambiar la solución una vez a medio camino a través del proceso de fijación.
- Descalcificar el fémur en una solución de pH 6,5 (EDTA) ácido de 15% etilendiaminotetracético durante 3-4 semanas. Recoger las radiografías de serie para determinar el punto final de descalcificación.
- Atraviesan el fémur longitudinalmente con un corte de anterior a posterior en el plano sagital. Presentar tejido para inclusión en parafina estándar y hematoxilina y eosina (H & E) tinción.
- Enviar diapositivas H & E a un patólogo para la evaluación histológica.
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Representative Results
Las cirugías se realizaron en aproximadamente una hora por un cirujano con la ayuda de un asistente. Después de optimización quirúrgica, intra - y las complicaciones postoperatorias se redujeron considerablemente y usan del aparato de plantilla asegurado tamaño constante (5 x 3 x 3 mm) y la localización de los defectos femorales. Las ratas fueron ambulatoria recuperación inmediatamente después de la anestesia y no aparece que cualquier patrón de comportamiento alterado; su marcha no era antálgico, y no parecen ser perturbados por el fixator externo.
Kirschner roscado no fueron elegidos para el perno más proximal (figura 2B), como el perno proximal tenía el mayor riesgo de ruptura cuando se utilizaron cables roscados. En algunos casos, particularmente en el control de animales sin rhBMP-2 o andamios cuyos defectos no demostraron ninguna evidencia de formación de cicatrización ósea, uno o más consejos de k-wire se rompieron después de aproximadamente 8 semanas como se ve en la esponja sólo controlan de radiografía de fémur suprimido ( Figura 3).
Se analizaron las radiografías y la histología (tinción H & E) para evaluar los niveles de la curación del hueso. Defectos de control negativo que contiene solamente una esponja de colágeno no demostrada ninguna evidencia de tender un puente sobre osteogénesis entre los bordes proximal y distal del hueso (figura 3, figura 4). Una pequeña cantidad de remodelación de hueso nuevo puede verse directamente adyacente a la arista de corte fémur; el defecto muestra la falta de material óseo, la presencia de cartílago y algún hematoma residual (figura 4). Defectos que contenga rhBMP-2 empapado esponja demostrado importante hueso curativo tan pronto como 4 semanas después de la cirugía, como lo demuestra el puente cruel radiopaco a través del defecto en la figura 3. Por 12 semanas, deposición mineral nuevo significativa (figura 4, NB: hueso nuevo, PC: perióstica cruel) ha formado a lo largo del defecto. Importante nuevo hueso perióstico se aprecia en la insensible que se extiende desde el borde de corte del fémur y espículas de hueso laminar y tejido han desarrollado a lo largo del defecto. Cartílago no es visto (figura 4).
Histología (tinción H & E) también fue realizada para un control no infectado y un ejemplo de un fémur infectado (figura 5). El fémur infectado se agranda significativamente, mostrando signos de una reacción endóstica infiltrando la corteza del hueso. Las flechas indican las áreas de la resorción osteoclasta-mediada del hueso patológico. La corteza no infectada de fémur queda compacto y con una corteza laminar claramente delineada. Dosificación de antibióticos se ha optimizado para incluir cobertura máxima después de la operación. Mientras que la infección alrededor del sitio del defecto puede ocurrir, continua administración de antibióticos por vía tópica en pin sitios y en el agua y la dieta tuvo éxito en reducir al mínimo la infección postoperatoria.
Además la proyección de imagen con sistema de proyección de imagen In Vivo (IVIS) ilustra la capacidad de las células bioluminiscentes para visualizarse dentro del defecto después de la implantación de un fijador externo (figura 6). La placa externa puede ser fácilmente quitada para la proyección de imagen y reemplazada al finalizar. Las células en la cavidad medular luminiscencia después de transfección con complejado ARNm codificando para Gaussia luciferase. El nivel de luminiscencia se centra en el sitio del defecto femoral y la señal no esté obstruida por los pasadores del dispositivo de fijación. Esto es prometedora para futuros estudios confiando en bioluminiscencia o fluorescencia para medir cambios biológicos como una expresión de gen o proteína durante el proceso de curación.
Figura 1: Fabricación de fixator externo. A: esquema de CAD del fixator externo montado con dimensiones anotadas para la fabricación adecuada. Cada fijador se compone de dos placas de aluminio por dos tornillos. B: las placas se cortan de 1,4 "x 6" hojas de aluminio con ranuras en 'V' cortadas en la hoja inferior. C: se perforan agujeros en las placas (roscadas en la placa con ranuras 'V') y todos los bordes y esquinas se lija para ronda y reducir el peso. D: fijador externo montado está apretado con los tornillos (4-40 x 0,25", 18-8 acero inoxidable botón cabezal) una vez que los pernos estén en su lugar en las ranuras de la 'V' en los interiores de las placas de aluminio. El pin izquierdo es sin rosca y más proximal de fémur. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema de colocación de perno, colocación de fijador y defecto creación. A: el perno distal (1,0 mm roscada k-wire) se coloca en la región metafisial de epicóndilo utilizando la plantilla (rectángulo azul) para guiar la inserción del perno adecuado. La plantilla se coloca sobre la superficie femoral anterolateral. B: se coloca el perno proximal (1,0 mm sin rosca k-wire) utilizando la plantilla después de hacer una pequeña incisión en el tendón del glúteo. C: los pernos de mediados (1.0 mm roscada k-wire) se insertan siguiendo la plantilla. D: se retira la plantilla y las 2 placas se unen a los pernos usando los 2 tornillos para fijar las placas. Las placas se aprietan 1 cm sobre el nivel de la piel para evitar la presión sobre la piel. E: una sierra sagital oscilante se utiliza para crear un defecto de 5 mm entre las dos clavijas de mediados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Representante de radiografías de alta resolución muestran hueso cura con tratamiento de rhBMP-2. Imágenes de la esponja de colágeno de control negativo y los grupos de la esponja empapada de rhBMP-2 se muestran en 0, 4 y 12 semanas después de la operación. El grupo de tratamiento de rhBMP-2 exhibe una cura significativa después de 4 semanas con insensible que abarca el defecto. Los extremos del fémur control negativo no sanan con puentes de hueso y el defecto sigue siendo una viciosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Significativa nueva formación del hueso se ve con tratamiento de rhBMP-2. Representante 4 x magnificado H & E imágenes histológicas para la esponja de colágeno de control negativo y la rhBMP-2 empapado esponja grupos tanto en el borde de corte del fémur y en el defecto. Nuevo hueso formado alrededor del borde de fémur control, pero extensiones significativas de hueso trabecular así como el proyecto callos perióstico de fémur tratado. Ningún material óseo se ve en el defecto de control, mientras que la formación de hueso significativa puede observarse a lo largo del defecto Tratado de rhBMP-2. Nota: nuevo hueso fémur F: C: cartílago, H: hemorragia, PC: perióstica cruel. Barra de escala: 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Infectado fémur presenta hipertrofia y marcadores de célula inflamatoria. H & E imágenes histológicas de un fémur no infectado en comparación con un fémur infectado, a la vista y con 4 aumentos de localizaciones en caja. La corteza femoral no infectada permanece organizado y delineado, con pocas señales de inflamación. El fémur infectado aumenta grandemente, como se ve a plena vista, y la corteza está dividida por áreas de resorción y necrosis (racimos de célula púrpura indicadas mediante flechas negras). F: fémur. Barra de escala: 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Señal de luciferase Gaussia detectada en el defecto. Luminiscencia de células transfectadas con luciferasa Gaussia que mRNA es reflejada con IVIS después del retiro de la placa externa. Rojo indica que la mayor intensidad de luminiscencia en el sitio del defecto femoral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Pequeños modelos animales de lesiones ortopédicas como fracturas de huesos completa permiten investigación que explora los mecanismos de osteogénesis y evaluar el potencial terapéutico de biomateriales20. Este estudio presenta una rata defecto segmentario modelo estabilizado por un fijador externo personalizado que un equipo de laboratorio e ingeniería biomédica puede reproducir fácilmente para otros estudios de carga osteosíntesis reparación de hueso.
Estudios previos con defectos de tamaño crítico en modelos de rata comúnmente dependen de la osteosíntesis placas21,22,23,24. Aunque cualquier método de fijación es clínicamente aceptable, fijación externa tiene las ventajas de provocar menos trastornos de tejidos blandos y pérdida de sangre, disminuyendo la superficie implantada total para minimizar posibilidades de colonización bacteriana, y permitiendo ajustabilidad postoperatoria y efectuado intervenciones quirúrgicas6. Modelos de fractura animal de fijación externa anteriores han utilizado materiales diferentes de la placa, pin de sujeción o hueso corte métodos12,13,14. Porque el fijador externo en este protocolo se realizó en el taller del laboratorio con bajo costo de aluminio y puede ser fácilmente restaurado, se redujeron los gastos. Esto proporciona que un fixator externo económico permite a los investigadores a realizar experimentos con varios grupos de animales sin estar limitado económicamente. En comparación con un modelo de fijación interna, creemos que este sistema es técnicamente más simple y más reproducible en un modelo animal pequeño. En nuestra experiencia con estos modelos, fijación interna es mucho más exigente técnicamente y puede requerir implantes mecanizados personalizados. Al conocimiento authors', este protocolo general es único en su uso de una plantilla de diseño personalizado combinado con un diseño de fijador externo metálico adaptado15, así como el uso de un hueso oscilante Sierra para mejor representar el escenario clínico común de Desmontaje perióstica realizadas para preparar sitios de fractura para la fijación. Una nota final sobre el uso de una sierra oscilante en este modelo es que el calor generado y la interrupción perióstica que ocurre un elemento final de control en la formación de un modelo de no Unión. Nuestra experiencia ha sido que con otros métodos, en estos modelos animales, los investigadores corren el riesgo de los controles de sanidad.
Para asegurar el éxito quirúrgico, se debe tener cuidado en varios pasos críticos: cuando la incisión y realizar la disección circunferencial para exponer el fémur de los músculos, evitar inquietante el ciático nervio caudalmente, los vasos femorales medial, y el tendón del glúteo proximal. Tenga cuidado de colocar la URL de aparato de plantilla y al ras contra el piso, cara anterolateral del fémur para que todos los pines son exactamente perpendiculares al hueso. Esto confirma la alineación apropiada del fijador externo y reducir la probabilidad de rotura del perno. El orden de colocación de perno encontró más sencillo es distal en primer lugar, seguido por proximal y luego ambos medio de pernos. Esto permitió menos disrupción del tendón del glúteo por el perno proximal. Por último, es importante que cada clavija se coloca bicortically, penetrar ambas cortezas para que no lo hace salir el hueso o cambiar de puesto en la cavidad medular.
Una máquina de rayos x capaz de radiografía de alta resolución fue utilizada para supervisar el estado de cicatrización ósea como cambios cualitativos pueden visualizarse fácilmente y no invasiva en el tiempo. Sin embargo, piernas consistente es crucial para la interpretación radiográfica como diferencias en el posicionamiento pueden ser engañosas. Los resultados de este estudio están de acuerdo con trabajos previos que demuestran que un defecto femoral 5 mm previene la cicatrización espontánea del hueso en ratas normales25. Por lo tanto, cualquier sanación es observado con terapias agregadas como empapado de la rhBMP-2 esponja puede ser atribuida definitivamente al respectivo tratamiento (figura 3).
Posibles problemas de esta técnica incluyen perno rotura, aflojamiento e infección. Problemas con la rotura del perno proximal en la prueba preliminar provocó un cambio desde k-alambre roscado a sin rosca. Pernos de rosca no son mecánicamente más fuertes pero también presentan más riesgo de copia de seguridad de la corteza. Particularmente en defectos óseos vacía, Kirschner podría romperse o ser desplazados alrededor de las 8 semanas debido a la carga de perno cíclica prolongada y la falta de sanación (semejantemente a ciclismo/dobla un clip). Un estricto régimen de antibiótico fue utilizado para incluir una inyección de cefazolin inmediata, aplicación diaria de un ungüento antibiótico en el sitio de incisión, 7 días de enrofloxacina añadido al agua potable y un pienso medicado. Este protocolo de antibióticos, junto con las mencionados anteriormente, las técnicas quirúrgicas adecuadas reduce al mínimo la infección (figura 5).
Una de las ventajas adicionales del uso de fijación externa en un modelo animal es fácil remoción para una vista sin obstáculos del defecto y recambio después de la proyección de imagen. Esto permite más eficaz en vivo confiando en fluorescencia o luminiscencia para evaluar los cambios como la expresión del gen o proteína de técnicas de imagen. Por ejemplo, hemos demostrado que las células en la cavidad medular transfectadas con complejado ARNm codificando para Gaussia luciferase podrían ser visualizadas con IVIS. La figura 6 ilustra que capacidad de detección de la señal de luminiscencia no es obstruida por este método de fijación externa como puede ser con placas internas, tornillos, o clavos intramedulares21,22,23 , 24. este protocolo quirúrgico eficaz y reproducible permite la constante creación y estabilización del defecto femoral tamaño crítico que imita el manejo clínico inicial de las fracturas complejas. El establecimiento de un modelo confiable es fundamental para cualquier tratamiento experimental para eventual uso clínico. Nuestro modelo ha demostrado resultados predecibles y cambios conductuales mínimos o molestias en nuestros animales. Este modelo puede utilizarse con una variedad de andamios base de biomaterial en conjunto con las técnicas de imagen utilizadas en este documento para futuros propósitos de prueba aplicadas. Es nuestra esperanza que trabajar con este modelo, los investigadores serán capaces de idear nuevas formas para tratar defectos óseos críticos en pacientes traumatizados. Esto podría ayudar a evitar la morbilidad y coste en largos tratamientos empleados actualmente y posiblemente disminuir el número de amputaciones.
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Disclosures
Los autores no declaran competencia de intereses financieros o beneficios. No ha habido ningún beneficio recibido directa o indirectamente por los autores de este artículo.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por un equipo de NIH Grant 1S10OD023676-01 con apoyo adicional a través de la Universidad de Wisconsin departamentos de Ortopedia y rehabilitación y escuela de medicina y salud pública. Queremos reconocer la UW Carbone cáncer centro apoyo beca P30 CA014520 y uso de su pequeña facilidad la proyección de imagen del Animal, así como la beca de formación de NIH 5T35OD011078-08 apoyo de H. Martin. También agradecemos a Michael y Mary Sue Shannon por su apoyo de la Asociación de regeneración musculoesquelética.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sterile Saline | Baxter | 2F7124 | Used for irrigating wound and rehydration |
| 10% Iodine/Povidone | Carefusion | 1215016 | Used to prep skin |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370094 | Used as fixative |
| 1mm non-threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1003.15 | Sterilized, used for the most proximal pin |
| 1mm threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1005.15 | Sterilized, used for the 3 most distal pin slots |
| 2x2 gauze | Covidien | 4006130 | Sterilized, used to prep skin and absorb blood |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | 4015304 | Used to close muscle and skin layers |
| 4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws | Generic | External fixator assembly | |
| 4200 Cordless Driver | Stryker | OR-S-4200 | Used to drill kirschner wires |
| 4x4 gauze | Covidien | 1219158 | Sterilized, used to absorb blood |
| 70 % Ethanol | Used to prep skin | ||
| Baytril | Bayer Healthcare LLC, Animal health division | 312.10010.3 | Added to water as an antibiotic |
| Cefazolin | Hikma Pharmaceuticals | 8917156 | Pre-op antibiotic |
| CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7205 | Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo |
| Double antibiotic ointment | Johnson & Johnson consumer Inc | 8975432 | Applied to pin sites post-op as wound care |
| Dual Cut Microblade | Stryker | 5400-003-410 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP120-500 | Used to decalcify bone to prep for histology |
| Extended Release Buprenorphine | ZooPharm | Used as 3 day pain relief | |
| Fenestrated drapes | 3M | 1204025 | Used to establish sterile field |
| Handpiece cord for TPS | Stryker | OR-S-5100-4N | Used to create 5mm defect in femur |
| Heating pad | K&H Pet Products | 121239 | Rat body temperature maintenance |
| Hexagonal head screwdriver | Wiha | 263/1/16 " X 50 | External fixator tightening |
| Induction chamber | Generic | Anesthesia for rats | |
| Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2 | Medtronic | 7510200 | Clinically relevant treatment used as positive control |
| Isoflurane | Clipper | 10250 | Anesthesia for rats |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | Bioluminescence imaging modality |
| Jig | Custom | Used to place bicortical pins | |
| Lipofectamine MessengerMAX | Fisher Scientific | LMRNA003 | mRNA complexing agent that enables mRNA delivery |
| Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000)) | APP Pharmaceuticals, LLC | NDC 63323-468-37 | Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction |
| Sterile water | Hospira | 8904653 | Used as solvent for cefazolin powder |
| Titanium external fixator plates | Custom | Prepared in house with scrap titanium and milling machine | |
| Total Performance System (TPS) Console | Stryker | OR-S-5100-1 | Used to create 5mm defect in femur |
| TPS MicroSaggital Saw | Stryker | OR-S-5100-34 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ultrafocus Faxitron with DXA | Faxitron | High resolution radiographic imaging modality | |
| Uniprim rat diet | Envigo | TD.06596 | Medicated rat diet |
| Universal Handswitch for TPS | Stryker | OR-S-5100-9 | Used to create 5mm defect in femur |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | Skin closure |
References
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