Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Vurdering og karakterisering af Hyaloide fartøjer i mus

Published: May 15, 2019 doi: 10.3791/59222
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 2The Manton Center for Orphan Disease Research, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

Summary

Denne protokol beskriver både in vivo og ex vivo metoder til fuldt ud at visualisere og karakterisere hyaloide fartøjer, en model af vaskulær regression i muse øjne, ved hjælp af optisk kohærens tomografi og fundus fluorescein angiografi for levende billeddannelse og ex vivo isolering og efterfølgende flad mount af hyaloid for kvantitativ analyse.

Abstract

I øjet nærer de embryonale hyaloide fartøjer den udviklende linse og nethinden og genstigning, når nethinde skibene udvikler sig. Persisterende eller mislykket regression af hyaloide fartøjer kan ses i sygdomme som vedvarende hyperplastisk primær glaslegemet (PHPV), hvilket fører til en blokeret lysvej og nedsat visuel funktion. Forståelse af mekanismerne bag hyaloid-fartøjets regression kan føre til ny Molekylær indsigt i den vaskulære regressions proces og mulige nye måder at håndtere sygdomme med persistente hyaloide fartøjer på. Her beskriver vi procedurerne for billeddannelse hyaloid i levende mus med optisk kohærens tomografi (OCT) og fundus fluorescein angiografi (FFA) og en detaljeret teknisk protokol om isolering og flad montering hyaloid ex vivo til kvantitativ analyse. Lavdensitets lipoprotein receptor-relaterede protein 5 (LRP5) Knockout-mus blev brugt som en eksperimentel model af vedvarende hyaloide fartøjer for at illustrere teknikkerne. Tilsammen kan disse teknikker lette en grundig vurdering af hyaloide fartøjer som en eksperimentel model af vaskulær regression og undersøgelser af mekanismen af persistente hyaloide fartøjer.

Introduction

Blodforsyningen i øjet er afgørende for at sikre den normale udvikling af nethinden og omgivende okulære væv og for at udstyre en ordentlig visuel funktion. Der er tre vaskulære senge i øjet: retinal vasculature, choroid, og en forbigående embryonale kredsløbssygdomme netværk af hyaloide fartøjer. Udviklingen af den okulære vaskulatur kræver rumlig og tidsmæssig koordination i hele embryogenese og vævs modning. Blandt de tre vaskulære senge, hyaloid Vaskulaturen er den første funktionelle blodforsyning system til at give næring og ilt til den nyligt dannede embryonale linse og den udviklende nethinden. Hyaloid fartøjer tilbagegang på samme tid, at nethinden vasculatures udvikle og modne1. Regression af hyaloid Vaskulaturen er afgørende for at give en klar visuel vej for udviklingen af visuel funktion; Derfor er denne vaskulære regressions proces så vigtig som væksten af retinale vasculature. Nedsat hyaloid regression kan føre til øjensygdomme. Desuden, regression af hyaloid fartøjer giver et model system til at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer involveret i reguleringen af vaskulær regression, som kan have konsekvenser for angiogen regulering i andre organer samt.

Hyaloidevaskulaturen, afledt af hyaloidearterie (ha), består af Vasa hyaloidea propria (VHP), tunica vasculosa lentis (TVL) og pupil membran (PM). Det giver næring til den udviklende nethinden, den primære vitreous, og linsen under fosterudvikling2. Som følge af HA, VHP grene anteriorly gennem glaslegemet til linsen. TVL bægre den bageste overflade af linsen kapsel, og anastomoser til PM, som forbinder til de forreste ciliære arterier, dækker den forreste overflade af linsen2,3, hvilket resulterer i dannelsen af et netværk af fartøjer i PM 3 , 4 , 5. interessant, der er ingen vener i hyaloid Vaskulaturen, og systemet gør brug af koroidal vener til at udføre venøs dræning.

I det menneskelige embryon er hyaloid Vaskulaturen næsten færdig på omtrent den niende uge af drænings perioden og begynder at genvinde, når de første retinale fartøjer vises, i løbet af den fjerde måned af drænings perioden2. Begyndende med atrofi af VHP, regression af kapillar netværk af TVL, PM, og endelig, ha opstår efterfølgende2,3. I mellemtiden begynder de primære glasfiber trækker og den sekundære glasfiber at danne, sammensat af de ekstracellulære matrixkomponenter, herunder kollagen fibre. Den sjette måned af drænings måneden, den primære glaslegemet er reduceret til en lille gennemsigtig kanal, der strækker sig fra synsnerven disken til linsen, kaldet Cloquet kanalen eller hyaloid kanalen, og den sekundære glaslegemet bliver den vigtigste komponent i det bageste segment 2 , 3. den hyaloide cirkulation forsvinder for det meste på 35 til 36 ugers dræelse, lige før fødslen3.

I modsætning til mennesker, i hvem hyaloid Vaskulaturen er helt svandt ved fødslen, musen hyaloid vaskulære system begynder at genvinde efter fødslen. Da musen nethinden er født avaskulære og retinale fartøjer udvikle postnatalt, hyaloid fartøjer tilbagegang samtidig fra postnatal dag (P) 4 og er for det meste helt svandt af P216 (figur 1). PM forsvinder først mellem P10 og P12, og VHP forsvinder mellem P12 og P16, mens et lille antal TVL-og HA-celler forbliver selv på P16, og ved P21 er hyaloid vaskulære system regression næsten komplet6. I mellemtiden begynder retinal Vaskulaturen at udvikle sig efter fødslen. Det overfladiske lag af vaskulære plexus strækker sig fuldt ud til den perifere nethinden på P7 – P8, det dybe lag (placeret i det ydre plexiformlag) udvikler sig fra P7 – P12, og endelig udvikler det mellemliggende plexus i det inderste plexiformlag mellem P12 og P157 . Efterhånden som den retinale vaskulatur udvikler sig, erstatter den gradvist funktionen af samtidigt regresserende hyaloidekar, der giver næring og ilt til det udviklende øje. Den postnatale forekomst af hyaloid-fartøjs regression i mus giver en let tilgængelig eksperimentel model til at observere og studere hyaloidevaskulaturen samt det molekylære grundlag for vaskulære regressions processer under både fysiologiske og patologiske tilstande8.

Svigt af hyaloid regression kan ses i sygdomme som PHPV, som er en sjælden medfødt udviklingsmæssige anomali af øjet som følge af en mislykket eller ufuldstændig regression af den embryologiske, primære glasøse og hyaloid Vaskulaturen9. De mekanismer, der regulerer regressions processen af hyaloid vaskulatur er komplicerede og bredt undersøgt. En af de vigtigste molekylære veje, der er afgørende for den normale regression af hyaloide fartøjer, er WNT signalering pathway10, da genetiske mutationer i denne sti, der påvirker både WNT ligand og receptorer, er blevet forbundet med PHPV i mennesker9. Eksperimentelle undersøgelser identificerede en WNT ligand, Wnt7b, som produceres af makrofager omkring hyaloide fartøjer i det udviklende øje for at mægle denne regressions proces. Wnt7b aktiverer WNT signalering ved binding med receptorerne frizzled4 (FZD4)/LRP5 i tilstødende endotelceller til at initiere celle apoptose, hvilket fører til regression af hyaloid fartøjer10. Som et resultat, Wnt7b-mangelfulde mus viser en persistens af hyaloid fartøjer10. Tilsvarende binder en ikke-konventionel WNT ligand, Norrin (kodet af NDP -genet), også til FZD4/LRP5 for at inducere hyaloid-fartøjets regression under udviklingen. NDPy/-, Lrp5-/-, og Fzd4-/- mus alle display udskudt hyaloid fartøj regression, understøtter en kritisk regulerende rolle i WNT signalering11,12, 13,14,15,16. Desuden er en anden WNT coreceptor LRP6 overlapper med LRP5 i deres funktion på modulering af WNT signalering pathway i hyaloid vaskulære endotheliale celler17. Andre faktorer, der kan også bidrage til hyaloid regression omfatter hypoxia-inducerbarfaktor 18,19, vaskulær endotelial vækstfaktor20,21, kollagen-1822, 23, ARF24, angiopoietin-225, og knogle morfogenetisk protein-426. I dette papir bruger vi Lrp5-/- mus som en model af vedvarende hyaloide fartøjer til at demonstrere teknikker til vurdering og karakterisering af hyaloid Vaskulaturen gennem både in vivo og ex vivo metoder.

Visualisering af hyaloid Vaskulaturen in vivo og ex vivo er afgørende for at studere mekanismerne i hyaloid fartøjs regression. Nuværende metoder til at observere hyaloid Vaskulaturen primært fokusere på visualisering og analyse af VHP og ha, gennem Oct og FFA billeder, Eye Cross sektioner, og hyaloid Flat mount. OCT og FFA er kraftfulde in vivo Imaging værktøjer, så langsgående observation i levende dyr, efter at de har åbnet deres øjne. Desuden giver isoleret hyaloid Flat Mount visualisering af hele hyaloid Vaskulaturen og et middel til at opnå en nøjagtig kvantificering af fartøjs numrene. Men den skrøbelige og skrøbelige karakter af hyaloide fartøjer og de deraf følgende tekniske vanskeligheder ved dets isolation kan have begrænset dets anvendelse i øjen forskning noget10,17,27. I dette papir, vi giver en detaljeret protokol af visualisering af hyaloide fartøjer, der kombinerer både in vivo levende retinale Imaging og ex vivo isoleret hyaloid Flat mount for at øge gennemførligheden af disse teknikker. Denne protokol er blevet tilpasset med ændringer og udvidelser fra tidligere publikationer om in vivo-metoden med levende fundus og OCT Imaging28 og ex vivo - metoden for isoleret hyaloid Flat Mount11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr blev behandlet i overensstemmelse med Association for forskning i vision og oftalmologi (ARVO) erklæring om anvendelse af dyr i oftalmisk og vision forskning for dyreforsøg, efterretnings linjerne for de nationale institutter for sundhed ( NIH) med hensyn til pasning og anvendelse af dyr til eksperimentelle procedurer og de regler, der er fastsat af den institutionelle dyrepleje og anvendelse Komité (IACUC) på Boston children's Hospital. Lrp5-/- mus (lager nr. 005823; Jackson Laboratory) og dets Wild-type (WT) Control C57BL/6J mus (lager nr. 000664; Jackson Laboratory) blev anvendt til denne undersøgelse.

1. del I: in vivo-billeddannelse af hyaloide-fartøjer ved hjælp af et gnaver-nethinde billedbehandlingssystem

  1. Forberedelse af mus anæstesi og pupil dilatation
    1. Vælg musene.
      1. Bruge mus, der er ældre end P12 (efter at de har åbnet øjnene) for nethinde dannelse; begge køn er velegnede.
      2. Som ønsket, billede mutant mus med forsinket hyaloid regression (og deres WT kontrol) i hele voksenalderen. WT-mus, der er ældre end 3 uger, udviser muligvis ikke meget detekterbare resterende hyaloide beholdere, derfor P12 – P21 er ideel til billeddannelse tilbageværende synligt WT hyaloid.
    2. Forbered en ketamin/xylazin blanding til anæstesi.
      1. Tag 2,3 ml ketamin stamopløsning (100 mg/ml) og 0,7 ml xylazin stamopløsning (20 mg/ml) og tilsæt 20 ml sterilt saltvand (0,9% natriumchlorid) for at lave en fungerende opløsning af en ketamin/xylazinblanding (10 mg/ml ketamin og 0,6 mg/ml xylazin).
    3. Bedøve musene ved intraperitonealt injektion af ketamin/xylazin blanding i et volumen på 8x musens legemsvægt (f. eks. en 20 g mus behov 160 μL ketamin/xylazin arbejder opløsning blanding for at opnå en fungerende dosis af ketamin [80 mg/kg legemsvægt] og xylazin [4,8 mg/kg legemsvægt] blanding).
    4. Påfør en dråbe pupil-dilaterende stof opløsning (Se tabel over materialer) til hvert øje for at dilatere musens elever umiddelbart efter anæstesi.
    5. Vurder niveauet af anæstesi ved pedal refleks (fast bagben tå knivspids). Vent, indtil musen er tilstrækkeligt bedøvet (ingen pedal refleks) og dens elever er bredt forstøreret.
  2. Optisk kohærens tomografi billeddannelse af hyaloide fartøjer
    1. Fugter musens hornhinder med kunstige tårer, og Placer derefter musen på positionerings stadiet.
    2. Kontakt forsigtigt musens hornhinde med linsen i OLT-sonden. Juster musen og sonde, så synsnerven hovedet er i midten af det visuelle felt i fundus billede, at guide OCT Imaging.
      Bemærk: for yderligere oplysninger om den generelle opsætning af et gnaver nethinde billedbehandlingssystem (Se tabel over materialer) og justering af musens position henvises til Gong et al.28.
    3. Juster fokus for at opnå de optimale billeder af OCT.
    4. Juster vinklen på den angivne linje i OCT imaging software (Se tabel over materialer) for at afsløre vedvarende hyaloide fartøjer og derefter tage billeder.
  3. F undus f luorescein en stor ngiografi billeddannelse af hyaloide fartøjer
    1. En fluorescein-opløsning tilsættes 9 mL steril phosphatbufferet saltvand (PBS) til 1 mL fluorescein opløsning (lager koncentration: 100 mg/mL). Koncentrationen af den endelige arbejdsopløsning er 10 mg/mL.
    2. Intraperitonealt injicerer fluorescein-arbejdsopløsningen (5 μL/g legemsvægt).
    3. Fugter musens hornhinde med kunstige tårer, og Placer derefter musen på positionerings stadiet.
    4. Placer linsen af micron IV retinale Imaging mikroskop til at gøre direkte blid kontakt med mus hornhinden. Justér justeringen lidt for at placere synsnerven i midten af visningsfeltet.
    5. Skift mikroskop filteret til en grøn fluorescerende kanal.
    6. Fokuser på vedvarende hyaloide fartøjer til at tage billeder.
    7. Tag flere billeder efter 1 min, 3 min, 5 min, og 10 min (højst 10 min) efter injektion for at bestemme det bedste tidspunkt (signal-til-baggrund ratio) for observation hyaloid fartøjer. Gennemfør FFA-proceduren inden for 10 minutter, hvorefter fluorescein kan blive for diffbrugt og gøre fartøjer usynlige.
  4. Inddrivelse af musene fra anæstesi
    1. Efter procedurerne, holde musene på en varm varmepude.
    2. Vent, indtil musene er mobile igen for at returnere dem til muse buret.

2. del II: ex vivo-visualisering af hyaloide-fartøjer

  1. Forberedelse af faste muse øjne
    1. Vælg mus i den rigtige alder.
      Bemærk: neonatal mus bliver typisk ofret på P8 for hyaloid Dissection. Begge køn er velegnede. Muterede mus med forsinket hyaloideregression (og deres respektive WT-Kontroller) kan dissekteres og analyseres i hele voksenalderen.
    2. Euthanize musene ved udsættelse for CO2.
    3. Enucleate musens øjne ved stump dissektion.
    4. Åbn øjenlåg bredt med mikrokirurgi pincet for at give adgang til øjeæblet. Placer buede mikrokirurgi pincet under kloden i kredsløb til at forstå synsnerven uden at klemme øjeæblet. Træk forsigtigt og fjern øjeæblet med pincet.
    5. Alternativt, dissekere øjeæblet ved hjælp af mikrokirurgi saks til omhyggeligt at skære parallelt med kloden fra de fire sider mod bagsiden af kredsløb og adskille kloden fra omgivende bindevæv.
    6. Øjnene nedsænkes i 4% PARAFORMALDEHYD i PBS-buffer i 30 minutter ved stuetemperatur til fiksering.
    7. Overfør de faste øjebolde til iskold PBS-buffer.
      Bemærk: øjekuglerne kan opbevares i PBS ved 4 °C i op til 1 uge.
  2. Indlejring af hyaloidekar med gelatine injektion
    1. Forbered en 5% (w/v) gelatineopløsning.
      1. Vejer 50 mg gelatine.
      2. Gelatinen opløses i 1 mL destilleret vand.
      3. Gelatine opløsningen inkubates i et 37 °C-vandbad, indtil den er helt opløst. Opløsningen opbevares i 37 °C vand indtil brug.
        Bemærk: en større portion opløsning kan tilberedes og opbevares ved 4 °C som aliquoter. Hver gang før brug, skal opløsningen opvarmes i 37 °C vandbad for at opnå en klar konsistens.
    2. Under et dissektions mikroskop indsprøjtes 50 μL gelatineopløsning i glaslegemet ved limbus; Gentag injektionen 3x på forskellige steder for at foretage i alt fire injektioner, jævnt fordelt omkring limbus (figur 2a).
    3. Du skal inkubere øjeæblerne i et 4 °C-køleskab eller på is i 30 minutter for at størkne den injicerede gelatine i glaslegemet.
  3. Dissektion og isolering af hyaloide fartøjer
    Bemærk: Se figur 2B-E.
    1. Placer øjekuglerne i en Petri skål indeholdende PBS for at holde vævet fra tørring. Lav et snit med mikrokirurgi saks på limbus og fjerne hornhinden.
    2. Snip og fjerne synsnerven.
    3. Under en dissektion mikroskop, bruge to par tang til at skrælle og kassere sclera, choroid, og retinale pigmentepitel (rpe) lag og fjerne iris.
    4. Med den optiske nerve side af nethinden opad og objektivsiden nedad indsprøjtes 50 μL PBS lige under Retina-koppen for at tillade akkumulering af PBS-bufferen mellem den gelatiniserede Glasfiber krop og nethinden.
    5. Forsigtigt skrælle og fjerne nethinden kop og ciliære krop fra glaslegemet med mikrokirurgi pincet.
    6. Brug en overførings pipette til at overføre gelatine koppen indeholdende hyaloidevæv nedsænket i PBS til et mikroskop slide
    7. Drej resten af vævet (linse/hyaloid) over, så linsen side vender opad.
    8. Løft objektivet og Løsn forsigtigt forbindelsen mellem objektivet/TVL og VHP, og skær derefter HA med mikrokirurgi saks for at fjerne linsen-TVL. Opbevar VHP-delen af hyaloid-koppen til den flade montering.
  4. Flad montering og farvning af hyaloide fartøjer
    1. Skyl forsigtigt hyaloidekoppen med PBS på sliden for at fjerne al dissektion snavs.
    2. Sørg for, at hyaloid Cup flyder på diaset i tilstrækkelig PBS-opløsning.
    3. Arranger og Juster forsigtigt positionen af den gelatiniserede hyaloid Cup med mikrokirurgi tang, med kanten af koppen vendt ned på diaset, for at opnå optimalt udseende efter smeltning.
    4. Placer diaset med hyaloid Cup nedsænket i PBS på en glide varmer ved 37 °C, vent, indtil gelatine smelter og hyaloid flattens, og fjern sliden, når den er knap tør (ikke over-tør).
    5. Valgfri Immunostain de hyaloide fartøjer
      1. Gør blokering og gennemtrængende buffer (f. eks. 5% bovint serumalbumin [BSA] og 0,1% Triton X-100 i PBS-buffer). Tilsæt 50 μL blokerende buffer på en flad monteret hyaloid isolation og Inkuber det ved stuetemperatur i 30 min.
      2. Påfør 50 μL primær antistof (f. eks. CD31) (1:100 fortynding i blokerende buffer) på et fladt beslag af hyaloid isolation, og Inkuber det derefter i en våd æske ved 4 °C natten over.
      3. Skyl forsigtigt 3x, i 5 minutter hver gang, med PBS.
      4. Påfør 50 μL sekundært antistof (f. eks. ged anti-kanin sekundært antistof-Alexa 488, 1:100 fortynding) på hyaloid Flat Mount og Inkuber det ved stuetemperatur i 1 time.
      5. Skyl forsigtigt 3x, i 5 minutter hver gang, med PBS.
    6. Tilsæt en dråbe anti-fade monterings medium med DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) at plette kerner i hyaloid fartøjer.
    7. Placer forsigtigt en dækseddel på hyaloid for at fuldføre den flade montering.
  5. Billeddannelse og kvantificering af fladmonterede hyaloide beholdere
    1. Billede af DAPI-farvning af hyaloide-fartøjer med fluorescerende mikroskop, og sørg for, at det centrale HA er synligt (Udeluk prøverne uden HA).
    2. Identificer fartøjs filialer, som er direkte afledt af HA, og Tæl manuelt antallet af fartøjs grene til kvantificering.
  6. Visualisering af hyaloide fartøjer i tværsnit af øjne
    1. Integrer faste øjne i optimal skæring temperatur sammensatte i en passende væv skimmel, og derefter fryse de indlejrede øjnene på tør is eller gemme dem i en-20 °C fryser.
    2. Brug en kryostat-mikrotom til at lave et tværsnit af de indlejrede øjne i sektioner med en tykkelse på 12 μm ved-20 °C.
    3. Saml øjen Kors sektioner på et mikroskop slide stuetemperatur ved forsigtigt at røre vævs sektioner, som vil holde sig til diaset.
    4. Lufttørre til at dehydrere vævs sektionerne i ~ 30 min, som derefter kan opbevares i a-20 °C fryser, indtil de er klar til farvning.
    5. Skyl slide 1x med PBS for at fjerne den resterende optimale skære temperatur forbindelse på diaset.
    6. Valgfri Skub diaset ind i en passende fikserings buffer (f. eks. 4% PARAFORMALDEHYD i PBS) i 15 minutter ved stuetemperatur for yderligere fiksering, hvis det er nødvendigt.
    7. Permeabilize vævet med 0,1% Triton X-100 i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur.
    8. Forbered isolectin-IB4 farvnings buffer til farvning af blodkar.
    9. Isolectin-IB4 (500 μg) opløses og rekonstruere i pulverform med 50 mL PBS i et 50 mL centrifugeglas.
    10. Tilsæt langsomt 50 μL 1 M CaCl2 opløsning, dråbe for dråbe, i 50 ml PBS/isolectin-IB4 blandingen. Dette trin skal udføres langsomt for at undgå nedbør. Den endelige koncentration af CaCl2 er 1 μM. Tilstedeværelsen af ca2 + er nødvendig for isolectin-IB4 farvning.
    11. Påfør 30 μL isolectin-IB4-farvnings buffer på øjets tværsnit på sliden og Inkuber den i en våd æske ved 4 °C natten over.
    12. Skyl 3x, i 5 minutter hver gang, med PBS.
    13. Tilføj en dråbe anti-fade monterings medium med DAPI at plette kerner i sektioner.
    14. Placer forsigtigt en dækseddel på vævs sektionerne for at fuldføre den flade montering.
    15. Kontroller vævet under et mikroskop for at visualisere tilstedeværelsen af hyaloide fartøjer inden for eyecup.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In vivo billeddannelse af hyaloide fartøjer i levende mus
Figur 3 A afslører tværsnits udsigt over OLT billeder til nethinden og hyaloid væv i 3-måneders-gamle WT og Lrp5-/-mus, en dyremodel med vedvarende hyaloid. WT Eye viser fraværet af hyaloid væv, mens Lrp5-/-Eye viser to vedvarende hyaloide fartøjer afledt af synsnerven hoved. Figur 3 B viser FFA billeder af vedvarende hyaloide beholdere (grøn) i fluorescerende felt i 6-ugers-gamle Lrp5-/- mus. WT-musen viser ingen rester af hyaloid-fartøjer, og Lrp5-/-musen viser otte grene af hyaloide fartøjer i glaslegemet.

Ex vivo-visualisering af hyaloide-fartøjer
Figur 4 A, B demonstrerer isolerede hyaloide fartøjer som visualiseret i flade mounts, hvor vaskulære celler og tilhørende makrofager blev plettet af deres kerner med dapi farvning (blå). HA er i midten af hvert billede, og hyaloid fartøjer er afsløret af DAPI-afledte diskontinuerlig linjer. Hver linje repræsenterer et fartøj med VHP. I Lrp5-/-mus blev der observeret et større antal af de resterende hyaloide beholdere på P8 i flade beslag (figur 4A). WT-musene havde i gennemsnit 12 grene af hyaloid-fartøjer på P8, hvorimod de alders matchede Lrp5-/- unger viste omkring 25 grene af hyaloide fartøjer, hvilket udviste en signifikant forringet regression af hyaloid Vaskulaturen (figur 4 B). Desuden blev forsinket og ufuldstændig Retina-vaskulær udvikling, en anden egenskab, der ofte forbindes med persistente hyaloide fartøjer, også observeret i Lrp5-/- pup (figur 4C, D). Figur 5 viser de resterende hyaloide beholdere i tværsnit af Lrp5-/-øjne på P8, hvorimod WT-øjnene ikke viser hyaloide beholdere.

Figure 1
Figur 1 : Skematisk diagram, som skildrer den udviklingsmæssige regression af hyaloid Vaskulaturen i muse øjne. Hyaloide skibe og grene, herunder VHP, TVL, og PM, er afledt af HA, og besætte meget af rummet mellem linsen og den umodne Retina ved fødslen (p0). Hyaloid involution i mus starter med regression af PM kapillærer så tidligt som P4. På P8, PM, VHP, og TVL lag løbende regressing, sammenfaldende med den komplette dannelse af det overfladiske lag af nethinde fartøjer. Ved P12 er involveringen af PM-laget komplet, hvorimod atrofi af VHP og TVL stadig er i gang. I mellemtiden begynder et dybt lag af retinale fartøjer at danne under P7-P12. Ved P16 er regressionen af hyaloidesystemet delvist afsluttet (med de resterende TVL-kar og HA-venstre), og det mellemste lag af retinal vaskulær plexus fortsætter med at udvikle sig. Den retinale vaskulatur er fuldt moden af P21 og overtager rollen som nærende retinale væv fra hyaloid fartøjer, som nu for det meste regressed. På P21 viser glaslegemet, i fravær af hyaloide fartøjer, en klar visuel vej. Stiplede røde streger repræsenterer de regresserende fartøjer. VHP = Vasa hyaloidea propria; TVL = tunica vasculosa lentis; PM = pupil membran; HA = hyaloidearterie. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Skematisk diagram, som skildrer den sekventielle procedure af hyaloid-fartøjs isolation for ex vivo Flat-montering visualisering. A) injektion af gelatine i det enucleerede øje gennem fire Indsprøjtnings punkter (røde prikker) ved limbussen, for at størkne glaslegemet. B) fjernelse af hornhinden og synsnerven, omhyggelig dissektion af iris, og afskalning af sclera-choroid-rpe-komplekset. (C) spejlvende den resterende retinal kop med linsen for at gøre Retina side forsiden opad; derefter, injektion PBS mellem nethinden og glaslegemet til at adskille dem, efterfulgt af afskalning af nethinde lag. (D) flipping på hovedet igen resten af vævet, der indeholder linsen med den omgivende hyaloid. Løft linsen lidt for at løsne tilslutningen af TVL og VHP. E) skæring ved ha mellem TVL og VHP og fjernelse af objektivet og TVL. VHP-lag med flad montering. VHP = Vasa hyaloidea propria; TVL = tunica vasculosa lentis; PM = pupil membran; HA = hyaloidearterie. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : In vivo-billeddannelse af hyaloidekar med optisk kohærens tomografi (Oct) og andre fundus fluorescens angiografi (FFA). A: repræsentative OLT billeder af WT og Lrp5-/-mus på 3-måneders-gamle viser vedvarende hyaloide fartøjer i glasfri plads i Lrp5-/-øjne. B: repræsentative FFA billeder af WT og Lrp5-/-mus på 6-ugers-gamle. Mus blev injiceret med 1mg fluorescein natrium i 0,1 ml saltvand per mus efter anæstesi, og billeder blev taget 5 min efter injektion, fokuseret på hyaloide fartøjer i Lrp5-/-mus eller glasfri krop i WT (i fravær af hyaloide fartøjer). Persisterende hyaloide fartøjer blev visualiseret i Lrp5-/-men ikke WT øjne. Røde pile indikerer hyaloide fartøjer. Begge skala stænger: 100 μm (A). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Visualisering af forsinket hyaloid-fartøjs regression og forsinket udvikling af retinal Vaskulaturen i Lrp5-/-mus. A) repræsentative billeder af fladmonterede hyaloide beholdere,derer farves med dapi (blå) i WT og Lrp5-/-Eyes på P8. Pilene (hvid) indikerer hyaloidearterie. B) kvantificering af antallet af hyaloide beholdere, som forgrenes fra hyaloidearterie i WT og Lrp5-/-øjne. C) repræsentative fladmonterede retinaer, som er plettet med isolectin-IB4 (rød) til Vaskulaturen i WT og Lrp5-/-øjne på P8. Hvide stiplede linjer angiver Retina-kanten. Gule linjer indikerer den vaskulariserede område kant. D) kvantificering af den vaskulære dækning af den overfladiske retinale vaskulære plexus i WT og Lrp5-/-øjne. n = 8 – 12/gruppe. Skala bjælkerne i paneler A og C = 1 mm. data vises som middelværdien ± SEM. to-sidet student's t-test blev anvendt til statistisk analyse. * *P < 0,01. Dette tal ændres med tilladelse fra Wang et al.27. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Visualisering af hyaloide fartøjer i tværsnit af Lrp5-/-øjne. Repræsentative billeder af tværsnit af øjne isoleret fra WT og Lrp5-/-mus på P8. Øjnene var enucleated og indlejret i optimal skære temperatur, og sektioner blev skåret ved hjælp af cryostat. Tværsnittene blev plettet med DAPI (blå) for at vise kerner og isolectin-IB4 (rød) for at vise blodkarrene. Hvide pile indikerer hyaloide fartøjer. Skala bjælken = 500 μm. Dette tal er tilpasset med tilladelse fra Chen et al.16. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Teknikker til at vurdere og karakterisere hyaloide fartøjer er intuitive og nødvendige procedurer for at observere hyaloid fartøjets regression i dyremodeller, for at tillade undersøgelser af de mekanismer, der underliggende den vaskulære regression under udvikling. Mens den in vivo retinale billeddannelse tillader langsgående observation af hyaloideregression i det samme dyr, kan adgang til et gnaver fundus Imaging system for OCT og FFA være en begrænsende faktor. Desuden er in vivo billeddannelse i levende mus ikke muligt, før de åbner deres øjne. Derfor er denne metode ikke anvendelig under øjen udvikling i den neonatal fase. På den anden side, mens billeddannelse tværsnit af isolerede øjne kan anvendes til enhver alder af musen og har en lav teknisk barriere, det er ikke kvantitativ, når der kun er nogle få synlige hyaloide fartøjer, og chancen for at opnå et ideelt billede afhænger i høj grad af Skærevinklen (figur 5). Til sammenligning giver isolering af hyaloide fartøjer til flad Mount visualisering mulighed for komplet billeddannelse af hele hyaloid-beholderen og nøjagtig kvantificering, men der kan være tekniske udfordringer på grund af hyaloid-fartøjers delikate og skrøbelige natur. Vi håber, at protokollen, som er beskrevet i dette dokument, hjælper med at overvinde disse udfordringer.

Flere kritiske trin i hyaloid isolation protokol omfatter injektion af gelatineopløsning, fjernelse af nethinden, og den endelige flade montering. Den tekniske vanskelighed ved at håndtere hyaloid Vaskulaturen ligger i dens delikate natur, den næsten flydende-lignende tilstand af glaslegemet, hvor hyaloid fartøjer bor, og dens tætte forbindelse med den tilstødende linse og nethinden. Intravenøs gelatineopløsning eller er nøglen til at størkne den glasholdige krop indeholdende hyaloide fartøjer og dermed gøre deres tekstur fastere for lettere dissektion og håndtering. Gelatine er et geleringsmiddel danner gennemsigtige elastiske thermoreversible geler. Ved at injicere den flydende form af gelatine (ved stuetemperatur eller ved 37 °C) ind i glaslegemet og afkøles til en lavere temperatur (4 °C), omdannes glaslegemet til et fastere gel-bæger. Udførelse af flere gelatine injektioner i øjet tillader fuld dispersion af en tilstrækkelig mængde af gelatine i glaslegemet, at danne en ensartet og rund prægelatineret hyaloid vævs Cup. En anden teknisk vanskelighed ligger i at fjerne nethinden uden at beskadige hyaloid væv. I modsætning til choroid, som er relativt let at dissekere fra hinanden, den gelatiniserede Glasfiber krop indeholdende hyaloid fartøjer er udfordrende at adskille fra den nærliggende nethinden uden at beskadige hyaloid. Vi fandt, at indsprøjtning PBS i rummet mellem glasfiber kroppen og nethinden genereret en flydende buffer lag, hvilket gør det meget lettere at adskille disse to væv. Dette er noget svarende til hydrodissection teknik, der anvendes i kataraktkirurgi til at adskille kapslen og grå stær cortex. Den endelige flade montering er det sidste teknisk vanskelige trin i protokollen. Opvarmning af gelatiniseret hyaloid væv i en PBS dråbe på en slide varmere omdanner det tilbage til en mere flydende-lignende form til at tillade lettere flad montering. Korrekt arrangement og orientering af hyaloid gel Cup er stadig afgørende for at sikre sin selv fladning efter smeltning og tørring.

Protokollen om isolering af hyaloid-fartøjer kan ændres yderligere på flere måder. Koncentrationen af gelatineopløsning vi brugte er 5%, men højere eller lavere koncentrationer kan også arbejde, afhængigt af præference for forskeren til at opnå en fastere eller blødere tekstur til håndtering. DAPI-farvning af cellulært kerner kan også modificeres med isolectin-IB4 eller andre endotelceller eller makrofag markører, for bedre at skelne vaskulære endotelcelletal fra makrofager. En lille advarsel: den flade monterede hyaloide fartøjer er meget delikat og kun løst overføres til diaset; Derfor skal hyaloidediasene håndteres meget forsigtigt og forsigtigt, hvis der er behov for skylning under farvning. Denne isolations protokol har også sine begrænsninger, herunder kompleksiteten ved at udføre den fine dissektion og vanskeligheden ved langtidsbevaring af prøverne på grund af arten af det skrøbelige væv. Ikke desto mindre er isolerende og Flat-montering hyaloide fartøjer stadig den mest omfattende og intuitive måde at studere hyaloid vaskulatur, at fremme okulær og angiogenese undersøgelser10,17,27, 29,30,31.

Hyaloid Vaskulaturen giver en fremragende eksperimentel model for at studere udviklende fartøjets vækst og regression, relevant for forskningsområder i oftalmologi, angiogenese, og programmeret celledød, som dette papir har til formål at hjælpe. Fremtidige ændringer af isolations protokollen kan rettes mod at forbedre gennemførligheden af en teknisk dissektions procedure. Samlet set er den kombinerede in vivo-billeddannelse og ex vivo-isolering af hyaloid-fartøjer en fordelagtig metode til at muliggøre fuld vurdering og karakterisering af hyaloide fartøjer i mus som en nyttig model for vaskulær regression.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud (R01 EY024963 og EY028100) til J.C. Z.W. blev støttet af en Knights Templar Eye Foundation karriere starter Grant. Den hyaloide isolations procedure, der er beskrevet i dette studie, blev tilpasset med ændringer fra protokoller, der er generøst delt af DRs. Richard lang, Toshihide Kurihara og Lois Smith, som forfatterne er taknemmelige for.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AK-Fluor (fluorescein injection, USP) Akorn 17478-253-10
Anti-CD31 antibody Abcam ab28364
Antifade mounting medium Thermo Fisher S2828
Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Artificial tear eyedrop Systane N/A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2058
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory Stock NO: 000664
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C1016
Cryostat Leica CM3050S
Cryostat Leica CM3050 S
Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop Cyclomydril N/A
Gelatin  Sigma-Aldrich G9382
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11008
Heating board Lab-Line Instruments Inc. N/A
Isolectin GS-IB4, 594 conjugate ThermoFisher Scientific I21413
Ketamine hydrochloride injection KetaVed NDC 50989-996-06
Lrp5-/- mice The Jackson Laboratory Stock NO. 005823 Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA
Micron IV and OCT Phoenix Research Labs N/A Imaging software: InSight
Microscope Zeiss discovery v8
Microsurgery forceps Scanlan International 4004-05
Microsurgery scissors Scanlan International 6006-44
Optimal cutting temperature compound Tissue-Tek 4583
Optimal cutting temperature compound Agar Scientific AGR1180
Paraformaldehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15710
Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) Fisher Scientific 12-20
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) Teknova P0496
Slide cover glass Premiere 94-2222-10
Superfrost microscope slides  Fisherbrand 12-550-15
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Xylazine sterile solution Akorn: AnaSed NDC: 59399-110-20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
  2. Anand-Apte, B., Hollyfield, J. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. Besharse, J., Bok, D. , Academic Press. Oxford, UK. (2011).
  3. Hobbs, R. P., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. Hartnett, M. E. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. (2013).
  4. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
  5. Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
  6. Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
  7. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  8. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  9. Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
  10. Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
  11. Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
  12. Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
  13. Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
  14. Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
  15. Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
  16. Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).
  17. Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
  18. Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
  19. Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
  20. Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
  21. Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
  22. Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
  23. Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
  24. McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
  25. Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
  26. Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18 (2001).
  27. Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
  28. Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).
  29. Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
  30. Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
  31. Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).

Tags

Medicin øje hyaloid fartøjer vaskulær regression fladt beslag udvikling LRP5 WNT
Vurdering og karakterisering af Hyaloide fartøjer i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S.,… More

Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Assessment and Characterization of Hyaloid Vessels in Mice. J. Vis. Exp. (147), e59222, doi:10.3791/59222 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter