Summary
Detta protokoll beskriver både in vivo och ex vivo metoder för att fullt visualisera och karakterisera hyaloid fartyg, en modell av vaskulär regression i mus ögon, med hjälp av optisk koherens tomografi och fundus fluorescein angiografi för levande Imaging och ex vivo isolering och efterföljande platt fäste av hyaloid för kvantitativ analys.
Abstract
I ögat, de embryonala hyaloid fartygen ger näring åt att utveckla linsen och näthinnan och regrediera när näthinnans kärl utvecklas. Ihållande eller misslyckad regression av hyaloid fartyg kan ses vid sjukdomar som ihållande hyperplastiska primära glaskroppen (PHPV), vilket leder till en blockerad ljus Stig och försämrad visuell funktion. Förstå mekanismerna bakom hyaloid Vessel regression kan leda till nya molekylära insikter i den vaskulära Regressions processen och potentiella nya sätt att hantera sjukdomar med ihållande hyaloid fartyg. Här beskriver vi procedurerna för avbildning hyaloid i levande möss med optisk koherens tomografi (ULT) och fundus fluorescein angiografi (FFA) och ett detaljerat tekniskt protokoll för isolering och platt-montering hyaloid ex vivo för kvantitativ analys. Low-density lipoprotein receptor-relaterat protein 5 (LRP5) knockout möss användes som en experimentell modell av ihållande hyaloid fartyg, för att illustrera teknikerna. Tillsammans kan dessa tekniker underlätta en grundlig bedömning av hyaloid fartyg som en experimentell modell av vaskulär regression och studier på mekanismen för ihållande hyaloid fartyg.
Introduction
Blodtillförseln i ögat är viktigt för att säkerställa den normala utvecklingen av näthinnan och omgivande ögon vävnader och att utrusta en ordentlig visuell funktion. Det finns tre vaskulära bäddar i ögat: retinal vasculature, åderhinnan, och ett övergående embryonala cirkulations nätverk av hyaloid fartyg. Utvecklingen av den okulära vaskulaturen kräver rumslig och tidsmässig koordination genom embryogenes och vävnads mognad. Bland de tre vaskulära sängarna är hyaloid kärlsystemet den första funktionella blod försörjningssystem för att ge näring och syre till den nybildade embryonala linsen och utveckla näthinnan. Hyaloid fartyg regrediera samtidigt som näthinnan vasculatures utvecklas och mogna1. Regression av hyaloid kärlsystemet är avgörande för att möjliggöra en tydlig visuell väg för utveckling av visuell funktion; Därför är denna vaskulär regression process lika viktigt som tillväxten av retinal vasculature. Försämrad hyaloid regression kan leda till ögonsjukdomar. Dessutom ger regression av hyaloid fartyg ett modellsystem för att undersöka cellulära och molekylära mekanismer som är involverade i regleringen av vaskulär regression, som kan ha konsekvenser för angiogena regleringen i andra organ samt.
Den hyaloid vaskulatur, som härrör från hyaloid artär (ha), består av Vasa hyaloidea propria (VHP), Tunica vasculosa lentis (TVL), och pupill membran (PM). Det ger näring till den växande näthinnan, den primära glaskroppen, och linsen under embryonal utveckling2. På grund av HA, grenar VHP anteriorly genom glaskroppen till linsen. Den TVL koppar den bakre ytan av linsen kapseln, och anastomoser till PM, som ansluter till den främre ciliär artärer, som täcker den främre ytan av linsen2,3, vilket resulterar i bildandet av ett nätverk av fartyg i PM 3 , 4 , 5. intressant, det finns inga vener i hyaloid vasculature, och systemet använder sig av koroidal vener att utföra venös dränering.
I det mänskliga embryot, den hyaloid kärlsystemet är nästan klar på ungefär den nionde graviditetsveckan och börjar regrediera när de första retinala fartyg visas, under den fjärde månaden av dräktifiering2. Börjar med atrofi av VHP, regression av kapillära nätverk av TVL, PM, och slutligen, ha inträffar därefter2,3. Under tiden börjar den primära glaskroppen dras in och den sekundära glaskroppen bildas, sammansatt av de extracellulära matrix komponenter, inklusive kollagenfibrer. Genom den sjätte graviditetsmånaden, den primära glaskroppen reduceras till en liten transparent kanal som sträcker sig från synnerven skivan till linsen, kallas Cloquet kanal eller hyaloid kanalen, och den sekundära glaskroppen blir den viktigaste komponenten i den bakre segmentet 2 , 3. den hyaloid cirkulationen försvinner mestadels på 35 till 36 graviditetsveckor, strax före födseln3.
Till skillnad från människor, där hyaloid kärlsystemet är helt regredierat vid födseln, musen hyaloid kärlsystemet börjar regrediera efter födseln. Eftersom musen näthinnan föds avaskulära och retinala fartyg utvecklas postnatalt, hyaloid fartyg regrediera samtidigt från postnatal dag (P) 4 och är oftast helt regredierat av P216 (figur 1). PM försvinner först mellan P10 och P12 och VHP försvinner mellan P12 och P16, medan ett litet antal TVL-och HA-celler finns kvar även på P16, och med P21 är hyaloid vaskulär system regression nästan komplett6. Under tiden börjar retinal kärlsystemet utvecklas efter födseln. Det ytliga skiktet av vaskulär plexus sträcker sig helt till den perifera näthinnan vid P7-P8, det djupa skiktet (beläget i den yttre plexiform skiktet) utvecklas från P7-P12, och slutligen, den mellanliggande plexus i inre plexiform skiktet utvecklas mellan P12 och p157 . Som retinal kärlsystemet utvecklar, det gradvis ersätter funktionen av samtidigt tillbakagång hyaloid fartyg, ger näring och syre till att utveckla ögat. Den postnatala förekomsten av hyaloid Vessel regression hos möss ger en lättillgänglig experimentell modell för att observera och studera den hyaloida vaskulaturen, samt den molekylära basen som reglerar kärl Regressions processer under både fysiologiska och patologiska tillstånd8.
Fel på hyaloid regression kan ses vid sjukdomar som phpV, vilket är en sällsynt medfödd utveckling anomali i ögat till följd av en misslyckad eller ofullständig regression av embryologiska, primära glaskroppen och hyaloid kärlsystemet9. Mekanismerna som reglerar Regressions processen för hyaloid kärlsystemet är komplicerade och studeras i stor utsträckning. En stor molekyl väg som är nödvändig för den normala regressionen av hyaloid-kärl är WNT-signalvägen10, eftersom genetiska mutationer i denna väg som påverkar både WNT-ligand och receptorer har kopplats till phpV hos människor9. Experimentella studier identifierade en WNT ligand, Wnt7b, som produceras av makrofager runt hyaloid fartyg i utvecklingsländerna ögat att medla denna Regressions process. Wnt7b aktiverar WNT signalering genom att binda med receptorerna frizzled4 (FZD4)/LRP5 i angränsande endotelceller att initiera Cell apoptos, vilket leder till regression av hyaloid fartyg10. Som ett resultat, Wnt7b-brist möss visar en uthållighet av hyaloid fartyg10. På samma sätt binder en icke-konventionell WNT ligand, Norrin (kodad av NDP -genen), också till FZD4/LRP5 för att inducera hyaloid Vessel regression under utvecklingen. NDPy/-, Lrp5-/-, och Fzd4-/- möss alla Visa uppskjuten hyaloid Vessel regression, stödja en kritisk reglerande roll WNT signalering11,12, 13,14,15,16. Dessutom, en annan WNT coreceptor LRP6 överlappar med LRP5 i sin funktion på modulerande WNT signalering väg i hyaloid vaskulära endotelceller17. Andra faktorer som också kan bidra till hyaloid regression inkluderar hypoxi-inducerbar faktor18,19, vaskulär endotelial tillväxtfaktor20,21, kollagen-1822, 23, ARF24, angiopoietin-225, och ben morfogenetiska protein-426. I detta dokument använder vi Lrp5-/- möss som en modell av ihållande hyaloid fartyg för att demonstrera teknikerna för att bedöma och karakterisera hyaloid kärlsystemet genom både in vivo-och ex vivo-metoder.
Visualisering av hyaloid kärlsystemet in vivo och ex vivo är avgörande för att studera mekanismerna för hyaloid Vessel regression. Nuvarande metoder för att observera hyaloid kärlsystemet fokuserar främst på att visualisera och analysera VHP och ha, genom Oct och FFA bilder, öga tvärsnitt, och hyaloid Flat Mount. OCT och FFA är kraftfulla in vivo imaging verktyg, vilket möjliggör longitudinell observation i levande djur efter att de har öppnat sina ögon. Dessutom ger isolerade hyaloid Flat Mount visualisering av hela hyaloid kärlsystemet och ett sätt att uppnå en korrekt kvantifiering av fartygsnummer. Men den känsliga och bräckliga karaktären hos hyaloid fartyg och de resulterande tekniska svårigheterna med dess isolering kan ha begränsat dess användning i ögonforskning något10,17,27. I detta dokument ger vi ett detaljerat protokoll för visualisering av hyaloid fartyg, som kombinerar både in vivo Live retinal Imaging och ex vivo isolerade hyaloid Flat Mount för att förbättra genomförbarheten av dessa tekniker. Detta protokoll har anpassats med modifiering och expansion från tidigare publikationer om in vivo-metoden för levande fundus och OCT Imaging28 och ex vivo-metoden för isolerade hyaloid Flat Mount11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur behandlades i enlighet med föreningen för forskning i vision och oftalmologi (ARVO) uttalande för användning av djur i oftalmisk och vision forskning för djurförsök, enligt riktlinjerna från National Institutes of Health ( NIH) om vård och användning av djur för experimentella förfaranden och de förordningar som fastställts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) på Boston Children ' s Hospital. Lrp5-/- möss (lager nr 005823; Jackson Laboratory) och dess Wild-Type (WT) kontroll C57BL/6J möss (Stock nr 000664; Jackson Laboratory) användes för denna studie.
1. del I: in vivo-avbildning av hyaloid-kärl med hjälp av ett retinalt avbildningssystem från gnagare
- Beredning av möss anestesi och elev dilatation
- Välj möss.
- Använd möss som är äldre än P12 (efter att de har öppnat ögonen) för näthinne avbildning; båda könen är lämpliga.
- Som önskat, bild Mutant möss med fördröjd hyaloid regression (och deras WT kontroller) hela vuxenlivet. WT-möss som är äldre än 3 veckor kan inte uppvisa mycket detekterbara kvarvarande hyaloid-kärl, därav P12 – P21 är idealisk för avbildning kvarvarande synliga WT hyaloid.
- Förbered en ketamin/xylazin blandning för anestesi.
- Ta 2,3 mL av ketamin stamlösningen (100 mg/mL) och 0,7 mL av xylazin stamlösning (20 mg/mL) och tillsätt 20 mL steril saltlösning (0,9% natriumklorid) att göra en fungerande lösning av en ketamin/xylazin blandning (10 mg/mL ketamin och 0,6 mg/mL xylazin).
- Söva möss genom intraperitonealt injicering av ketamin/xylazin i en volym på 8x musens kroppsvikt (t. ex. en 20 g mus behöver 160 μL ketamin/xylazine arbetslösning blandning för att uppnå en arbets dos av ketamin [80 mg/kg kroppsvikt] och xylazin [4,8 mg/kg kroppsvikt] blandning).
- Applicera en droppe elev-dilaterande läkemedelslösning (se tabell över material) till varje öga för att vidga musens elever omedelbart efter anestesi.
- Bedöma nivån av anestesi genom pedal reflex (fast bakbenet tå nypa). Vänta tills musen är tillräckligt sövda (ingen pedal reflex) och dess elever är allmänt vidgade.
- Välj möss.
- Optisk koherens tomografi avbildning av hyaloida kärl
- Återfukta musens hornhinnor med konstgjorda tårar, och sedan placera musen på placeringen scenen.
- Försiktigt kontakta musens hornhinna med linsen av OCT sonden. Justera musen och sond så att synnerven huvudet är i mitten av synfältet i fundus bilden, att vägleda OCT Imaging.
Obs: för mer information om den allmänna inställningen av ett gnagare retinal Imaging system (se tabell över material) och justera musens position, se Gong et al.28. - Justera fokus för att uppnå optimala bilder av OCT.
- Justera vinkeln på den angivna linjen i ULT bildprogram (se tabell över material) för att avslöja ihållande hyaloid fartyg och sedan ta bilder.
- F undus f luorescein en en ngiography avbildning av hyaloid-kärl
- Bered en fluorescein lösning: Tillsätt 9 mL steril fosfat-buffrad saltlösning (PBS) till 1 mL fluorescein lösning (lager koncentration: 100 mg/mL). Koncentrationen av den slutliga arbetslösningen är 10 mg/mL.
- Intraperitonealt injicera fluorescein arbetslösning (5 μL/g kroppsvikt).
- Återfukta musens hornhinna med konstgjorda tårar, och sedan placera musen på placeringen scenen.
- Placera linsen i micron IV retinal Imaging Mikroskop för att göra direkt skonsam kontakt med musen hornhinnan. Justera justeringen något för att placera synnerven huvudet i mitten av Vyfältet.
- Byt Mikroskop filtret till en grön Lysrörs kanal.
- Fokusera på ihållande hyaloid fartyg att ta bilder.
- Ta flera bilder efter 1 min, 3 min, 5 min, och 10 min (inte mer än 10 min) efter injektionen för att bestämma den bästa tidspunkten (signal-till-bakgrund förhållande) för observation hyaloid fartyg. Slutföra FFA förfarande inom 10 min, varefter fluorescein kan bli alltför diffus och göra fartygen osynliga.
- Återhämtning av möss från anestesi
- Efter procedurerna, hålla möss på en varm värmedyna.
- Vänta tills mössen är rörliga igen för att returnera dem till mus korgen.
2. del II: ex vivo visualisering av hyaloida kärl
- Beredning av fasta mus ögon
- Välj möss i rätt ålder.
Obs: neonatal möss offras normalt på P8 för hyaloid dissektion. Båda könen är lämpliga. Muterade möss med en fördröjd hyaloid regression (och deras respektive WT-kontroller) kan dissekeras och analyseras i hela vuxenlivet. - Euthanize möss genom exponering för CO2.
- Enucleate musens ögon av Blunt dissektion.
- Öppna ögonlocken bred med mikrokirurgi tång för att ge tillgång till ögongloben. Placera böjda mikrokirurgi pincett under jordklotet i omloppsbana att greppa synnerven utan att klämma ögongloben. Dra försiktigt och ta bort ögongloben med pinps.
- Alternativt dissekera ögongloben genom att använda mikrokirurgi sax för att försiktigt skära parallellt med Globen från de fyra sidorna mot baksidan av omloppsbana och separera världen från omgivande bindväv.
- Doppa ögonen i 4% PARAFORMALDEHYD i PBS buffert för 30 min vid rumstemperatur för fixering.
- Överför de fasta ögongloberna till iskallt PBS-buffert.
Obs: ögongloberna kan förvaras i PBS vid 4 ° c i upp till 1 vecka.
- Välj möss i rätt ålder.
- Inbäddning av hyaloid kärl med gelatin injektion
- Bered en 5% (w/v) gelatinlösning.
- Väg ut 50 mg gelatin.
- Lös upp gelatinet i 1 mL destillerat vatten.
- Inkubera gelatinlösningen i ett 37 ° c vattenbad tills den är helt upplöst. Förvara lösningen i 37 ° c vatten tills den används.
Anmärkning: en större sats lösning kan förberedas och förvaras vid 4 ° c som alikvoter. Varje gång före användning, lösningen måste värmas i 37 ° c vattenbad för att uppnå en tydlig konsistens.
- Injicera 50 μL gelatinlösning i glaskroppen vid limbus under en dissektion Mikroskop; Upprepa injektionen 3x på olika platser för att göra totalt fyra injektioner, jämnt fördelade runt limbus (figur 2a).
- Inkubera ögongloberna i ett kylskåp på 4 ° c eller på is i 30 minuter för att stelna det injicerade gelatinet i glaskroppen.
- Bered en 5% (w/v) gelatinlösning.
- Dissektion och isolering av hyaloid kärl
Anmärkning: se figur 2B-E.- Placera ögongloberna i en petriskål som innehåller PBS för att hålla vävnaden från torkning. Gör ett snitt med mikrokirurgi sax på limbus och ta bort hornhinnan.
- SNIP och ta bort synnerven.
- Under en dissektion Mikroskop, använda två par pinpett att skala bort och kassera sklera, åderhinnan, och retinal pigment epitel (RPE) skikt och ta bort Iris.
- Med optisk-nerven sidan av näthinnan vänd uppåt och linsen sidan ner, injicera 50 μl av PBS strax under näthinnan koppen att möjliggöra ackumulering av PBS buffert mellan gelatiniserad glaskroppen och näthinnan.
- Försiktigt dra av och ta bort näthinnan kopp och ciliär kroppen från glaskroppen med mikrokirurgi tång.
- Överför med hjälp av en överföringspipett gelatinkoppen som innehåller den hyaloid vävnaden nedsänkt i PBS till en Mikroskop bild
- Vänd resten av vävnaden (lins/hyaloid) över, så linsen sidan är vänd uppåt.
- Lyft linsen och försiktigt lossa anslutningen mellan linsen/TVL och VHP, och sedan klippa HA med mikrokirurgi sax för att ta bort linsen-TVL. Håll VHP-delen av hyaloid Cup för Flat Mount.
- Platt montering och färgning av hyaloid kärl
- Skölj försiktigt hyaloid Cup med PBS på bilden för att ta bort alla dissektion skräp.
- Se till att hyaloid Cup flyter på bilden i adekvat PBS-lösning.
- Försiktigt ordna och justera positionen för gelatiniserad hyaloid Cup med mikrokirurgi tång, med kanten av koppen vänd nedåt på bilden, för att uppnå optimalt utseende efter smältning.
- Placera bilden med hyaloid Cup nedsänkt i PBS på en Slide varmare vid 37 ° c, vänta tills gelatin smälter och hyaloid flackar, och ta bort bilden när den är knappt torr (inte över-torr).
- Valfritt Immunostain de hyaloid kärlen
- Gör blockering och penetrerande buffert (t. ex. 5% bovint serum albumin [BSA] och 0,1% Triton X-100 i PBS-buffert). Tillsätt 50 μL blockerande buffert på en plattmonterad hyaloid-isolering och inkubera i rumstemperatur i 30 minuter.
- Applicera 50 μL primär antikropp (t. ex. CD31) (1:100 spädning i blockeringsbuffert) på ett plant fäste av hyaloid isolation, och inkubera sedan i en våt låda vid 4 ° c över natten.
- Skölj försiktigt 3x, för 5 min varje gång, med PBS.
- Applicera 50 μL sekundär antikropp (t. ex. get anti-Rabbit sekundär antikropp-Alexa 488, 1:100 spädning) på den hyaloid Flat Mount och inkubera den i rumstemperatur under 1 h.
- Skölj försiktigt 3x, för 5 min varje gång, med PBS.
- Lägg till en droppe anti-Fade monteringsmedium med DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) för att färga kärnor i hyaloid fartyg.
- Placera försiktigt en täckslip på hyaloid för att slutföra det platta fästet.
- Avbildning och kvantifiering av plattmonterade hyaloida kärl
- Bild DAPI färgning av hyaloid fartyg med ett fluorescerande Mikroskop och se till att den centrala HA är synlig (utesluta proverna utan HA).
- Identifiera fartygs grenar som är direkt härledda från hektar och manuellt räkna antalet fartygs grenar för kvantifiering.
- Visualisering av hyaloid kärl i tvärsnittet av ögon
- Bädda in fasta ögonglober i optimal skärtemperatur förening i en lämplig vävnad mögel, och sedan frysa de inbäddade ögonen på torris eller förvara dem i a-20 ° c frys.
- Använd en kryostatmikrotom för att göra ett tvärsnitt av de inbäddade ögonen i delar av 12 μm tjocklek vid-20 ° c.
- Samla ögat tvärsnitt på ett Mikroskop glida rumstemperatur genom att försiktigt röra vävnads sektionerna, som kommer att följa bilden.
- Lufttorka för att torka av vävnads sektionerna för ~ 30 min, som sedan kan förvaras i en-20 ° c frys tills den är klar för färgning.
- Skölj bilden 1x med PBS för att ta bort den återstående optimala skärtemperatur föreningen på bilden.
- Valfritt Sänk ned bilden i en lämplig fixeringsbuffert (t. ex. 4% PARAFORMALDEHYD i PBS) i 15 minuter vid rumstemperatur för ytterligare fixering om det behövs.
- Permeabilize vävnaden med 0,1% Triton X-100 i PBS för 30 min vid rumstemperatur.
- Förbered isolectin-IB4 färgbuffert för blodkärlens färgning.
- Lös upp och Rekonstituera isolectin-IB4 (500 μg) pulver med 50 mL PBS i ett 50 mL centrifugerör.
- Tillsätt långsamt 50 μL 1 M CaCl2 -lösning, droppe för droppe, i 50 ml PBS/isolectin-IB4-blandningen. Detta steg måste utföras långsamt för att undvika nederbörd. Den slutliga koncentrationen av CaCl2 är 1 μm. Förekomst av ca2 + krävs för isolectin-IB4 färgning.
- Applicera 30 μL isolectin-IB4 färgbuffert på ögonkorsets sektioner på bilden och inkubera i en våt låda vid 4 ° c över natten.
- Skölj 3x, för 5 min varje gång, med PBS.
- Lägg till en droppe anti-Fade monteringsmedium med DAPI för att färga kärnor i sektionerna.
- Placera försiktigt en täckslip på vävnads sektionerna för att slutföra plattfästet.
- Kontrollera vävnaden under ett mikroskop för att visualisera närvaron av hyaloid kärl i ögonmussla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo-avbildning av hyaloid-kärl i levande möss
Figur 3 A avslöjar tvärsnitts utsikt över Oct-bilder för näthinnan och hyaloid vävnader i 3 månader gamla WT och Lrp5-/-möss, en djurmodell med ihållande hyaloid. WT Eye visar frånvaron av hyaloid vävnad, medan Lrp5-/-Eye visar två ihållande hyaloid kärl som härstammar från synnerven huvudet. Figur 3 B visar FFA bilder av ihållande hyaloid fartyg (grön) i fluorescerande fält i 6-veckors-gamla Lrp5-/- möss. WT mus visar ingen återstod av hyaloid fartyg, och Lrp5-/-mus visar åtta grenar av hyaloid fartyg i glaskroppen.
Ex vivo visualisering av hyaloida kärl
Figur 4 A, B visar isolerade hyaloid fartyg som visualiseras i platta fästen, där vaskulära celler och associerade makrofager färgas av deras kärnor med DAPI färgning (blå). HA är i mitten av varje bild, och hyaloid fartyg avslöjas av DAPI-härledda diskontinuerliga linjer. Varje rad representerar ett fartyg av VHP. I Lrp5-/-möss observerades ett högre antal kvarvarande hyaloid-kärl vid P8 i plana fästen (figur 4a). WT-möss hade i genomsnitt 12 grenar av hyaloid-kärl på P8, medan de åldersmatchade Lrp5-/- ungarna uppvisade cirka 25 grenar av hyaloid kärl, vilket visar en signifikant försämrad regression av hyaloid vasulatur (figur 4 B). Dessutom, fördröjd och ofullständig näthinnan vaskulär utveckling, en annan egenskap som ofta förknippas med ihållande hyaloid fartyg, observerades också i Lrp5-/- PUP (figur 4C, D). Figur 5 visar de kvarvarande hyaloida kärlen i tvärsnitt av Lrp5-/-Eyes på P8, medan WT-ögonen inte visar hyaloid-kärl.
Figur 1 : Schematiskt diagram som skildrar den utvecklande regressionen av hyaloid kärlsystemet i mus ögon. Hyaloid fartyg och grenar, inklusive VHP, TVL, och PM, härrör från HA, och upptar mycket av utrymmet mellan linsen och omogna näthinnan vid födseln (P0). Hyaloid Involution i möss börjar med regression av PM kapillärer så tidigt som P4. Vid P8, PM, VHP, och TVL skikt är ständigt regressing, sammanfaller med den fullständiga bildandet av det ytliga skiktet av retinala fartyg. Genom P12 är Involution av PM-skiktet komplett, medan atrofi av VHP och TVL fortfarande pågår. Under tiden börjar ett djupt lager av retinala kärl bildas under P7-P12. Genom P16, är regressionen av hyaloid systemet delvis avslutad (med de återstående TVL fartyg och HA kvar), och det mellanliggande skiktet av retinal vaskulär plexus fortsätter att utvecklas. Retinal kärlsystemet är helt mogen av P21 och tar över rollen av närande retinala vävnader från hyaloid fartyg, som nu mestadels regredierat. Vid P21, glaskroppen, i avsaknad av hyaloid fartyg, visar en tydlig visuell väg. Streckad röd linje representerar de tillbakagång fartygen. VHP = Vasa hyaloidea propria; TVL = Tunica vasculosa lentis; PM = pupill membran; HA = hyaloid artär. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Schematiskt diagram som skildrar det sekventiella förfarandet för hyaloid fartygs isolering för ex vivo platt montering visualisering. A) injektion av gelatin i det enukleerade ögat genom fyra injektionsställen (röda prickar) vid limbus, för att stelna glaskroppen. (B) avlägsnande av hornhinnan och synnerven, noggrann dissektion av iris, och peeling av Sclera-choroid-RPE komplex. (C) vända den återstående retinal kopp med linsen för att göra näthinnan sidan vänd uppåt; sedan, injicera PBS mellan näthinnan och glaskroppen för att separera dem, följt av peeling av näthinnans skikt. (D) vänd upp och ned igen resten av vävnaden, som innehåller linsen med omgivande hyaloid. Att lyfta linsen något för att lossa anslutningen av TVL och VHP. E) skärning vid ha mellan TVL och VHP och avlägsnande av linsen och TVL. Platt-montering VHP-skikt. VHP = Vasa hyaloidea propria; TVL = Tunica vasculosa lentis; PM = pupill membran; HA = hyaloid artär. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : In vivo-avbildning av hyaloid-kärl med optisk koherens tomografi (ULT) och fundus fluorescens angiografi (FFA). A: representativa Oct bilder av WT och Lrp5-/-möss vid 3-månaders-gamla visar ihållande hyaloid fartyg i glaskroppen i Lrp5-/-ögon. B: representativa FFA bilder av WT och Lrp5-/-möss vid 6-veckors-gammal. Möss injicerades med 1 mg fluoresceinnatrium i 0,1 ml saltlösning per mus efter anestesi, och bilder togs 5 min efter injektion, fokuserade på hyaloid kärl i Lrp5-/-möss eller glaskroppen i WT (i avsaknad av hyaloid kärl). Ihållande hyaloid fartyg visualiserades i Lrp5-/-men inte WT ögon. Röda pilar indikerar hyaloid kärl. Båda skalstreck: 100 μm (a). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Visualisering av fördröjd hyaloid Vessel regression och fördröjd retinal kärlsystemet utveckling i Lrp5-/-möss. (A) representativa bilder av plattmonterade hyaloida fartyg färgade med DAPI (blått) i WT och Lrp5-/-Eyes på P8. Pilar (vit) indikerar hyaloid artär. (B) kvantifiering av antalet hyaloid fartyg som förgrenas från hyaloid artär i WT och Lrp5-/-Eyes. C) representativa flatmonterade retinor som färgas med isolectin-IB4 (röd) för vasulaturen i WT och Lrp5-/-Eyes vid P8. Vita streckade linjer indikerar näthinnans kant. Gula linjer indikerar den vaskulariserade områdeskanten. (D) kvantifiering av vaskulär täckning av ytliga retinal vaskulär plexus i WT och Lrp5-/-Eyes. n = 8 – 12/grupp. Skal staplarna i panelerna A och C = 1 mm. data visas som medelvärdet ± SEM. t-test för tvåsidiga studenter användes för statistisk analys. * *P < 0,01. Denna siffra är modifierad med tillstånd från Wang et al.27. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Visualisering av hyaloid fartyg i tvärsnitt av Lrp5-/-Eyes. Representativa bilder av tvärsnitt av ögon isolerade från WT och Lrp5-/-möss vid P8. Ögonen var enucleated och inbäddade i optimal skärtemperatur, och sektioner klipptes med kryostat. Tvärsnittet färgas med DAPI (blått) för att Visa atomkärnor och isolectin-IB4 (röd) för att Visa blodkärlen. Vita pilar indikerar hyaloid kärl. Skalstapeln = 500 μm. Denna siffra är anpassad med tillstånd från Chen et al.16. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoder för att bedöma och karakterisera hyaloid-kärl är intuitiva och nödvändiga procedurer för att iaktta hyaloid Vessel regression i djurmodeller, för att möjliggöra studier av mekanismerna bakom vaskulär regression under utvecklingen. Medan in vivo retinal Imaging möjliggör longitudinell observation av hyaloid regression i samma djur, kan tillgång till en gnagare fundus Imaging system för OCT och FFA vara en begränsande faktor. Dessutom är in vivo Imaging i levande möss inte möjligt innan de öppnar sina ögon. Därför är denna metod inte tillämplig under ögon utveckling i neonatal stadiet. Å andra sidan, medan Imaging tvärsnitt av isolerade ögon kan användas för alla åldrar av musen och har en låg teknisk barriär, det är inte kvantitativ när det finns bara några synliga hyaloid fartyg, och chansen att få en idealbild beror till stor del på snittnings vinkeln (figur 5). I jämförelse, isolering av hyaloid fartyg för platt Mount visualisering möjliggör fullständig avbildning av hela hyaloid fartyget och korrekt kvantifiering, men tekniska utmaningar kan förekomma på grund av den känsliga och bräckliga natur hyaloid fartyg. Vi hoppas att protokollet som beskrivs i detta dokument hjälper till att övervinna dessa utmaningar.
Flera kritiska steg i hyaloid isolerings protokoll inkluderar injektion av gelatin lösningen, avlägsnande av näthinnan, och den slutliga platt montering. Den tekniska svårigheten att hantera hyaloid kärlsystemet ligger i dess känsliga natur, den nästan flytande-liknande tillstånd av glaskroppen där hyaloid fartyg bor, och dess nära samband med den intilliggande linsen och näthinnan. Injicera gelatin lösning intravitrealt är nyckeln till stelnar glaskroppen som innehåller hyaloid fartyg och därmed göra deras textur fastare för enklare dissektion och hantering. Gelatin är ett geleringsmedel som bildar transparenta elastiska termoreversibla Gels. Genom att injicera den flytande formen av gelatin (vid rumstemperatur eller vid 37 ° c) i glaskroppen och kyla den till en lägre temperatur (4 ° c) förvandlas glaskroppen till en fastare gel kopp. Utföra flera gelatin injektioner i ögat tillåter full spridning av en tillräcklig mängd av gelatin i glaskroppen, att bilda en enhetlig och rund gelatiniserad hyaloid vävnad kopp. En annan teknisk svårighet ligger i att ta bort näthinnan utan att skada hyaloid vävnad. Till skillnad från åderhinnan, som är relativt lätt att dissekera isär, är den gelatiniserade glaskroppen som innehåller hyaloid fartyg utmanande att separera från den närliggande näthinnan utan att skada hyaloid. Vi fann att injicera PBS i utrymmet mellan glaskroppen och näthinnan genererade ett flytande buffertskikt, vilket gör det mycket lättare att separera dessa två vävnader. Detta är något liknande den hydrodissektion teknik som används i kataraktkirurgi för att separera kapseln och katarakt cortex. Den slutliga platta monteringen är det sista tekniskt svåra steget i protokollet. Uppvärmningen av gelatiniserad hyaloid vävnad i en PBS dropp på en bild varmare omvandlar den tillbaka till en mer flytande-liknande form för att underlätta platt montering. Korrekt arrangemang och orientering av hyaloid gel Cup är fortfarande viktigt för att säkerställa dess jämn tillplattning efter smältning och torkning.
Protokollet för att isolera hyaloid fartyg kan ändras ytterligare på flera sätt. Koncentrationen av gelatin lösning vi använde är 5%, men högre eller lägre koncentrationer kan också fungera, beroende på preferensen av forskaren för att uppnå en fastare eller mjukare konsistens för hantering. DAPI-färgning av cellulära kärnor kan också modifieras med isolectin-IB4 eller andra endotelceller eller makrofagmarkörer, för att bättre skilja vaskulära endotelcellerna från makrofager. Ett varningens ord: de plattmonterade hyaloida fartygen är mycket känsliga och endast löst på glid. Därför måste de hyaloid bilderna hanteras mycket försiktigt och försiktigt om sköljning behövs under färgning. Detta isolerings protokoll har också sina begränsningar, bland annat komplexiteten i att utföra fin dissektion och svårigheten att långsiktigt bevara proverna på grund av den ömtåliga vävnadens beskaffenhet. Icke desto mindre är isolera och Flat-montering hyaloid fartyg fortfarande det mest omfattande och intuitiva sättet att studera hyaloid vasculature, att främja okulär och angiogenes studier10,17,27, 29,30,31.
Den hyaloid kärlsystemet ger en utmärkt experimentell modell för att studera utveckling fartygs tillväxt och regression, relevant för forskningsområden i oftalmologi, angiogenes, och programmerad celldöd, med vilken detta papper syftar till att bistå. Framtida ändringar av isolerings protokollet kan inriktas på att förbättra genomförbarheten av ett tekniskt dissekeringsförfarande. Sammantaget är den kombinerade in vivo Imaging och ex vivo isolering av hyaloid fartyg en fördelaktig metod för att möjliggöra fullständig bedömning och karakterisering av hyaloid fartyg i möss som en användbar modell av vaskulär regression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) bidrag (R01 EY024963 och EY028100) till J.C. Z.W. stöddes av en Tempelherreorden Eye Foundation karriär starter Grant. Den hyaloid isolering förfarande som beskrivs i denna studie anpassades med modifiering från protokoll generöst delas av DRS. Richard Lang, Toshihide Kurihara, och Lois Smith, som författarna är tacksamma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
References
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Anand-Apte, B., Hollyfield, J. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. Besharse, J., Bok, D. , Academic Press. Oxford, UK. (2011).
- Hobbs, R. P., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. Hartnett, M. E. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. (2013).
- Fruttiger, M.
- Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
- Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
- Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
- Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
- Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
- Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
- Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
- Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
- Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).
- Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
- Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
- Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
- Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
- Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
- Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
- Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
- McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
- Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
- Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18 (2001).
- Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).
- Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
- Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
- Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).
