Summary
이 프로토콜은 생체 내 및 생체 내 생체 내 방법 모두, 마우스 눈의 혈관 회귀 모델인 히알로이드 혈관을 완전히 시각화하고 특성화하는 방법, 실시간 이미징 및 ex 생체 내 생체 내 생체 내 혈관 조영술을 위한 광학 일관성 단층 촬영 및 안저 플루오레세인 혈관 조영술을 사용하여 설명합니다. 정량 분석을 위한 히알로이드의 격리 및 후속 플랫 마운트.
Abstract
눈에, 배아 히알로이드 혈관은 망막 혈관이 발전할 때 개발 렌즈및 망막및 회귀에 영양을 공급합니다. 히알라이드 혈관의 지속적 또는 실패한 회귀는 지속적인 과소 플라스틱 1 차 유리체 (PHPV)와 같은 질병에서 볼 수 있으며, 방해된 빛 경로 및 시각 기능 장애를 초래합니다. 히알로이드 혈관 회귀의 근본적인 메커니즘을 이해하면 혈관 회귀 과정에 대한 새로운 분자 통찰력과 지속적인 히알로이드 혈관으로 질병을 관리하는 새로운 방법을 얻을 수 있습니다. 여기에서 우리는 광학 일관성 단층 촬영 (OCT) 및 안저 플루오레세인 혈관 조영술 (FFA)를 가진 살아있는 마우스에 있는 화상 진찰 히알로이드를 위한 절차 및 정량 분석을 위한 격리 및 평면 장착 hyaloid ex vivo의 상세한 기술 프로토콜을 기술합니다. 저밀도 지단백 수용체 관련 단백질 5(LRP5) 녹아웃 마우스는 지속적인 히알로이드 혈관의 실험 모델로서, 기술을 설명하기 위해 사용하였다. 함께, 이러한 기술은 지속적인 히알로이드 혈관의 메커니즘에 대한 혈관 회귀 및 연구의 실험 모델로서 히알로이드 혈관의 철저한 평가를 용이하게 할 수 있다.
Introduction
눈의 혈액 공급은 망막과 주변 안구 조직의 정상적인 발달을 보장하고 적절한 시각 기능을 갖추는 데 필수적입니다. 눈에는 망막 혈관, 코로이드 및 히알로이드 혈관의 일시적인 배아 순환 네트워크의 세 가지 혈관 침대가 있습니다. 안구 혈관의 발달은 배아 발생 및 조직 성숙을 통해 공간적 및 시간적 조정을 필요로 합니다. 3개의 혈관 침대 중, 히알로이드 혈관 구조는 새로 형성된 배아 렌즈 및 발달 망막에 영양과 산소를 공급하는 첫번째 기능성 혈액 공급 시스템입니다. 히알로이드 혈관은 망막 혈관구조가 발달하고 성숙하는 동시에 회귀1. 히알라이드 혈관 구조의 회귀는 시각 기능의 발달을위한 명확한 시각적 경로를 허용하는 중추적 인; 따라서, 이 혈관 회귀 과정은 망막 혈관구조의 성장만큼 중요합니다. 히알로이드 회귀가 손상되어 안과 질환으로 이어질 수 있습니다. 더욱이, 히알로이드 혈관의 회귀는 다른 기관의 혈관신생 조절에 영향을 미칠 수 있는 혈관 회귀의 조절에 관여하는 세포 및 분자 메커니즘을 조사하는 모델 시스템을 제공한다.
히알로이드 동맥 (HA)에서 파생 된 히알로이드 혈관 구조는 바사 히알로 아이디어 프로피아 (VHP), 튜니카 혈관로사 렌티스 (TVL), 및 동공 막 (PM)으로 구성됩니다. 그것은 발달 망막에 영양을 제공합니다, 기본 유리체, 배아개발 동안 렌즈 2. HA에서 발생하는 VHP는 유리체를 통해 렌즈에 전방으로 분기합니다. TVL은 렌즈 캡슐의 후방 표면을 컵, 그리고 PM에 해부학, 이는 렌즈의 전방 표면을 덮고, 전방 섬모 동맥에 연결2,3,PM에 혈관의 네트워크의 형성의 결과 3개 , 4개 , 5. 흥미롭게도, 히알로이드 혈관 구조에는 정맥이 없으며, 시스템은 정맥 배수를 달성하기 위해 경피 정맥을 사용합니다.
인간 배아에서, 히알로이드 혈관 구조는 임신의 대략 9 주에 거의 완료되고 첫번째 망막 혈관이 나타날 때, 임신 2의 4달 도중 회귀하기 시작합니다. VHP의 위축으로 시작하여, TVL의 모세관 네트워크의 회귀, PM, 마지막으로, HA는 이후에2,3. 한편, 1차 유리체 후퇴 및 이차 유리체는 콜라겐 섬유를 포함하는 세포외 매트릭스 성분으로 구성된 형성되기 시작한다. 임신 6개월이 되면, 1차 유리체는 시신경 디스크에서 렌즈로 이어지는 작은 투명 운하로 감소되며, 클로케의 운하 또는 히알로이드 운하라고 불리며, 이차 유리체는 후방 세그먼트의 주성분이 됩니다. 2개 , 3. 히알로이드 순환은 출생 직전 인 임신 35 주에서36 주까지 주로 사라집니다 3.
히알로이드 혈관 구조가 출생 시 완전히 회귀되는 인간과 달리 마우스 히알로이드 혈관 시스템은 출생 후 퇴보하기 시작합니다. 마우스 망막이 태어난 혈관과 망막 혈관이 산후적으로 발달함에 따라, 히알로이드 혈관은 산후 일 (P) 4에서 동시에 회귀하고 대부분 P21 6에 의해 완전히 회귀됩니다 (그림 1). PM은 P10과 P12 사이에서 먼저 사라지고, VHP는 P12와 P16 사이에서 사라지고, 소수의 TVL 및 HA 세포는 P16에서도 남아 있고, P21에 의해히알로이드 혈관 시스템 회귀는 거의 완료된다 6. 그 동안, 망막 혈관은 출생 후에 발달하기 시작합니다. 혈관 신경총의 표면 층은 P7-P8에서 말초 망막으로 완전히 확장되며, 깊은 층 (외부 플렉시폼 층에 위치)은 P7-P12에서 발생하며, 마지막으로 내부 플렉시폼 층의 중간 신경총은 P12와 P15 7 사이에서 발생합니다. . 망막 혈관구조가 발달함에 따라 히알로이드 혈관을 회귀시키는 기능을 점차 대체하여 발달하는 눈에 영양과 산소를 제공합니다. 마우스에서 히알로이드 혈관 회귀의 출생 후 발생은 히알로이드 혈관을 관찰하고 연구할 수 있는 쉽게 접근할 수 있는 실험 모델을 제공하며, 생리학적 및 생리적 및 병리학 적 조건8.
히알로이드 회귀의 실패는 PHPV와 같은 질병에서 볼 수 있는데, 이는 배아, 1차 유리체 및 히알로이드 혈관구조의 실패 또는 불완전한 회귀로 인한눈의 드문 선천성 발달 변칙이다 9. 히알로이드 혈관 구조의 회귀 과정을 조절하는 메커니즘은 복잡하고 광범위하게 연구됩니다. 히알로이드 혈관의 정상적인 회귀에 필수적인 하나의 주요 분자 경로는 Wnt 신호 통로10이며,이 경로에서 의 유전 적 돌연변이가 Wnt 리간드 및 수용체 모두에 영향을 미치는 인간9에서PHPV와 연결되었기 때문이다. 실험 연구는 Wnt 리간드를 확인, Wnt7b, 이는이 회귀 과정을 중재하기 위해 개발 눈에서 히알로이드 혈관 주위 의 대식세포에 의해 생성되는. Wnt7b는 인접한 내피 세포에서 수용체 곱슬곱슬4(FZD4)/LRP5와 결합하여 Wnt 신호를 활성화시켜 세포 세포 사멸을 개시하고, 히알로이드혈관(10)의회귀로 이어집니다. 그 결과, Wnt7b-결핍마우스는 히알로이드혈관(10)의지속성을 나타낸다. 유사하게, 비전통적인 Wnt 리간드, 노린(Ndp 유전자에 의해 인코딩됨)은 또한 개발 중에 히알로이드 혈관 회귀를 유도하기 위해 FZD4/LRP5에 결합한다. Ndpy/-- Lrp5-/-및 Fzd4-/- 마우스 는 모두 히알로이드 혈관 회귀를 연기하고 Wnt 신호11,12의중요한 규제 역할을 지원합니다. 13,14,15,16. 더욱이, 또 다른 Wnt 코수용체 LRP6는 히알로이드 혈관 내피 세포에서 Wnt 신호 화 경로를 조절하는그들의 기능에서 LRP5와 겹친다(17). 또한 히알로이드 회귀에 기여할 수 있는 그밖 요인은 저산소증 유도인자18,19,혈관 내피 성장 인자20,21,교원질-1822, 23,Arf24,혈관포이에틴-225,및 골 형태유전학 단백질-426. 이 논문에서는 Lrp5-/- 마우스를 지속적인 히알로이드 혈관의 모델로 사용하여 생체 내 및 생체 내 방법 모두를 통해 히알로이드 혈관을 평가하고 특성화하는 기술을 입증합니다.
생체 내 히알로이드 혈관 구조의 시각화와 생체 내 생체 내 생체 내 혈관 구조는 히알라로이드 혈관 회귀의 메커니즘을 연구하는 데 필수적입니다. 현재 히알라이드 혈관구조를 관찰하는 방법은 주로 OCT 및 FFA 이미지, 눈 단면 및 히알로이드 플랫 마운트를 통해 VHP 및 HA를 시각화하고 분석하는 데 중점을 둡니다. OCT와 FFA는 생체 내 이미징 도구에서 강력하여 눈을 뜨고 살아있는 동물의 세로 관찰을 허용합니다. 더욱이, 분리된 히알로이드 플랫 마운트는 전체 히알로이드 혈관구조의 시각화및 혈관 수의 정확한 정량화를 달성하는 수단을 제공한다. 그러나 히알로이드 용기의 섬세하고 깨지기 쉬운 특성과 그 고립의 결과로 인한 기술적 어려움은 다소 눈 연구에서 그 사용을 제한 했을 수 있습니다10,17,27. 이 논문에서는, 우리는 이러한 기술의 타당성을 향상시키기 위해 생체 내 살아있는 망막 이미징 및 ex 생체 외 분리 히알로이드 플랫 마운트를 모두 결합하여 히알로이드 혈관의 시각화에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 살아있는 안저스 및 OCT 이미징(28)의 생체 내 방법 및 분리된 히알로이드 플랫마운트(11)의생체내 방법에 대한 이전 간행물들로부터의 수정 및 확장에 적응되었다.
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Protocol
모든 동물은 국립보건원의 지침에 따라 안과 및 동물 실험에 대한 시력 연구에 대한 비전 및 안과학 연구 협회 (ARVO) 성명서에 따라 치료되었습니다. NIH) 보스턴 아동 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 규정 된 실험 절차 및 규정에 대한 동물의 관리 및 사용에 관한. LRP5-/- 마우스 (재고 번호 005823; 잭슨 연구소) 및 그것의 야생 형 (WT) 제어 C57BL/6J 마우스 (재고 번호 000664; 잭슨 연구소)는 이 연구에 사용되었다.
1. 파트 I: 설치류 망막 이미징 시스템을 사용하여 히알로이드 혈관의 생체 내 이미징
- 마우스 마취 및 동공 팽창의 준비
- 마우스를 선택합니다.
- 망막 화상 진찰을 위해 P12 (그들의 눈을 연 후에) 보다는 더 오래된 마우스를 사용하십시오; 남녀 모두 적합합니다.
- 원하는 대로, 성인기에 걸쳐 지연 된 히알로이드 회귀 (및 그들의 WT 제어)를 가진 이미지 돌연변이 마우스. 3주 이상 된 WT 마우스는 검출 가능한 잔류 히알로이드 혈관을 많이 나타내지 않을 수 있으므로 P12-P21은 가시적인 WT 히알로이드잔류영상을 위한 이상적인 것이다.
- 마취를 위해 케타민 /자일라진 혼합물을 준비하십시오.
- 케타민 스톡 용액 2.3 mL (100 mg / mL) 및 자일라진 스톡 용액 0.7 mL (20 mg / mL)을 취하고 멸균 식염수 20 mL (0.9 % 염화 나트륨)을 추가하여 케타민 / 자일라진 혼합물 (10 mg / mLl 및 0ml)의 작동 용액을 만듭니다.
- 마우스의 체중의 8배의 부피로 케타민/자일라진 혼합물을 신강 내 주사하여 마우스를 마취(예: 20g 마우스는 케타민/자일라진 작용액 혼합물 160 μL을 필요로 함) 케타민의 작동 용량을 달성하기 위해 [80 mg/kg 의 체중] 및 자일라진 [4.8 mg/kg 체중] 혼합물).
- 각 눈에 동공 팽창 약물 용액 한 방울을 바르고(재료 표참조) 마취 직후 마우스의 동공을 팽창시다.
- 페달 반사 (단단한 뒷다리 발가락 핀치)로 마취 수준을 평가하십시오. 마우스가 충분히 마취될 때까지 기다립니다(페달 반사 없음) 동공이 넓게 확장될 때까지 기다립니다.
- 마우스를 선택합니다.
- 히알로이드 혈관의 광학 일관성 단층 촬영 영상
- 인공 눈물로 마우스의 각막을 수분을 공급한 다음 마우스를 위치 단계 위에 놓습니다.
- OCT 프로브의 렌즈로 마우스의 각막에 부드럽게 접촉하십시오. 시신경 헤드가 안저 이미지의 시야 중앙에 있도록 마우스와 프로브를 조정하여 OCT 이미징을 안내합니다.
참고 : 설치류 망막 이미징 시스템의 일반적인 설정 (재료 표참조)과 마우스의 위치를 조정에 대한 자세한 내용은 Gong 등28을참조하십시오. - 10월의 최적의 이미지를 달성하기 위해 초점을 조정합니다.
- OCT 이미징 소프트웨어에서 표시된 선의 각도를 조정하여 지속적인 히알로이드 혈관을 표시한 다음 이미지를 촬영합니다.
- F (주)F undus f 루오레세인 a. ngiography 히알라로이드 혈관의 화상 진찰
- 플루오레세인 용액 준비: 9 mL의 멸균 인산완충식염수(PBS)를 1 mL의 플루오레세인 용액(재고 농도: 100 mg/mL)에 추가합니다. 최종 작업 용액의 농도는 10 mg /mL입니다.
- 복강 내 플루오레세인 작동 용액 (5 μL / g 체중)을 주입하십시오.
- 인공 눈물로 마우스의 각막을 수분을 공급한 다음 마우스를 위치 단계 위에 놓습니다.
- 마이크론 IV 망막 화상 진찰 현미경의 렌즈를 마우스 각막과 직접 온화한 접촉을 만들기 위하여 배치하십시오. 시신경 헤드를 시야의 중앙에 배치하도록 정렬을 약간 조정합니다.
- 현미경 필터를 녹색 형광 채널로 변경합니다.
- 이미지를 찍을 영구 히알로이드 용기에 초점을 맞춥니다.
- 히알로이드 혈관을 관찰하기 위한 최적의 시점(신호 대 배경 비율)을 결정하기 위해 1분, 3분, 5분, 10분(10분 이하) 사후 삽입 후 여러 이미지를 찍습니다. 10 분 이내에 FFA 절차를 완료한 후 플루오레세인이 너무 확산되어 혈관이 보이지 않게됩니다.
- 마취에서 마우스의 회복
- 시술 후, 마우스를 따뜻한 가열 패드에 보관하십시오.
- 마우스가 다시 이동될 때까지 기다렸다가 마우스 케이지로 되돌아갑니다.
2. 파트 II : 히알로이드 혈관의 생체 시각화
- 고정 마우스 눈의 준비
- 적당한 나이의 마우스를 선택합니다.
참고: 신생아 마우스는 일반적으로 히알로이드 해부를 위해 P8에서 희생됩니다. 남녀 모두 적합합니다. 지연된 히알로이드 회귀를 가진 돌연변이 마우스(및 그들의 각각의 WT 대조군)는 성인기 내내 해부되고 분석될 수 있다. - CO2에 노출시킴으로써 마우스를안락사시한다.
- 무딘 해부로 마우스의 눈을 절제하십시오.
- 미세 수술 집게로 눈꺼풀을 넓게 열어 안구에 접근할 수 있도록 합니다. 구부러진 미세 수술 집게를 궤도에 놓아 안구를 쥐지 않고 시신경을 잡습니다. 포셉으로 안구를 부드럽게 당기고 제거합니다.
- 양자 택일로, 미세 수술 가위를 사용하여 안구를 해부하여 조심스럽게 궤도의 뒤쪽으로 네 면에서 지구와 평행을 잘라 주변 결합 조직에서 지구를 분리.
- PBS 버퍼에 4% 파라포름알데히드에 눈을 담그고 실온에서 30분 간 고정하십시오.
- 고정 된 안구를 얼음 차가운 PBS 버퍼로 옮긴다.
참고: 안구는 최대 1주일 동안 4°C에서 PBS에 보관될 수 있다.
- 적당한 나이의 마우스를 선택합니다.
- 젤라틴 주사로 히알로이드 용기 내장
- 5% (v) 젤라틴 용액을 준비합니다.
- 50 mg의 젤라틴을 계량하십시오.
- 증류수 1 mL에 젤라틴을 녹입니다.
- 젤라틴 용액을 완전히 용해될 때까지 37°C 수조에서 배양합니다. 사용 될 때까지 용액을 37 °C의 물에 보관하십시오.
참고: 더 큰 용액 배치를 aliquots로서 4°C에서 제조 및 저장할 수 있다. 사용 전에 매번, 용액은 명확한 일관성을 달성하기 위해 37 °C 수조에서 따뜻하게해야합니다.
- 해부 현미경으로, 50 μL의 젤라틴 용액을 사지의 유리체에 주입하십시오. 총 4회 주사를 만들기 위해 다른 부위에서 3x 주사를 반복하고, 팔다리 주위로 고르게 이격한다(그림2A).
- 유리체 공간에서 주입된 젤라틴을 고화시키기 위해 4°C 냉장고 또는 얼음에 30분 동안 안구를 배양합니다.
- 5% (v) 젤라틴 용액을 준비합니다.
- 히알로이드 혈관의 해부 및 분리
참고: 그림 2B-E를참조하십시오.- PBS가 들어있는 페트리 접시에 안구를 놓고 조직이 건조하지 않도록 합니다. 사지에 미세 수술 가위로 절개를하고 각막을 제거합니다.
- 시신경을 잘라내고 제거합니다.
- 해부 현미경의 밑에, 포셉의 2 쌍을 사용하여 껍질을 벗기고 공막, choroid 및 망막 안료 상피 (RPE) 층을 버리고 홍채를 제거하십시오.
- 망막의 시신경 측면이 위로 향하고 렌즈 쪽을 아래로 향하게 하면, 젤라틴 유리체와 망막 사이에 PBS 완충장치가 축적될 수 있도록 망막 컵 바로 아래에 50 μL의 PBS를 주입합니다.
- 미세 수술 집게로 유리체에서 망막 컵과 섬모 몸을 부드럽게 벗겨냅니다.
- 전사 파이펫을 사용하여 PBS에 침지된 히알로이드 조직을 함유한 젤라틴 컵을 현미경 슬라이드로 옮김
- 나머지 티슈(렌즈/히알로이드)를 뒤집어 렌즈 쪽이 위를 향하게 합니다.
- 렌즈를 들어 올리고 렌즈/TVL과 VHP 사이의 연결을 부드럽게 느슨하게 한 다음 미세 수술 가위로 HA를 잘라 렌즈-TVL을 제거합니다. 플랫 마운트용 히알로이드 컵의 VHP 부분을 유지합니다.
- 히알로이드 용기의 플랫 장착 및 염색
- 슬라이드에 있는 PBS로 히알로이드 컵을 부드럽게 헹구어 모든 해부 이물질을 제거합니다.
- 적절한 PBS 용액에서 히알로이드 컵이 슬라이드에 떠 있는지 확인하십시오.
- 슬라이드에서 컵 테두리를 아래로 향하게 하여 젤라틴화된 히알로이드 컵의 위치를 미세 수술 집약으로 부드럽게 배열하고 조정하여 녹은 후 최적의 외관을 얻을 수 있습니다.
- PBS에 담근 히알로이드 컵과 함께 슬라이드를 37°C의 슬라이드 워머에 놓고 젤라틴이 녹고 히알로이드가 평평해질 때까지 기다렸다가 거의 건조할 때 슬라이드를 제거합니다(과도하게 건조하지 마십시오).
- (선택 사항) 히알로이드 혈관의 면역스테인
- 블로킹 및 관통 버퍼 (예를 들어, 5 % 소 혈청 알부민 [BSA] 및 0.1 % 트리톤 X-100 PBS 버퍼). 50 μL의 블로킹 버퍼를 평평하게 장착된 히알로이드 절연에 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- 1차 항체(예: CD31)(차단 완충제에서 1:100 희석)의 50 μL을 히알로이드 분리의 평평한 마운트에 적용한 다음, 4°C에서 하룻밤 동안 습식 상자에 배양한다.
- PBS로 매번 5분 동안 3x를 부드럽게 헹구십시오.
- 히알라로이드 플랫 마운트에 50 μL의 이차 항체(예를 들어, 염소 항토끼 이차 항체-Alexa 488, 1:100 희석)를 적용하고 1시간 동안 실온에서 배양한다.
- PBS로 매번 5분 동안 3x를 부드럽게 헹구십시오.
- DAPI(4', 6-diamidino-2-phenylindole)로 안티 페이드 마운팅 배지를 추가하여 히알로이드 혈관의 핵을 염색합니다.
- 커버슬립을 히알로이드 위에 가볍게 놓고 평평한 마운트를 완성합니다.
- 평면 장착 히알로이드 용기의 이미징 및 정량화
- 형광 현미경으로 히알로이드 혈관의 DAPI 염색을 이미지화하고 중앙 HA가 보이는지 확인합니다(HA가 없는 시료 제외).
- HA에서 직접 파생된 선박 분기를 식별하고 정량화를 위해 선박 분기 수를 수동으로 계산합니다.
- 눈의 단면에 히알라로이드 혈관의 시각화
- 고정 된 안구를 적절한 조직 금형에 최적의 절삭 온도 화합물에 넣고 내장 된 눈을 드라이 아이스에 얼리거나 -20 ° C 냉동고에 보관하십시오.
- 저온 유지 마이크로토메를 사용하여 내장된 눈의 단면을 -20°C에서 12 μm 두께의 단면을 만듭니다.
- 슬라이드에 부착 할 조직 섹션을 부드럽게 터치하여 현미경 슬라이드 실온에 눈 단면을 수집합니다.
- 공기 건조는 ~ 30 분 동안 조직 섹션을 탈수, 다음 염색 에 대한 준비가 될 때까지 -20 ° C 냉동고에 저장할 수 있습니다.
- 슬라이드를 PBS로 1x 헹구고 슬라이드에 남아있는 최적의 절삭 온도 화합물을 제거합니다.
- (선택 사항) 필요한 경우 추가 고정을 위해 실온에서 15분 동안 적절한 고정 버퍼(예: PBS의 4% 파라포름알데히드)에 슬라이드를 담급니다.
- 실온에서 30 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100으로 조직을 투과시.
- 혈관 염색을 위해 isolectin-IB4 염색 완충액을 준비하십시오.
- 50 mL 원심 분리튜브에 50 mL의 PBS로 이솔라틴-IB4(500 μg) 분말을 용해및 재구성합니다.
- 1 M CaCl2 용액 의 50 μL을 천천히 PBS / isolectin-IB4 혼합물의 50 mL에 떨어 뜨립니다. 이 단계는 강수량을 피하기 위해 천천히 수행될 필요가 있다. CaCl 2의 최종 농도는 1 μM이다. Isolectin-IB4 염색에는 Ca2+의 존재가 필요합니다.
- 슬라이드의 눈 단면에 isolectin-IB4 염색 완충제 30 μL을 적용하고 밤새 4 °C에서 젖은 상자에 배양.
- PBS로 매번 5분 동안 3x를 헹구고 있습니다.
- DAPI와 함께 안티 페이드 장착 매체를 추가하여 섹션의 핵을 염색합니다.
- 커버슬립을 티슈 섹션에 부드럽게 놓아 플랫 마운트를 완성합니다.
- 현미경으로 조직을 확인하여 안구 내 히알로이드 혈관의 존재를 시각화하십시오.
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Representative Results
살아있는 마우스에 있는 히알라로이드 혈관의 생체 내 화상 진찰
그림 3 A는 3개월 된 WT및 Lrp5마우스에서망막 및 히알로이드 조직에 대한 OCT 이미지의 단면 뷰를 보여 주며, 지속적인 히알로이드를 가진 동물 모델입니다. WT 눈은 히알로이드 조직의 부재를 나타내고, Lrp5-/-눈은 시신경 머리에서 파생된 두 개의 지속적인 히알로이드 혈관을 보여줍니다. 그림 3 B는 6주령 의 Lrp5-/- 마우스에서 형광장에서 지속적인 히알로이드 혈관(녹색)의 FFA 이미지를 표시합니다. WT 마우스는 히알로이드 혈관의 잔재를 나타내지 않으며, Lrp5-/-마우스는 유리체에 있는 히알로이드 혈관의 8개의 가지를 보여줍니다.
히알라이드 혈관의 생체 내 시각화
그림 4 A, B는 혈관 세포와 관련 대식세포가 DAPI 염색 (파란색)으로 핵에 의해 염색 된 평평한 마운트에서 시각화 된 것과 같은 고립 된 히알로이드 혈관을 보여줍니다. HA는 각 이미지의 중심에 있으며, 히알로이드 용기는 DAPI 유래 불연속 라인에 의해 드러난다. 각 라인은 VHP의 하나의 선박을 나타냅니다. Lrp5-/-마우스에서, 남아있는 히알로이드 혈관의 더 높은 숫자는 평평한 마운트에서 P8에서 관찰되었다 (그림4A). WT 마우스는 P8에서 히알라형 혈관의 평균 12 가지를 가지고 있었지만, 연령일치 Lrp5-/- 새끼는 히알로이드 혈관의 약 25 가지 를 보였으며, 히알로이드 혈관 구조의 현저한 손상된 회귀를 입증했습니다 (그림4) B). 또한, 지연되고 불완전한 망막 혈관 발달, 종종 지속적인 히알로이드 혈관과 관련된 또 다른 특징은, 또한 Lrp5-/- 새끼에서 관찰되었다(도4C,D). 그림 5는 P8에서 Lrp5-/-눈의 단면에 남아 있는 히알로이드 혈관을 나타내지만 WT 눈은 히알로이드 혈관을 나타내지 않습니다.
그림 1 : 마우스 눈의 히알로이드 혈관 구조의 발달 회귀를 묘사한 회로도 다이어그램. VHP, TVL 및 PM을 포함한 히알로이드 혈관 및 가지는 HA에서 파생되며 출생 시 렌즈와 미성숙 망막 사이의 공간을 많이 차지합니다(P0). 마우스에서 히알로이드 불순술은 P4의 PM 모세혈관의 회귀로 시작됩니다. P8에서, PM, VHP 및 TVL 층은 망막 혈관의 표면 층의 완전한 형성과 일치, 지속적으로 회귀된다. P12에 의해, PM 층의 불변은 완료, VHP와 TVL의 위축은 여전히 진행 중인 반면. 한편, 망막 혈관의 깊은 층은 P7-P12 동안 형성하기 시작합니다. P16에 의해, 히알로이드 시스템의 회귀는 부분적으로 완료되고 (나머지 TVL 혈관및 HA 좌측) 망막 혈관 신경총의 중간 층이 계속 발전하고 있습니다. 망막 혈관은 P21에 의해 완전히 성숙하고 현재 주로 회귀되는 히알로이드 혈관에서 망막 조직에 영양을 공급하는 역할을 합니다. P21에서 유리체는 히알로이드 혈관이없는 경우 명확한 시각적 경로를 보여줍니다. 파선된 빨간색 선은 회귀 혈관을 나타냅니다. VHP= 바사 히알로아이디어 프로피리아; TVL = 튜니카 바스쿠로사 렌티스; PM = 동공 막; HA = 히알로이드 동맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 생체외 히알로이드 혈관 분리의 순차적 절차를 묘사한 회로도 다이어그램 플랫 마운팅 시각화. (A) 젤라틴을 사지에 4개의 주사점(빨간 점)을 통해 enucleated 눈에 주입하여 유리체를 굳게 한다. (B) 각막과 시신경의 제거, 홍채의 주의 해부, 공막 -choroid-RPE 복합체를 벗겨. (C) 망막 쪽을 위로 향하게 하기 위하여 렌즈로 나머지 망막 컵을 뒤집는; 그런 다음 망막과 유리체 사이에 PBS를 주입하여 분리한 다음 망막 층을 벗깁니다. (D) 주위 히알로이드와 렌즈를 포함, 조직의 나머지 부분을 다시 거꾸로 뒤집는. TVL과 VHP의 연결을 느슨하게 하기 위해 렌즈를 약간 들어 올림입니다. (E) TVL과 VHP 사이의 HA에서 절단하고 렌즈와 TVL을 제거합니다. 플랫 마운팅 VHP 레이어. VHP= 바사 히알로아이디어 프로피리아; TVL = 튜니카 바스쿠로사 렌티스; PM = 동공 막; HA = 히알로이드 동맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)와 히알로이드 혈관의 생체 내 이미징 그리고 안저 형광 혈관 조영술 (FFA). A: Lrp5 -/-눈의 유리체 공간에서 지속적인 히알로이드 혈관을 보여주는 3 개월 된 WT 및 Lrp5-/-마우스의 대표적인 OCT 이미지. B: 6 주 된 WT 및 Lrp5-/-마우스의 대표적인 FFA 이미지. 마우스는 마취 후 마우스 당 0.1ml 식염수에 1mg의 플루오레세신 나트륨을 주입하였고, 주사 후 5분 후에 이미지를 채취하였고, WT에서 Lrp5-/-마우스 또는 유리체의 유리체(히알로이드 혈관이 없는 경우)에서 히알로이드 혈관에 초점을 맞춘 영상을 촬영하였다. 지속적인 히알로이드 혈관은 Lrp5-/-하지만 WT 눈에서 시각화되지 않았습니다. 빨간색 화살표는 히알로이드 혈관을 나타냅니다. 두 축척 막대: 100 μm (A). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : Lrp5-/-마우스에서 지연된 히알로이드 혈관 회귀 및 지연된 망막 혈관 발달의 시각화. (A) WT의 DAPI(파란색)와 P8의 Lrp5-/-눈으로염색된 평평한 장착 히알로이드 용기의 대표적인 이미지. 화살표(흰색)는 히알로이드 동맥을 나타냅니다. (B) WT 및 Lrp5눈의히알로이드 동맥에서 분기되는 히알로이드 혈관의 수를 정량화한다. (C) 대표적인 플랫 마운트 망막은 WT의 혈관구조에 isolectin-IB4(빨간색)로 염색되고 P8에서 Lrp5-/-눈. 흰색 파선은 망막 가장자리를 나타냅니다. 노란색 선은 혈관화된 영역 가장자리를 나타냅니다. (D) WT 및 Lrp5눈에서피상망막 혈관 신경총의 혈관 커버리지의 정량화. n = 8-12/그룹. 패널 A 및 C = 1 mm. 데이터의 스케일 바는 평균 ±SEM. 2꼬리 학생의 t-검정을 통계 분석에 사용하였다. **P < 0.01. 이 그림은 왕 외27의허가하에 수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : Lrp5-/-눈의 단면에서 히알로이드 혈관의 시각화. P8에서 WT 및 Lrp5-/-마우스로부터 분리된 눈의 단면의 대표적인 이미지. 눈은 최적의 절삭 온도에 enucleated 및 내장하고, 단면도는 저온 중지를 사용하여 절단되었다. 단면은 혈관을 나타내기 위해 핵및 이솔크틴-IB4(적색)를 나타내기 위해 DAPI(파랑)로 염색하였다. 흰색 화살표는 히알로이드 혈관을 나타냅니다. 스케일 막대 = 500 μm. 이 그림은 첸 외16의허가하에 조정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
히알로이드 혈관을 평가하고 특성화하는 기술은 동물 모델에서 히알로이드 혈관 회귀를 관찰하는 직관적이고 필요한 절차이며, 개발 중 혈관 회귀의 기초가 되는 메커니즘에 대한 연구를 허용합니다. 생체 내 망막 이미징은 동일한 동물에서 히알로이드 회귀의 세로 관찰을 허용하는 반면, OCT 및 FFA를 위한 설치류 안저 이미징 시스템에 대한 접근은 제한 요인이 될 수 있다. 추가적인 추가, 살아있는 마우스에 있는 생체 내 화상 진찰은 그들의 눈을 열기 전에 가능하지 않습니다. 따라서이 방법론은 신생아 단계에서 눈 발달 중에 적용되지 않습니다. 한편, 고립된 눈의 단면을 이미징하는 것은 마우스의 모든 연령대에 사용될 수 있고 기술적 장벽이 낮지만, 눈에 보이는 히알로이드 용기가 몇 개밖에 없을 때 정량적이지 않으며, 이상적인 이미지를 얻을 확률은 주로 단면화 각도(그림 5). 이에 비해, 플랫 마운트 시각화를 위한 히알라드 용기의 분리는 전체 히알로이드 용기의 완전한 이미징과 정확한 정량화를 가능하게 하지만, 히알로이드 용기의 섬세하고 깨지기 쉬운 특성으로 인해 기술적 문제가 발생할 수 있습니다. 이 백서에 자세히 설명된 프로토콜이 이러한 어려움을 극복하는 데 도움이 되기를 바랍니다.
히알로이드 절연 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계는 젤라틴 용액의 주입, 망막의 제거 및 최종 플랫 마운팅을 포함한다. 히알라로이드 혈관구조 처리의 기술적 어려움은 섬세한 성질, 히알로이드 혈관이 있는 유리체의 거의 액체와 같은 상태, 인접한 렌즈 및 망막과의 긴밀한 연결에 있습니다. 젤라틴 용액을 인트라비티(intravit)로 주입하는 것은 히알로이드 용기를 함유한 유리체를 고체화시키는 데 핵심적이며, 따라서 쉽게 해부및 취급을 위해 질감을 더 단단하게 만듭니다. 젤라틴은 투명한 탄성 열돌이성 겔을 형성하는 겔화제입니다. 유리체 공간에 젤라틴의 액체 형태 (실온 또는 37 °C에서)를 주입하고 낮은 온도 (4 °C)로 냉각함으로써 유리체는 더 단단한 젤 컵으로 변형됩니다. 눈에 여러 젤라틴 주사를 수행하면 유리체 공간으로 젤라틴의 충분한 양의 전체 분산을 허용, 균일하고 둥근 젤라틴 화 히알로이드 조직 컵을 형성. 또 다른 기술적 인 어려움은 히알로이드 조직을 손상시키지 않고 망막을 제거하는 데 있습니다. 상대적으로 분해하기 쉬운 코로이드와 는 달리, 히알로이드 혈관을 포함하는 젤라틴화 유리체는 히알로이드를 손상시키지 않고 근처 망막에서 분리하는 것이 어렵습니다. 우리는 유리체와 망막 사이의 공간에 PBS를 주입하는 것이 액체 완충층을 생성한다는 것을 것을을 발견했습니다, 이 두 조직을 분리하는 것이 훨씬 쉽게. 이것은 캡슐과 백내장 피질을 분리하기 위하여 백내장 수술에서 이용된 수과 분비기 기술과 다소 유사합니다. 최종 플랫 마운팅은 프로토콜의 마지막 기술적으로 어려운 단계입니다. 슬라이드 워머에 PBS 방울에 젤라틴화 히알로이드 조직을 따뜻하게하면 쉽게 평평하게 장착 할 수 있도록 더 액체와 같은 형태로 다시 변환됩니다. 히알로이드 젤 컵의 적절한 배열과 방향은 녹고 건조한 후에도 균일하게 평평하게 하기 위해 여전히 필수적입니다.
히알로이드 혈관을 분리하는 프로토콜은 여러 가지 방법으로 더 변형될 수 있다. 우리가 사용한 젤라틴 용액의 농도는 5 %이지만, 더 높거나 낮은 농도는 처리에 대한 더 단단하거나 부드러운 질감을 달성하기 위해 연구원의 선호도에 따라 작동 할 수 있습니다. 세포 핵의 DAPI 염색은 또한 이솔ctin-IB4 또는 다른 내피 세포 또는 대식세포 마커로 변형될 수 있으며, 혈관 내피 세포를 대식세포로부터 더 잘 구별할 수 있다. 주의 사항 : 평평하게 장착 된 히알로이드 용기는 매우 섬세하고 슬라이드에 느슨하게 부착됩니다. 따라서, 히알로이드 슬라이드는 염색 중에 헹구어야하는 경우 매우 부드럽고 신중하게 처리해야합니다. 이러한 격리 프로토콜은 또한 연약한 조직의 특성으로 인한 미세 해부 수행의 복잡성 및 시료의 장기 보존의 어려움을 포함하는 그 한계를 갖는다. 그럼에도 불구하고, 고립 및 평면 장착 히알로이드 혈관은 여전히 히알로이드 혈관을 연구하는 가장 포괄적이고 직관적 인 방법, 안구 및 혈관 신생 연구10,17,27, 29,30,31.
히알로이드 혈관 구조는 안과, 혈관 신생 및 프로그래밍 된 세포 사멸의 연구 분야와 관련된 발달 혈관 성장 및 회귀를 연구하는 훌륭한 실험 모델을 제공합니다.이 논문은 이 논문을 지원하는 것을 목표로합니다. 격리 프로토콜의 향후 수정은 기술적 해부 절차의 타당성을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 전반적으로, 히알로이드 혈관의 생체 내 이미징 및 생체 내 분리를 결합하면 혈관 회귀의 유용한 모델로서 마우스에서 히알로이드 혈관의 완전한 평가 및 특성화를 허용하는 유리한 방법이다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 J.C. Z.W.에 국립 보건원 (NIH) 보조금 (R01 EY024963 및 EY028100)에 의해 지원되었다 기사단 눈 재단 경력 스타터 그랜트에 의해 지원되었다. 이 연구에서 설명한 히알로이드 격리 절차는 리처드 랭 박사, 쿠리하라 도시히데, 로이스 스미스 박사가 아낌없이 공유한 프로토콜의 수정으로 조정되었으며, 저자들은 감사하게 생각합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
References
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